專(zhuān)利名稱：用于檢測(cè)飼料酶的試劑、方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域并更特定地涉及用于檢測(cè)蛋白和酶，特別是飼料酶的免疫檢測(cè)方法，包括ELISA和免疫檢測(cè)試紙(immunostrip)檢測(cè)法，試劑盒和試劑。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在十分需要方便、相對(duì)容易的用于檢測(cè)動(dòng)物飼料中酶的存在的檢測(cè)法。迄今，沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的免疫檢測(cè)法用于這種檢測(cè)。
對(duì)檢測(cè)植物是否已經(jīng)進(jìn)行了基因改良或者谷物或加工食品是否含有GMO特性也有巨大的需求。這種需要要求有能檢測(cè)和定量新穎的DNA或蛋白的測(cè)試方法。本發(fā)明滿足這種需要，提供用于檢測(cè)和定量飼料酶的免疫方法、試劑和試劑盒。
發(fā)明概述提供了用于檢測(cè)和測(cè)量樣品中的酶的方法、試劑盒和試劑。優(yōu)選地，受檢測(cè)的蛋白包括但不限于一種或多種肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶。蛋白可在不同微生物中產(chǎn)生，所述微生物包括但不限于大腸桿菌(Esherichiacoli)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyce pombe)和巴斯德畢赤氏酵母(Pichia Pastoris)，或在植物中產(chǎn)生，所述的植物包括但不限于例如玉米、小麥、水稻、油菜(canola)和苜蓿(alfalfa)。特別地，蛋白在飼料中或在含有編碼該蛋白的基因的基因改良植物中得以檢測(cè)。飼料是動(dòng)物飼料。動(dòng)物飼料可以用于單胃動(dòng)物或反芻動(dòng)物。飼料可以是漿狀飼料(mash feed)和/或丸狀飼料。
試劑包括純化過(guò)的蛋白和該蛋白特異性抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白是肌醇六磷酸酶。肌醇六磷酸酶蛋白可以從大腸桿菌包涵體中分離并施用至動(dòng)物以產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體。備選地，蛋白可從可溶細(xì)胞提取物如大腸桿菌細(xì)胞提取物中分離。
抗體對(duì)蛋白具有高度的敏感性和特異性并可用于免疫檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)在動(dòng)物中或在基因改良生物體中的酶活性蛋白。
方法是免疫檢測(cè)法，所述免疫檢測(cè)法采用這里描述的抗體并能檢測(cè)低濃度的蛋白。抗體經(jīng)過(guò)純化，因而最低限度地與樣品中出現(xiàn)的其它蛋白反應(yīng)。
將抗體和/或蛋白和用于檢測(cè)蛋白的常規(guī)免疫檢測(cè)試劑裝配在試劑盒內(nèi)。
提供了用于檢測(cè)和測(cè)量樣品中的蛋白的方法、試劑盒和試劑。要進(jìn)行檢測(cè)的蛋白包括一種或多種飼料酶，如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶。蛋白可從多種物種中產(chǎn)生，這些物種包括但不限于大腸桿菌、粟酒裂殖糖酵母和巴斯德畢赤氏酵母。特別地，肌醇六磷酸酶蛋白在動(dòng)物飼料中和在基因改良的表達(dá)目標(biāo)飼料酶基因如肌醇六磷酸酶基因的植物中檢測(cè)。
試劑可以包括抗原肽/蛋白和抗體?？乖?蛋白能與抗體發(fā)生免疫反應(yīng)?？乖?蛋白具有共同表位，所述共同表位是在不同物種中表達(dá)的蛋白共有的。分離或合成該肽/蛋白并施用至動(dòng)物以產(chǎn)生抗體。
對(duì)于肌醇六磷酸酶來(lái)說(shuō)，抗體對(duì)在不同物種中產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶具有高度的敏感性和交叉反應(yīng)性并因此可用于免疫檢測(cè)法來(lái)檢測(cè)受到改造而能表達(dá)肌醇六磷酸酶基因的基因改良生物體，特別是植物。
方法是采用在這里描述的抗體的免疫檢測(cè)法并能檢測(cè)動(dòng)物飼料中和基因改良的谷物樣品中的低濃度肌醇六磷酸酶蛋白。該抗體能與肌醇六磷酸酶基因表達(dá)的肌醇六磷酸酶上的表位或共同表位發(fā)生免疫反應(yīng)并最低限度地與樣品中出現(xiàn)的其它蛋白反應(yīng)，因而對(duì)樣品中如谷物樣品中的基因改良的生物體的存在提供精確的檢測(cè)。
將表位、抗體或兩者與傳統(tǒng)的免疫檢測(cè)試劑共同裝配于試劑盒內(nèi)用于檢測(cè)蛋白。試劑盒可任選地包含單克隆和多克隆抗體及用于檢測(cè)樣品中蛋白或飼料酶的存在的標(biāo)準(zhǔn)品。
從上而知，真的需要發(fā)展使得能鑒定樣品中的特異性蛋白或飼料酶的技術(shù)。
通過(guò)下面的詳述，本發(fā)明的其它目標(biāo)、特征和優(yōu)勢(shì)將變得顯而易見(jiàn)。然而應(yīng)該理解，盡管用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，詳述和特定實(shí)施例僅是以例證的方式給出，因?yàn)閺脑撛斒鰜?lái)看在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種改變和調(diào)整對(duì)那些本領(lǐng)域技術(shù)人員變得顯而易見(jiàn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示肌醇六磷酸酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線的曲線圖。
圖2是顯示在ELI SA和酶-活性檢測(cè)法中在99℃時(shí)肌醇六磷酸酶的百分比相對(duì)活性-孵育時(shí)間的圖。ELISA中的肌醇六磷酸酶的檢測(cè)與酶活性檢測(cè)法中檢測(cè)到的活性在量上一致。
圖3是免疫檢測(cè)試紙測(cè)試的掃描復(fù)制圖，顯示了在99℃孵育最多一小時(shí)后肌醇六磷酸酶的檢測(cè)值(箭頭)。在99℃時(shí)約20分鐘后可看見(jiàn)肌醇六磷酸酶的檢測(cè)值下降。
圖4是作為范例的免疫檢測(cè)法測(cè)試試劑盒和使用該試劑盒的方法。
公開(kāi)的實(shí)施方案詳述在這里描述了用于檢測(cè)樣品中的蛋白的方法、試劑盒和試劑。優(yōu)選地，蛋白是飼料酶，并且更優(yōu)選地，飼料酶包括但不限于肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶。
本發(fā)明方法學(xué)可用于檢測(cè)樣品中如動(dòng)物飼料中的任何酶。許多飼料酶為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。例如，許多肌醇六磷酸酶是已知的，這些肌醇六磷酸酶的檢測(cè)可用本發(fā)明完成。已知的肌醇六磷酸酶包括但不限于在題為“Recombinant Bacterial Phytases and Uses Thereof”的WO 01/90333中；在題為“Novel Phytase”的WO 99/08539；在題為“Microbially Expressed Thermotolerant Phytase For AnimalFeed”的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/333,672中和題為“ThermotolerantPhytase For Animal Feed”的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/334,671中所描述的，每個(gè)及每個(gè)的全部在這里通過(guò)全文引用作為參考。
