專利名稱：與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選神經(jīng)障礙。具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)分析受試者的組織樣品，確定是否存在與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物，來(lái)在受試者中篩選神經(jīng)障礙。特別是，本發(fā)明涉及通過(guò)測(cè)定從受試者中獲得的組織樣品中的β-N-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)或其神經(jīng)毒性衍生物的水平，在受試者中診斷患神經(jīng)障礙，或者預(yù)測(cè)受試者發(fā)展成神經(jīng)障礙的可能性的方法。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及篩選環(huán)境樣品中與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及抑制神經(jīng)障礙。
背景技術(shù)：
一種最初由Kurland和Mulder(1954)在關(guān)島的查莫羅人(Chamorro)中鑒定的獨(dú)特的神經(jīng)疾病的特征是一些癥狀的組合，包括彎腰體位、空白無(wú)表情的面容、癡呆、緩慢的拖曳運(yùn)動(dòng)、故意行動(dòng)后停止的休息性震顫、行動(dòng)緩慢、以及導(dǎo)致手上的肌肉下傾的肌肉萎縮。在一些臨床表現(xiàn)中，患者具有不易與肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)區(qū)分的臨床癥狀。其它患者具有合并癡呆的帕金森綜合征特征(帕金森癡呆復(fù)征，PDC)。在另外的其它人中，僅觀察到癡呆。一些患者既有ALS又有PDC。在神經(jīng)病理學(xué)中，該病的所有臨床類型都導(dǎo)致特殊特征，在皮層和在脊髓中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。因?yàn)樵摬【哂蓄愃萍∥s性側(cè)索硬化癥(ALS)、帕金森病(PD)和阿爾茨海默病(AD)的方面，所以該病被稱作關(guān)島肌萎縮性側(cè)索硬化癥-帕金森痂呆復(fù)征(ALS-PDC)，且也稱作lytico-bodig。
發(fā)明概述本發(fā)明提供通過(guò)分析受試者的組織樣品，確定是否存在與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物，來(lái)篩選患有或有患神經(jīng)障礙風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法。神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物可以是谷氨酸受體激動(dòng)劑，如β-N-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)或β-N-草酰氨基-L-丙氨酸(BOAA)。在組織樣品中，可分析蛋白結(jié)合的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物、可分析游離的(未結(jié)合的)神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物，或者可分析樣品中蛋白結(jié)合的和游離的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物兩者。在組織樣品中，可分析蛋白結(jié)合的BMAA、游離的BMAA或者蛋白結(jié)合的BMAA和游離的BMAA兩者。受試者可能具有神經(jīng)障礙的癥狀、或者可能無(wú)神經(jīng)障礙的癥狀、或者可能已被鑒定為有發(fā)展成神經(jīng)障礙的風(fēng)險(xiǎn)。神經(jīng)毒性衍生物可能是具有神經(jīng)毒性活性的任何衍生物，如氨基甲酸酯加合物或神經(jīng)毒性氨基酸的代謝物。
本發(fā)明提供通過(guò)分析受試者的組織樣品，確定是否存在與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物，來(lái)篩選患有或有患神經(jīng)障礙風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法，其中存在可檢測(cè)水平的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性氨基酸衍生則表明患神經(jīng)障礙?？墒褂帽景l(fā)明的方法檢測(cè)神經(jīng)障礙，包括神經(jīng)原纖維纏結(jié)障礙(NFT障礙)如肌萎縮性側(cè)索硬化癥-帕金森