當(dāng)進(jìn)行免疫檢測(cè)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物和由它們產(chǎn)生的產(chǎn)品(包括食物級(jí)分)中的蛋白時(shí)，測(cè)試具有能檢測(cè)來(lái)自不同基因的蛋白的能力是重要的。因而，交叉反應(yīng)抗體對(duì)發(fā)展成功的商業(yè)產(chǎn)品十分重要。
試劑是具有共同表位的抗原蛋白或肽及與從不同基因表達(dá)的蛋白能發(fā)生交叉反應(yīng)的抗蛋白抗體。本方法是用于靈敏、特異性檢測(cè)蛋白，尤其是用于檢測(cè)動(dòng)物飼料中和基因改良的植物中如農(nóng)產(chǎn)品中的蛋白的免疫檢測(cè)法。試劑盒含有如這里描述的抗蛋白抗體及其它試劑，特別是那些用于試紙條測(cè)試形式的那些試劑，以用于在下面更詳細(xì)描述的免疫檢測(cè)法。
抗原蛋白為了制備重組蛋白如肌醇六磷酸酶，轉(zhuǎn)染合適的宿主株并讓宿主株生長(zhǎng)到合適的細(xì)胞密度，例如，細(xì)菌、昆蟲(chóng)或酵母宿主，可將選擇的啟動(dòng)子通過(guò)適當(dāng)?shù)氖侄?例如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))進(jìn)行誘導(dǎo)并將細(xì)胞培養(yǎng)另外的一段時(shí)期產(chǎn)生重組酶。然后通過(guò)離心典型地收獲細(xì)胞，通過(guò)物理或化學(xué)手段破裂細(xì)胞，并將得到的粗提取物保留用于進(jìn)一步的純化。
用來(lái)表達(dá)蛋白的微生物細(xì)胞可通過(guò)任何便利的方法破裂，方法包括凍融循環(huán)(freeze-thaw cycling)、超聲處理、機(jī)械破碎或使用細(xì)胞裂解劑，這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。
通過(guò)一些方法可以將酶從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化，方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸萃取、陰離子或陽(yáng)離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、親和色譜、羥基磷灰石色譜和凝集素色譜。如有必要，可用蛋白重新折疊步驟來(lái)獲得成熟蛋白的結(jié)構(gòu)。最后，可將高效液相色譜(HPLC)用于最后的純化步驟。
抗原肽抗原肽可以是蛋白表面肽，這些肽在表達(dá)該蛋白的不同物種中具有相同表位，優(yōu)選地，所述的蛋白從不同的微生物中表達(dá)。
這些肽作為用于檢測(cè)和定量蛋白的診斷標(biāo)記是非常有用的。這些肽也用于產(chǎn)生抗體、測(cè)試和具有成功的商業(yè)產(chǎn)品必需的優(yōu)良靈敏性的試劑盒。
在一個(gè)實(shí)施方案中，肽可以從表達(dá)編碼蛋白的基因的細(xì)胞培養(yǎng)物中用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)如親和柱純化分離，或依照本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生肽的氨基酸序列并合成肽。
具有上面提出的特性的抗原肽可用于產(chǎn)生能與肌醇六磷酸酶發(fā)生反應(yīng)的單克隆或多克隆抗體。
抗體使用哺乳動(dòng)物，特別是兔、雞、小鼠或山羊產(chǎn)生本發(fā)明使用的抗體。接種的方案不是關(guān)鍵的并可以是任何一般用于本領(lǐng)域該目的的方案。這種方法步驟在例如Antibodies A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，1998，92-115頁(yè)中描述。
用于檢測(cè)肌醇六磷酸酶的優(yōu)選的抗體是通過(guò)免疫親和性純化的對(duì)抗大腸桿菌包涵體中產(chǎn)生的重組肌醇六磷酸酶的兔抗體、雞抗體和山羊抗體。為了檢測(cè)和定量肌醇六磷酸酶，優(yōu)選地直接用包括酶、放射性同位素和染色粒子如乳膠小珠或膠體金的標(biāo)記物標(biāo)記抗體。在另外的實(shí)施方案中，如通過(guò)與結(jié)合至抗體如二抗、蛋白A或蛋白G的被標(biāo)記的物質(zhì)反應(yīng)而間接標(biāo)記抗體。
多克隆抗體在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是多克隆抗體。用于制備多克隆抗體的方法為技術(shù)人員所知。可以例如通過(guò)一次或多次注射免疫劑，如果需要還包括佐劑，在動(dòng)物中引起多克隆抗體。通常，通過(guò)多次皮下或腹膜內(nèi)注射將免疫劑和/或佐劑注射至哺乳動(dòng)物中。免疫劑包括飼料酶或其融合蛋白。例如，該免疫劑是肌醇六磷酸酶多肽或其融合蛋白。在另一方法中，將免疫劑綴合至已知在受免疫的哺乳動(dòng)物中具有免疫原性的蛋白上。這種免疫原性的蛋白的實(shí)例包括但不限于鑰孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑。佐劑的實(shí)例包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷酰脂A、合成的trehalosedicorynomycolate)?？捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員選擇免疫方法而不需要過(guò)多的試驗(yàn)。優(yōu)選的抗體可高度靈敏地用于測(cè)定飼料酶，所述的飼料酶是例如但不限于肌醇六磷酸酶蛋白，例如在銷(xiāo)售渠道中大量商品糧樣品中相應(yīng)濃度的轉(zhuǎn)基因肌醇六磷酸酶蛋白。優(yōu)選地，該抗體能以約0.059ng/ml的高靈敏度檢測(cè)飼料酶如肌醇六磷酸酶。高靈敏性抗體可用于檢測(cè)基因改良的農(nóng)作物組織例如但不限于葉、莖、種子、稈莖、根等或源于這些農(nóng)作物的產(chǎn)品(例如食物級(jí)分)中的低濃度飼料酶如肌醇六磷酸酶蛋白。
單克隆抗體備選地，抗飼料酶抗體如抗肌醇六磷酸酶抗體是單克隆抗體。使用雜交瘤方法如由Kohler和Milstein，Nature，256495(1975)描述的那些方法制備單克隆抗體。在雜交瘤方法中，用免疫劑典型地免疫小鼠、倉(cāng)鼠或其它合適的宿主動(dòng)物來(lái)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞，所述的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或能產(chǎn)生特異性結(jié)合至免疫劑的抗體。備選地，可在體外誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞。
免疫劑一般包括所需的多肽或其融合蛋白。通常，如果期望得到人源細(xì)胞，可使用外周血液淋巴細(xì)胞(“PBLs”)，或者如果期望得到非人哺乳動(dòng)物源的細(xì)胞，可使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。然后用合適的融合劑如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與永生化細(xì)胞系融合來(lái)形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press，(1986)59-103頁(yè))。永生化細(xì)胞系一般是受轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是嚙齒動(dòng)物、牛和人源性的骨髓癌細(xì)胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓癌細(xì)胞系。將雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述的培養(yǎng)基含有一種或多種抑制非融合的永生化細(xì)胞的生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親本細(xì)胞缺少次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，用于雜交瘤的培養(yǎng)基一般包括次黃嘌呤、氨蝶呤和胸腺嘧啶(“HAT培養(yǎng)基”)，這些物質(zhì)抑制HGPRT-缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。
優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是能有效融合、支持由選擇的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞穩(wěn)定而高水平的表達(dá)抗體以及對(duì)培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基靈敏的那些細(xì)胞系。更優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是鼠科骨髓癌細(xì)胞系，該細(xì)胞系能例如從Salk Institute Cell Distribution Center，圣地亞哥，加利福尼亞州和美國(guó)典型微生物保藏中心(American Type CultureCollection)，馬納薩斯，弗吉尼亞州(Manassas，Va)獲得。人骨髓癌和小鼠-人雜交骨髓癌細(xì)胞系也在人單克隆抗體的產(chǎn)生中得以描述(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications，MarcelDekker，Inc.，紐約，1987，51-63頁(yè))。
然后檢測(cè)培養(yǎng)雜交瘤的培養(yǎng)基中針對(duì)PRO的單克隆抗體的存在。優(yōu)選地，通過(guò)免疫沉淀法或通過(guò)體外結(jié)合檢測(cè)法如放射免疫檢測(cè)法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(ELISA)檢測(cè)由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克抗體的結(jié)合特異性。這些技術(shù)和檢測(cè)法為本領(lǐng)域已知。單克隆抗體的結(jié)合親和性可以例如通過(guò)Munson和Pollard，Anal.Biochem.，107220(1980)描述的斯卡查德分析測(cè)定。
目標(biāo)雜交瘤細(xì)胞鑒定后，通過(guò)有限稀釋方法將該克隆亞克隆并將其通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(Goding，同上)生長(zhǎng)。用于該目的的合適培養(yǎng)基包括例如Dulbecco′s Modified Eagle′s培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基。備選地，將雜交瘤細(xì)胞在哺乳動(dòng)物中在體內(nèi)以腹水的形式生長(zhǎng)。通過(guò)常規(guī)的免疫球蛋白純化方法例如蛋白A-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析或親和色譜將由亞克隆分泌的單克隆抗體從培養(yǎng)基或腹水液體中分離或純化。
也可通過(guò)重組DNA方法產(chǎn)生單克隆抗體，例如用在美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567中描述的那些方法。用傳統(tǒng)的方法(如通過(guò)用能特異性結(jié)合至編碼鼠科抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)很容易地分離編碼本發(fā)明的單克隆抗體的DNA并測(cè)序。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞作為這種DNA的優(yōu)選來(lái)源。一旦分離，將DNA放入表達(dá)載體，隨后將所述載體轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞如猿COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓癌細(xì)胞中來(lái)在重組宿主細(xì)胞中完成單克隆抗體的合成，其中所述的宿主細(xì)胞不能產(chǎn)生另外的免疫球蛋白。DNA也受到修飾，如通過(guò)用人重鏈或輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域編碼序列取代同源的鼠科序列(如美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567；Morrison等，同上)，或通過(guò)將編碼免疫球蛋白的序列共價(jià)地結(jié)合至非免疫球蛋白多肽的編碼序列的全部或部分上。將這種非免疫球蛋白多肽取代本發(fā)明抗體的恒定結(jié)構(gòu)域或取代本發(fā)明抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變結(jié)構(gòu)域來(lái)產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是單價(jià)抗體。用于制備單價(jià)抗體的方法為本領(lǐng)域熟知。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和修飾過(guò)的重鏈的重組表達(dá)。一般在Fc區(qū)的任何位點(diǎn)將重鏈截短以便抑制重鏈交聯(lián)。備選地，用其它的氨基酸殘基取代相應(yīng)的半胱氨酸或?qū)⑵鋭h除以便阻止交聯(lián)。體外方法也適合制備單價(jià)抗體。消化抗體產(chǎn)生片段，特別是Fab片段，可使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)來(lái)完成。
本領(lǐng)域已知的其它方法包括Keamey等，J.Immunol.1231548-1558(1979)描述的方法，通過(guò)引用這些方法作為參考。簡(jiǎn)要地，用佐劑中的免疫原接種動(dòng)物如小鼠或兔，并收集脾細(xì)胞及將其與骨髓癌細(xì)胞系混合。通過(guò)加入聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合。通過(guò)將細(xì)胞涂布于含有次黃嘌呤、氨蝶呤和胸腺嘧啶(HAT)的選擇培養(yǎng)基中化學(xué)選擇雜交瘤。接著根據(jù)產(chǎn)生抗肌醇六磷酸酶單克隆抗體的能力篩選雜交瘤。將產(chǎn)生抗體的雜交瘤克隆、擴(kuò)展并冷凍儲(chǔ)存以用于后面的生產(chǎn)。
在另外的實(shí)施方案中，將抗體直接用可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記以鑒定和定量飼料酶特別是肌醇六磷酸酶蛋白。用于免疫檢測(cè)法的標(biāo)記物通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知并包括但不限于酶、放射性同位素和熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)以及包括染色粒子如膠體金和乳膠小珠的生色物質(zhì)。
備選地，通過(guò)與具有免疫球蛋白親和性的被標(biāo)記物質(zhì)如蛋白A或G或二抗反應(yīng)而間接標(biāo)記抗體。將抗體與第二種物質(zhì)結(jié)合并用具有對(duì)結(jié)合至抗體上的第二種物質(zhì)有親和性的受標(biāo)記的第三種物質(zhì)測(cè)定。例如，將抗體結(jié)合至生物素上并用受標(biāo)記的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素(strepavidin)檢測(cè)抗體-生物素綴合物。
在另外的實(shí)施方案中，將抗體結(jié)合至半抗原并用受標(biāo)記的抗半抗原抗體檢測(cè)抗體-半抗原綴合物。標(biāo)記抗體和檢測(cè)綴合物的這些及其它方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。
可通過(guò)用飼料酶特別是上面描述的肌醇六磷酸酶免疫動(dòng)物，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法從生物液體中分離與蛋白反應(yīng)的抗體，并將其收集和純化，從而產(chǎn)生具有對(duì)飼料酶蛋白有相似或較高靈敏性的抗飼料酶特別是抗肌醇六磷酸酶的單克隆或多克隆抗體。
免疫檢測(cè)法將抗體和常規(guī)的免疫檢測(cè)試劑一起裝配在試劑盒內(nèi)以使得用下面描述的免疫檢測(cè)法用于檢測(cè)理想的飼料酶或蛋白。試劑盒可任選地包含單克隆和多克隆抗體及用于檢測(cè)樣品中酶的存在的標(biāo)準(zhǔn)品。含有這些試劑的試劑盒提供對(duì)蛋白簡(jiǎn)單、快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
將上面描述的抗體作為許多不同免疫檢測(cè)法的基本試劑來(lái)檢測(cè)樣品中的飼料酶的存在。將抗體用于任何類(lèi)型的免疫檢測(cè)法，不管是定性或定量的免疫檢測(cè)法。
在典型的定量夾心檢測(cè)法中，有三個(gè)基本的部分。例如，在這種用于飼料酶如肌醇六磷酸酶的檢測(cè)法中，用一抗將在基因改良的植物提取物或飼料提取物中如雞飼料中的肌醇六磷酸酶蛋白捕獲至固相中。在一個(gè)實(shí)施方案中，一抗是兔的抗飼料酶抗體。然后在一抗、飼料酶蛋白和已經(jīng)加入孔中的二抗之間形成“三明治”。在一實(shí)施方案中，二抗是山羊的抗飼料酶抗體。在洗滌步驟將未結(jié)合的二抗除去后，用受標(biāo)記的抗體檢測(cè)結(jié)合的二抗。在特定的實(shí)施方案中，檢測(cè)抗體是堿性磷酸酶標(biāo)記的驢抗山羊抗體。加入檢測(cè)酶即堿性磷酸酶的底物并通過(guò)讀取每個(gè)孔的吸光率來(lái)測(cè)量顏色的產(chǎn)生。使用四參數(shù)曲線擬合來(lái)畫(huà)出濃度對(duì)吸收率的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于檢測(cè)飼料酶的免疫檢測(cè)法包括以下步驟a)制備樣品提取物；b)將一部分提取物和與飼料酶結(jié)合的抗飼料酶一抗以及與和飼料酶結(jié)合的抗飼料酶二抗孵育來(lái)產(chǎn)生抗體-聚合體-抗體復(fù)合物，其中所述的一抗結(jié)合至固體載體上，c)洗滌抗體-聚合物-抗體復(fù)合物以除去未結(jié)合的二抗。
d)加入能與二抗發(fā)生免疫反應(yīng)的檢測(cè)抗體，其中檢測(cè)抗體受到標(biāo)記；并e)測(cè)量結(jié)合的或未結(jié)合的受標(biāo)記的抗體的量來(lái)檢測(cè)流體中水處理聚合物的濃度。
在特定的實(shí)施方案中，飼料酶是肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶和/或蛋白酶蛋白。在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，肌醇六磷酸酶是熱穩(wěn)定性肌醇六磷酸酶。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可檢測(cè)標(biāo)記物是酶。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶或β-半乳糖苷酶。
在另一實(shí)施方案中，酶產(chǎn)生不可溶的反應(yīng)產(chǎn)物。
本發(fā)明也提供用于通過(guò)免疫檢測(cè)方法檢測(cè)和定量的試劑盒，試劑盒包括a)用于從樣品中提取飼料酶的手段；b)含有結(jié)合至固體支持物上的抗飼料酶一抗的固體支持物；c)抗飼料酶二抗；和d)能免疫性結(jié)合至二抗的檢測(cè)抗體，其中檢測(cè)抗體用檢測(cè)手段標(biāo)記。
在一特定的實(shí)施方案中，檢測(cè)手段是酶。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，檢測(cè)酶是堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶或β-半乳糖苷酶。
在另一實(shí)施方案中，酶產(chǎn)生可溶或不可溶的反應(yīng)產(chǎn)物。
在另一實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包含酶的底物。
這種免疫檢測(cè)法也指酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(ELISA)。
上面描述的抗體也可在用于檢測(cè)飼料酶如肌醇六磷酸酶的定性免疫檢測(cè)法中采用。一種這類(lèi)檢測(cè)法通常指免疫檢測(cè)試紙。用膜和過(guò)濾材料(filter)制成免疫檢測(cè)試紙，并且借助它能通過(guò)毛細(xì)作用吸住液體樣品。當(dāng)樣品沿著試紙條移動(dòng)時(shí)，樣品中的肌醇六磷酸酶與含在免疫檢測(cè)試紙中的抗體發(fā)生反應(yīng)。要檢測(cè)雞飼料中的肌醇六磷酸酶蛋白，用緩沖液洗滌飼料，與固體物質(zhì)分離并加至免疫檢測(cè)試紙上。當(dāng)液體樣品流到免疫檢測(cè)試紙的另一端時(shí)，肌醇六磷酸酶與特定的抗體反應(yīng)并俘獲于一條線上，這條線變得可見(jiàn)。檢測(cè)測(cè)試線上的信號(hào)表明肌醇六磷酸酶存在于樣品中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)樣品中飼料酶的免疫檢測(cè)法，方法包括以下的步驟a)在存在能免疫識(shí)別提取物中的飼料酶的一抗下制備樣品提取物，這樣可形成一抗-飼料酶復(fù)合物；b)制備具有顯著三維尺寸的固相形式，以形成具有多個(gè)縫隙空間的顯著體積，其上結(jié)合有能夠免疫識(shí)別飼料酶的所需的二抗，其中所述二抗與檢測(cè)手段綴合，并且其中所述二抗也免疫識(shí)別所述飼料酶。
d)將步驟(a)的提取物和步驟(b)制備的固相形式混合，由此提取物流過(guò)制備的固相形式的縫隙空間，捕獲一抗-飼料酶復(fù)合物；e)通過(guò)所述的捕獲的一抗-飼料酶復(fù)合物的存在來(lái)檢測(cè)飼料酶。
在其它實(shí)施方案中，飼料酶是肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶和/或蛋白酶蛋白。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，肌醇六磷酸酶是熱穩(wěn)定性肌醇六磷酸酶。
在其它的實(shí)施方案中，固相形式是醋酸纖維素、纖維素、硝化纖維素或尼龍。在另一實(shí)施方案中，固相形式是由多個(gè)層疊和連續(xù)的層組成，其中每層能捕獲不同的飼料酶。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，固相支持物進(jìn)一步包括固相形式的樣品吸收層。在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫檢測(cè)法進(jìn)一步包含試紙，所述試紙包含標(biāo)記的抗飼料酶抗體。
在一特定的實(shí)施方案中，檢測(cè)手段是膠體金。
提供了采用上面描述的抗體的高度靈敏的免疫檢測(cè)法。該檢測(cè)法可用于檢測(cè)基因改良的生物體，所述的生物體已經(jīng)受到改造而包含編碼飼料酶或蛋白的基因如肌醇六磷酸酶基因。該免疫檢測(cè)法能檢測(cè)樣品中如動(dòng)物飼料和基因改良農(nóng)作物樣品中低濃度的蛋白。
如上面描述，用于免疫檢測(cè)法中的抗體能與由不同微生物表達(dá)的飼料酶特別是肌醇六磷酸酶蛋白上的表位或共同表位發(fā)生免疫反應(yīng)，并且與可能出現(xiàn)在樣品中的其它蛋白最低程度地反應(yīng)，因此可對(duì)樣品中如谷類(lèi)樣品中基因改造過(guò)的有機(jī)體的存在提供精確的檢測(cè)。
該檢測(cè)法可用于檢測(cè)不同樣品包括動(dòng)物飼料和農(nóng)作物樣品如植物材料中目標(biāo)飼料酶蛋白如肌醇六磷酸酶的存在或量。樣品可獲自任何來(lái)源，其中目標(biāo)蛋白可以接觸到抗體。例如，樣品可以是任何植物組織或提取物，包括根、莖、秸桿(stalk)、葉或種子或源于這些農(nóng)作物的產(chǎn)品如食物級(jí)分。
上面描述的一種或多種抗體可用于任何非均質(zhì)的或均質(zhì)的、夾心的或競(jìng)爭(zhēng)性的免疫檢測(cè)法來(lái)檢測(cè)飼料酶特別是例如肌醇六磷酸酶蛋白。將抗體用可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記或?qū)⒖贵w結(jié)合至固相上。用于將抗體結(jié)合至固相上的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。根據(jù)免疫檢測(cè)方法，將含有飼料酶的樣品與抗體在促進(jìn)抗體結(jié)合至樣品中的肌醇六磷酸酶的條件下反應(yīng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解免疫檢測(cè)試劑與樣品可以以不同的組合和順序反應(yīng)。采用物理手段將結(jié)合至固相上的試劑與未結(jié)合的試劑分離開(kāi)，如微粒過(guò)濾、將反應(yīng)溶液從包被的管和孔中傾出、磁分離、毛細(xì)作用及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。也應(yīng)該理解方法中可以包括獨(dú)立地洗滌固相。
通過(guò)將樣品產(chǎn)生的顏色強(qiáng)度與色卡比較或通過(guò)使用反射計(jì)來(lái)測(cè)定樣品中飼料酶蛋白如肌醇六磷酸酶的濃度。
將得到的反應(yīng)混合物或抗體和樣品的組合物制備于溶液中，該溶液優(yōu)化了抗體-飼料酶結(jié)合動(dòng)力學(xué)。合適的溶液是含水溶液或緩沖液。溶液優(yōu)選地在一些條件下提供，所述的條件將促進(jìn)特異性結(jié)合，使非特異性結(jié)合最小化，溶解飼料酶，穩(wěn)定和保持試劑反應(yīng)性，并且溶液可包含緩沖液、去垢劑、溶劑、鹽、螯合劑、蛋白、聚合物、碳水化合物、糖和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它物質(zhì)。
將反應(yīng)混合物反應(yīng)足夠長(zhǎng)時(shí)間以使得抗體能反應(yīng)并結(jié)合至飼料酶上形成抗體-飼料酶復(fù)合物。導(dǎo)致結(jié)合的最短反應(yīng)時(shí)間是理想的，以使得完成檢測(cè)需要的時(shí)間最少。用于免疫檢測(cè)試紙測(cè)試的合適的反應(yīng)時(shí)間少于或等于10分鐘或在約一分鐘到10分鐘之間。優(yōu)選少于5分鐘的反應(yīng)時(shí)間。最優(yōu)選地，反應(yīng)時(shí)間少于三分鐘。通過(guò)優(yōu)化試劑，當(dāng)混合試劑時(shí)結(jié)合基本完成。
可以在試劑不會(huì)分解或失活的任意溫度下進(jìn)行反應(yīng)。在約18℃和30℃之間的溫度是優(yōu)選的，最優(yōu)選的反應(yīng)溫度是環(huán)境溫度或室溫(約22℃)。
固相形式如免疫測(cè)試試紙是理想地適合這種免疫檢測(cè)法的。測(cè)試試紙條由多種有孔的組分、膜和過(guò)濾材料組成，所述的試紙條可通過(guò)毛細(xì)作用吸住液體樣品。當(dāng)樣品中的飼料酶經(jīng)過(guò)試紙條時(shí)與含于測(cè)試試紙條內(nèi)的檢測(cè)試劑發(fā)生反應(yīng)。為了檢測(cè)谷物或種子中的蛋白，將谷物碾碎成粉末并將蛋白用液體從粉末中提取出來(lái)，然后將該液體與固體材料分離并用檢測(cè)法檢測(cè)。將液體施用到免疫檢測(cè)試紙條上，飼料酶朝試紙條的遠(yuǎn)末端移動(dòng)。當(dāng)它沿著試紙條移動(dòng)時(shí)，飼料酶與施加于或固定于試紙上的試劑發(fā)生反應(yīng)而引起可檢測(cè)的信號(hào)產(chǎn)物。信號(hào)的檢測(cè)表明在樣品中存在飼料酶。
在一實(shí)施方案中，固相形式是醋酸纖維素、纖維素、硝化纖維素或尼龍。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，固相形式是硝化纖維素。
在另一實(shí)施方案中，固相形式包含樣品吸收層、硝化纖維素條和含有標(biāo)記的抗-飼料酶抗體的底層。
然而在另一實(shí)施方案中，固相形式是由多個(gè)堆疊和連續(xù)的層組成，其中每層能捕獲不同的飼料酶。
免疫檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)樣品中的飼料酶的免疫檢測(cè)試劑盒含有一種或多種上面描述的抗體。試劑盒可以額外地包含獲得樣品的裝置、容納試劑的容器、定時(shí)裝置、用于稀釋樣品的緩沖液和比色計(jì)、反射計(jì)或標(biāo)準(zhǔn)物，其中對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物可測(cè)量顏色的變化。試劑盒可包含如上描述的免疫檢測(cè)試紙形式的試劑。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，包括抗體的試劑是干燥的。將含水的樣品加至小瓶或試紙條導(dǎo)致干的試劑溶解，使得試劑發(fā)生反應(yīng)。
通過(guò)參考下面的非限制性實(shí)施例，將會(huì)進(jìn)一步了解上面描述的試劑、免疫檢測(cè)方法和試劑盒。下面的實(shí)施例顯示了可用于檢測(cè)樣品如飼料或其它植物材料中的飼料酶特別是肌醇六磷酸酶的典型的試驗(yàn)方法和試劑。以舉例說(shuō)明的方式而不是以限定的方式提供這種實(shí)施例。
上面引用的參考在這里全文引用作為參考。
實(shí)施例這些方法和材料描述了用于制備玉米樣品和生產(chǎn)用于下面描述的實(shí)施例中的單克隆抗體的一般方法。
材料和方法玉米樣品玉米提取物源于Hi II種子或A188種子(非轉(zhuǎn)基因)或基因改造的肌醇六磷酸酶種子。使用Kleco組織研磨器將五顆玉米粒研磨成粉。將得到的玉米粉末懸浮于5ml蒸餾水中溶解蛋白。在ELISA中或用免疫檢測(cè)試紙條檢測(cè)上清液。
多克隆抗體的產(chǎn)生對(duì)于免疫在初次的注射后，28天后將動(dòng)物(兔或山羊)加強(qiáng)免疫。在這之后的每次強(qiáng)化是每21天進(jìn)行。在每次強(qiáng)化后10天將動(dòng)物放血。
對(duì)于雞，第一次強(qiáng)化免疫是初次注射后7天，隨后每28天強(qiáng)化一次。每次強(qiáng)化后10天將雞放血，如果檢測(cè)到好的抗體滴定度，收集強(qiáng)化接種后產(chǎn)的蛋。
免疫劑是從大腸桿菌表達(dá)體系純化來(lái)的完整的肌醇六磷酸酶蛋白。對(duì)于第一次注射入動(dòng)物中，將蛋白在弗氏完全佐劑中乳化。增強(qiáng)免疫劑是在弗氏不完全佐劑中。用于產(chǎn)生多克隆抗體的動(dòng)物是兔、雞和山羊。
肌醇六磷酸酶(Nov9X)純化與10％山梨醇、10％NaCl和pH 4.2一起配制的肌醇六磷酸酶(Nov9X)用SnakeSkin 10K MWCO透析管(Pierce，Rockford，IL)用25mM Tris-HCl，pH 8.0于4℃透析過(guò)夜。透析后將固體(NH4)2SO4加至肌醇六磷酸酶混合物中，最初達(dá)到0℃下的25％的飽和度，然后達(dá)到50％的飽和度并最后達(dá)到75％的飽和度。當(dāng)加入(NH4)2SO4至25％的飽和度時(shí)將混合物在0℃下攪拌30分鐘，然后以20,000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘。對(duì)于傾出的上清液，加入(NH4)2SO4至50％的飽和度而將沉淀物再懸浮于25mM Tris-HCl，pH 9.0中。將該步驟進(jìn)行3次以產(chǎn)生0-25％、25-50％和50-75％飽和度的Nov9X(NH4)2SO4沉淀顆粒。SDS-PAGE分析表明在50-75％的級(jí)分中存在Nov9X。將該級(jí)分用25mM Tris-HCl，pH 9.0透析并制備用于柱層析純化。
用5.0mL/min的流速將來(lái)自50-75％(NH4)2SO4級(jí)分的粗Nov9X TAM上樣至HiTrapQ陰離子交換柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。將在30分鐘產(chǎn)生的25mM Tris-HCl，pH 9.0中0-0.4M NaCl的線性梯度用來(lái)洗脫Nov9X。在280nm進(jìn)行吸光率測(cè)量以監(jiān)控層析。SDS-PAGE分析后匯集最純的含有Nov9X的級(jí)分，用Centricon Plus-20離心濃縮機(jī)(Millipore，Bedford，MA)濃縮，并以1mL/min的流速將其上樣至26/60Sephacryl S100型大小排阻層析柱上。洗脫緩沖液是25mM Tris-HCl，pH 9.0。收集含有純Nov9X的級(jí)分，將其濃縮，用25mM Tris-HCl，pH 8.0透析并用于下面的分析。
實(shí)施例1肌醇六磷酸酶ELISA該實(shí)施例描述了用ELISA免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)和定量測(cè)量玉米樣品中的肌醇六磷酸酶。
步驟將多孔板(Nunc，Maxisorp)使用用硼酸鹽緩沖液pH 8.5(50mM硼酸鈉/硼酸，75mM NaCl)稀釋的2μg/ml濃度的兔抗肌醇六磷酸酶抗體于4℃包被過(guò)夜，用Tris堿緩沖液pH 8.0(10mM含有0.05％Tween-20和0.03％疊氮化鈉的Tris)(洗滌緩沖液)洗滌板五次。注意在每次孵育期后進(jìn)行同樣的洗滌步驟來(lái)除去未結(jié)合的抗體/樣品。然后用PBS/tween-20/BSA緩沖液pH7.4(1％的牛血清白蛋白、0.05％的Tween-20、0.03％的疊氮化鈉、150mM NaCl，于100mM磷酸鈉，pH 7.4中(稀釋液))室溫下將板封閉45分鐘。將50微升的每個(gè)樣品加至板中并室溫下孵育1.5小時(shí)。然后將山羊抗-肌醇六磷酸酶抗體(在稀釋液中稀釋至2μg/ml)加至板中并于37℃孵育1小時(shí)。將檢測(cè)抗體(堿性磷酸酶標(biāo)記的驢抗-山羊抗體，其在稀釋液中稀釋至1μg/ml)加至板中于37℃下孵育1小時(shí)。加入底物即對(duì)硝基苯磷酸鹽(pNPP)并讓其在室溫下反應(yīng)30分鐘。用492nm作為參考，于405nm下測(cè)量吸光率。
檢測(cè)法特性肌醇六磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)曲線是4-參數(shù)曲線擬合曲線(見(jiàn)圖1)。對(duì)于0.04-16ng/ml的范圍畫(huà)出其相對(duì)的l og值的線性曲線。為了畫(huà)出logX軸上的4-參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，0ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)必須以0.01ng/ml輸進(jìn)分析程序而不是0ng/ml。雖然任何四參數(shù)曲線擬合程序都可以，使用的分析程序是Tecan SunriseTM微量滴定板讀數(shù)器的WinSelectTM軟件。
最小可測(cè)定劑量(MDD)是在統(tǒng)計(jì)上可與零標(biāo)準(zhǔn)區(qū)別的肌醇六磷酸酶蛋白的最低水平。最低可檢測(cè)劑量通過(guò)24次重復(fù)分析陰性對(duì)照的1mg/ml全部蛋白的玉米種子提取物而得以測(cè)定。給平均值加上零標(biāo)準(zhǔn)平均值O.D.的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(95％置信界限)，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定該總O.D.值的劑量。最小可測(cè)定劑量是0.044ng/ml。
通過(guò)在21個(gè)不同的檢測(cè)試驗(yàn)中檢測(cè)4個(gè)不同的對(duì)照樣品測(cè)定批間精密度。樣品是摻入ELISA稀釋液中的純化的肌醇六磷酸酶。結(jié)果在下面表1中給出。對(duì)于在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分測(cè)量的樣品濃度，精密度好，少于15％。
表1.批間(Between-run)精密度測(cè)試。
通過(guò)重復(fù)檢測(cè)20-24次下面的樣品測(cè)定批內(nèi)精密度。樣品是摻入ELISA稀釋液中的肌醇六磷酸酶。結(jié)果在下面的表2中列出。全部樣品得到很好的精密度，表明進(jìn)行的單個(gè)檢測(cè)內(nèi)有很好的可重復(fù)性。
表2.批內(nèi)(within-run)精密度測(cè)試。
用ELISA稀釋液稀釋4份玉米種子提取物以測(cè)試檢測(cè)的線性。玉米提取物源于Hi II種子或A188種子(非轉(zhuǎn)基因)或基因改造的肌醇六磷酸酶種子。使用Kleco組織研磨器將五顆玉米粒研磨成粉。將得到的玉米粉末懸浮于5ml蒸餾水中以溶解蛋白。在ELISA中或用檢測(cè)試紙條檢測(cè)上清液。從稀釋的樣品中回收肌醇六磷酸酶的百分比是可以接受的。
表3檢測(cè)測(cè)試的線性
實(shí)施例2肌醇六磷酸酶免疫檢測(cè)試紙條該實(shí)施例描述使用免疫檢測(cè)試紙條檢測(cè)法來(lái)檢測(cè)樣品中肌醇六磷酸酶的存在。
方法通過(guò)將飼料加至50ml的離心分離機(jī)直到15ml刻度而制備漿狀雞飼料的提取物。將這些量的飼料加至提取袋內(nèi)的網(wǎng)格的一邊。加入提取緩沖液(25ml含有0.5％Tween-20的0.1M硼酸鹽pH 7.5)并且將緩沖液輕輕壓過(guò)飼料來(lái)確保所有的飼料都是濕的。在施加3-5滴提取物至免疫檢測(cè)試紙條用于檢測(cè)之前，將提取物室溫下孵育至少10分鐘。
免疫檢測(cè)試紙條簡(jiǎn)要地，側(cè)流免疫檢測(cè)試紙條包含由一塑料襯層(AristaTM牌塑料盒，Bethlehem，PA)支持的硝化纖維素檢測(cè)膜(2.5×18cm)，其中噴涂了1mm線的特異性兔(也可以使用雞抗體)抗肌醇六磷酸酶多克隆抗體。在第一條抗體線上也平行的噴涂了驢抗-山羊抗體的試劑對(duì)照線。硝化纖維素試紙條的底端部分用一片處理過(guò)的聚酯試紙條再蓋一層。先用溶液B(0.5％BSA、0.5％聚乙烯醇和0.1％Triton X-100；50mM磷酸緩沖液pH 7.4)和結(jié)合在山羊抗-肌醇六磷酸酶抗體的膠體金處理聚酯試紙條。讓聚酯試紙條變干。然后用棉質(zhì)樣品施加層在聚酯試紙條上再附一層。也將樣品施用層用溶液C(0.1！Triton X-100和0.1M硼酸緩沖液pH 8.5)進(jìn)行預(yù)處理并讓其干燥。在硝化纖維素試紙條另一端或頂端側(cè)面的是另一棉質(zhì)層，其用以在樣品流過(guò)硝化纖維素上的檢測(cè)抗體區(qū)和對(duì)照抗體區(qū)時(shí)吸收樣品溶液。然后將完成的紙片切成4mm的檢測(cè)試紙條使其適合裝入塑料盒中，塑料盒具有一個(gè)位于樣品層上面的橢圓形樣品施加孔并且位于硝化纖維素膜檢測(cè)區(qū)上有一矩形窗口。
通過(guò)加入150μl(3-5滴)提取物至樣品孔中進(jìn)行檢測(cè)。等待約5-10分鐘后，結(jié)果出現(xiàn)在結(jié)果窗口。如果樣品中存在肌醇六磷酸酶，結(jié)果窗口中會(huì)出現(xiàn)兩條紅線。較低的線表示肌醇六磷酸酶的存在而上面的線是對(duì)照線，其表示設(shè)備正常運(yùn)行。如果不存在肌醇六磷酸酶，就僅有一條單一的紅色對(duì)照線出現(xiàn)在結(jié)果窗口。見(jiàn)顯示樣品免疫檢測(cè)試紙條的圖3和圖4。圖3顯示檢測(cè)肌醇六磷酸酶的存在。如箭頭表示，20分鐘后檢測(cè)到的肌醇六磷酸酶開(kāi)始下降，因?yàn)檫@時(shí)肌醇六磷酸酶開(kāi)始喪失活性。
免疫檢測(cè)試紙條的詳細(xì)制備步驟。
肌醇六磷酸酶第二代檢測(cè)試紙條-膜的包被材料1.紙片，2.25英寸×180mm，有AE100膜2.PBS中1.0mg/ml的雞抗肌醇六磷酸酶IAP3.PBS中0.15mg/ml的Jackson驢抗-山羊抗體4.Pierce RBS去垢劑步驟包被檢測(cè)線1.通過(guò)按vol，18，回車(chē)、回車(chē)，將CamagTM噴霧器體積設(shè)定為18(1μl/cm)。
2.通過(guò)按track，1，回車(chē)、回車(chē)，將通道設(shè)定為1。
3.將卡片置于平臺(tái)上。將卡片有2張紙片的部分放置在最靠近儀器的前面的位置。用磁鐵穩(wěn)定卡片。
4.將注射器裝滿1.0mg/ml的雞抗-肌醇六磷酸酶IAP。
5.在30mm處設(shè)定噴物頭。
6.打開(kāi)氣體供應(yīng)并通過(guò)按gas、calc、run鍵開(kāi)始進(jìn)行噴霧。很近的觀察噴霧模式以保證噴霧的連貫性和精確性。
7.對(duì)每張其它的卡重復(fù)進(jìn)行3-6步驟。
8.移開(kāi)注射器并用Pierce RBS去垢劑(20μl濃縮液/ml dH2O)洗滌5次，然后用dH2O洗滌10次。
包被對(duì)照線9.通過(guò)按vol，18，回車(chē)、回車(chē)，將Camag體積設(shè)定為18(1μl/cm)。
10.通過(guò)按track、1，回車(chē)，回車(chē)，將通道設(shè)定為1。
11.將注射器裝滿0.15mg/ml的驢抗-抗山羊抗體。
12.在36mm處設(shè)定噴霧頭。
13.打開(kāi)氣體供應(yīng)并通過(guò)按gas、calc、run鍵開(kāi)始進(jìn)行噴霧。很近的觀察噴霧模式來(lái)保證噴霧的連貫性和精確性。
14.對(duì)每張其它的卡重復(fù)進(jìn)行11-13步驟。
15.移開(kāi)注射器并用Pierce RBS去垢劑(20μl濃縮液/ml dH2O)洗滌5次，然后用dH2O洗滌10次。
16.于33℃將卡干燥過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)為室溫。
17.室溫下干燥儲(chǔ)存。
肌醇六磷酸酶檢測(cè)試紙條-包被綴合物至聚酯上材料1.金綴合的山羊抗-NOV9X，OD＝502.聚酯片，2033級(jí)，用溶液B處理3.蔗糖4.海藻糖5.Pierce RBS去垢劑步驟18.用金稀釋液稀釋金綴合物至OD＝5019.將20％蔗糖和5％海藻糖加至金綴合物來(lái)使其穩(wěn)定(每1ml金綴合物加入0.2g蔗糖和50mg海藻糖)?；旌现敝镣耆芙?。
20.通過(guò)按vol，27，回車(chē)、回車(chē)，將CamagTM體積設(shè)定為27(1.5μl/cm)。
21.通過(guò)按track，1，回車(chē)、回車(chē)，設(shè)定通道。
22.將聚酯片置于平臺(tái)上并用磁鐵穩(wěn)定。
23.將注射器裝滿穩(wěn)定的金綴合的山羊抗-NOV9X(OD＝50)。
24.在15mm處設(shè)定噴霧頭。
25.打開(kāi)氣體供應(yīng)并通過(guò)按gas、calc、run鍵開(kāi)始進(jìn)行噴霧。很近的觀察噴霧模式來(lái)保證噴霧的一致性和精確性。
26.將噴霧頭移動(dòng)9mm(設(shè)定值為24mm)。
27.打開(kāi)氣體供應(yīng)并通過(guò)按gas、calc、run鍵開(kāi)始進(jìn)行噴霧。
28.繼續(xù)噴涂綴合物，每次噴涂移動(dòng)9mm，直到整個(gè)聚酯片充滿。一片聚酯片將有八條線。
29.在37℃下干燥1小時(shí)。
30.切成1/4″的試紙條，這樣使得金綴合物線處于每條試紙的頂端。
31.室溫下干燥儲(chǔ)存清潔儀器移開(kāi)注射器并用Pierce RBS去垢劑(20μl濃縮液/ml dH2O)洗滌5次，然后用dH2O洗滌10次。
用dH2O清洗儀器平臺(tái)。
肌醇六磷酸酶試紙條-組裝材料6.用1.0mg/ml和1μl/cm的雞抗肌醇六磷酸酶IAP包被的卡片。
7.5/8”×180mm大小的#40吸水紙的試紙條(頂層)8.用溶液C，pH 8.6處理的3/4″×180mm大小的#903吸水紙的試紙條(底層)。
9.噴涂金綴合物(1.5μl/cm的山羊抗-NOV9X，OD＝50)的1/4″×180mm試紙條。
10.手套步驟注意在低于40％濕度的條件下裝配試紙條。戴上手套操作所有組分。
1.在卡片底端將兩個(gè)襯層(liners)從膠帶上移除。
2.將帶有金綴合物的金試紙條放置在頂端并與膜重疊1-1.5mm。
3.將底端層沿卡片的底端邊緣放置，注意讓金試紙條暴露在外。
4.從沿著卡片頂部的膠條上除去襯墊。將頂層沿著卡片的頂端放置并與膜重疊1-1.5mm。
5.室溫下儲(chǔ)存完成的卡片干燥直到可用于切割成條。
6.將試紙條切割成4mm長(zhǎng)。一張卡片將產(chǎn)生大約40個(gè)試紙條。室溫下干燥儲(chǔ)存試紙條。
實(shí)施例3檢測(cè)酶活性肌醇六磷酸酶。
步驟通過(guò)加熱至99℃達(dá)60分鐘將畢赤氏酵母(Pichia)產(chǎn)生的純化的肌醇六磷酸酶失活。然后測(cè)試該肌醇六磷酸酶的酶活性并與在肌醇六磷酸酶ELISA的反應(yīng)性(圖2)以及與肌醇六磷酸酶免疫檢測(cè)試紙條(圖3)的反應(yīng)性比較。
ELISA比較圖2顯示于99℃ 04-28-03下孵育后Nov9X的剩余活性的圖(FPLC純化的TAM Lot#PHY-PP9XR-PB200L，活性與ELISA數(shù)據(jù)的比較)，這表明ELISA檢測(cè)和免疫檢測(cè)試紙條似乎僅檢測(cè)有活性的肌醇六磷酸酶。通過(guò)加熱而失活的肌醇六磷酸酶在兩個(gè)檢測(cè)中都沒(méi)有檢測(cè)到。
實(shí)施例4肌醇六磷酸酶免疫檢測(cè)試劑盒這種診斷測(cè)試(見(jiàn)圖4)設(shè)計(jì)用于快速(10分鐘)檢測(cè)飼料中的肌醇六磷酸酶。該試劑盒含有完成該測(cè)試需要的全部試劑和裝置。該試劑盒可在不超過(guò)100°F(38℃)的環(huán)境溫度下儲(chǔ)存。將該測(cè)試材料包裝于密封防潮箔袋中，箔袋中裝有能吸潮的硅膠干燥劑。讓測(cè)試材料保存在它的包裝中直到使用之前。避免將測(cè)試材料放置在潮濕的地方。
檢測(cè)步驟1.將大試管裝上飼料直到15的刻度。將這些量的飼料加至提取袋內(nèi)的網(wǎng)格層的一邊。
2.從試劑盒取出一個(gè)提取緩沖液的塑料容器(25ml)并將其注入提取袋中。
3.關(guān)上口袋并輕輕的移動(dòng)緩沖液讓其處于飼料上而確保所有的飼料都是濕的。等待至少10分鐘。
4.從箔袋中取出現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試材料(Field Test)并置于平的干燥表面上。檢查干燥劑。干燥劑應(yīng)該是藍(lán)色的。如果是粉紅色的，檢測(cè)材料就不再有效并應(yīng)該丟棄。
5.使用移液管，移取3-5滴飼料提取液充滿現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)材料的樣品孔內(nèi)。
6.等待約5分鐘讓結(jié)果出現(xiàn)于樣品孔上的窗口中。
結(jié)果如果樣品中存在肌醇六磷酸酶，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)材料的結(jié)果窗口中會(huì)出現(xiàn)兩條紅線。較低的線表示肌醇六磷酸酶的存在而上面的線是對(duì)照線，其表示設(shè)備正常運(yùn)行。檢測(cè)線將不會(huì)和對(duì)照線一樣強(qiáng)。檢測(cè)線上所見(jiàn)的任何反應(yīng)都認(rèn)為是陽(yáng)性的。
如果不存在肌醇六磷酸酶，就僅有一條單一的紅色對(duì)照線出現(xiàn)在結(jié)果窗口。
實(shí)施例5.丸狀飼料中的肌醇六磷酸酶的檢測(cè)該實(shí)施例闡述了使用免疫檢測(cè)試紙條檢測(cè)法來(lái)檢測(cè)丸狀動(dòng)物飼料中的肌醇六磷酸酶。
方法和試劑是如上面實(shí)施例4中描述的，不同的是可用任何機(jī)械裝置將丸狀動(dòng)物飼料碾碎為顆粒狀或粉末狀的稠度，并且提取緩沖液是含有水溶液中0.5％Tween-20的5％甲醇而不是硼酸鹽緩沖液。而且，抗-肌醇六磷酸酶抗體是來(lái)自雞而不是兔。結(jié)果在下面的表4中列出。表4表明使用ELISA和免疫檢測(cè)試紙條檢測(cè)法在漿狀(在成丸狀之前)飼料和丸狀飼料中都檢測(cè)到了Quantum肌醇六磷酸酶。表5顯示用免疫測(cè)試紙條和ELISA，在起始飼料(在成丸狀前)和粉碎的飼料(成丸后的飼料)中Quantum肌醇六磷酸酶是可檢測(cè)的?；钚砸灿妹富钚詸z測(cè)法進(jìn)行確認(rèn)。
表4丸狀飼料中的肌醇六磷酸酶的檢測(cè)
表5肌醇六磷酸酶活性和ELISA定量起始飼料和粉碎飼料中肌醇六磷酸酶。
從前面詳細(xì)的描述，對(duì)當(dāng)前的用于檢測(cè)飼料酶蛋白，特別是肌醇六磷酸酶的試劑、方法和試劑盒的調(diào)整對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
盡管通過(guò)參考其特定的實(shí)施方案本發(fā)明得以描述，應(yīng)該理解，許多變動(dòng)、調(diào)整以及另外的實(shí)施方案是可能的，并因此，所有的這種變動(dòng)、調(diào)整和實(shí)施方案也應(yīng)認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在許多專(zhuān)利、申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)在本說(shuō)明書(shū)中討論或引用，并通過(guò)全文引用作為參考。
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)樣品中的飼料酶的免疫檢測(cè)法，所述的方法包括以下步驟a)在存在能免疫識(shí)別提取物中的飼料酶的一抗時(shí)制備樣品提取物，從而形成一抗-飼料酶復(fù)合物；b)制備具有顯著三維尺寸的固相形式，以形成具有多個(gè)縫隙空間的顯著體積，其上結(jié)合有能夠免疫識(shí)別飼料酶的所需的二抗，其中所述二抗與檢測(cè)手段綴合，并且其中所述二抗也免疫識(shí)別所述飼料酶。d)將步驟(a)的提取物和步驟(b)制備的形式混合，由此提取物流過(guò)制備的固相形式的縫隙空間，捕獲一抗-飼料酶復(fù)合物；e)通過(guò)所述的捕獲的一抗-飼料酶復(fù)合物的存在來(lái)檢測(cè)飼料酶。
2.如權(quán)利要求1所述的免疫檢測(cè)法，其中所述的飼料酶是肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶和/或蛋白酶蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的免疫檢測(cè)法，其中肌醇六磷酸酶是熱穩(wěn)定性肌醇六磷酸酶。
4.如權(quán)利要求1所述的免疫檢測(cè)法，其中所述的固相形式是醋酸纖維素、纖維素、硝化纖維素或尼龍。
5.如權(quán)利要求4所述的免疫檢測(cè)法，其中所述的固相形式是由多個(gè)堆疊和連續(xù)的層組成，其中每層能捕獲不同的飼料酶。
6.如權(quán)利要求4所述的免疫檢測(cè)法，其進(jìn)一步包括固相形式的樣品吸收層。
7.如權(quán)利要求6所述的免疫檢測(cè)法，其進(jìn)一步包含含有標(biāo)記的抗-飼料酶抗體的試紙條。
8.如權(quán)利要求1所述的免疫檢測(cè)法，其中所述的檢測(cè)手段是膠體金。
9.用于通過(guò)如權(quán)利要求1所述的免疫檢測(cè)法檢測(cè)的試劑盒，包含a)用于從樣品中提取飼料酶的手段；和b)固相形式，其含有抗飼料酶一抗并具有顯著三維尺寸以形成具有多個(gè)縫隙空間的顯著體積，其上結(jié)合有能夠免疫識(shí)別飼料酶的所需的二抗，其中所述二抗與檢測(cè)手段綴合，并且其中所述二抗也免疫識(shí)別所述飼料酶。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其還含有裝有緩沖液的容器。
11.如權(quán)利要求10所述的試劑盒，其進(jìn)一步包含將樣品分散至固相形式上的手段。
12.用于檢測(cè)和定量飼料酶的免疫檢測(cè)法，所述的免疫檢測(cè)法包括以下步驟a)制備樣品提取物；b)將一部分提取物和能與飼料酶結(jié)合的抗飼料酶一抗以及和能與飼料酶結(jié)合的抗飼料酶二抗孵育來(lái)產(chǎn)生抗體-聚合物-抗體復(fù)合物，其中所述的一抗結(jié)合至固體載體上；c)洗滌抗體-聚合物-抗體復(fù)合物以除去未結(jié)合的二抗；d)加入能與二抗發(fā)生免疫反應(yīng)的檢測(cè)抗體，其中檢測(cè)抗體是標(biāo)記的；并e)測(cè)量結(jié)合的或未結(jié)合的標(biāo)記的抗體的量來(lái)檢測(cè)流體中水處理聚合物的濃度。
13.如權(quán)利要求12所述的免疫檢測(cè)法，其中所述的飼料酶是肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶和/或蛋白酶蛋白。
14.如權(quán)利要求13所述的免疫檢測(cè)法，其中肌醇六磷酸酶是熱穩(wěn)定性肌醇六磷酸酶。
15.如權(quán)利要求12所述的免疫檢測(cè)法，其中可檢測(cè)的標(biāo)記物是酶。
16.如權(quán)利要求15所述的免疫檢測(cè)法，其中所述的酶是堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶或β-半乳糖苷酶。
17.如權(quán)利要求16所述的免疫檢測(cè)法，其中所述的酶產(chǎn)生不可溶的反應(yīng)產(chǎn)物。
18.用于通過(guò)如權(quán)利要求12所述的免疫檢測(cè)法檢測(cè)和定量的試劑盒，其包含a)用于從樣品中提取飼料酶的手段；b)包含結(jié)合至固體支持物上的抗飼料酶一抗的固體支持物；c)抗飼料酶二抗；和d)能免疫性結(jié)合至二抗的檢測(cè)抗體，其中所述檢測(cè)抗體用檢測(cè)手段標(biāo)記。
19.如權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中所述的檢測(cè)手段是酶。
20.如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述的檢測(cè)酶是堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶或β-半乳糖苷酶。
21.如權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述的酶產(chǎn)生可溶或不可溶的反應(yīng)產(chǎn)物。
22.如權(quán)利要求21所述的試劑盒，其進(jìn)一步包含酶的底物。
23.免疫識(shí)別肌醇六磷酸酶的抗體。
24.如權(quán)利要求23所述的抗體，其中所述的抗體是多克隆抗體。
25.如權(quán)利要求23所述的抗體，其中所述的抗體是單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域并更特定地涉及用于檢測(cè)蛋白和酶，特別是飼料酶的免疫檢測(cè)方法、試劑盒和試劑。
文檔編號(hào)G01N33/573GK1833168SQ200480022707
公開(kāi)日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2004年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月7日
發(fā)明者M·S·亞內(nèi)爾, L·蔡托尼 申請(qǐng)人:辛根塔參與股份公司, L·蔡托尼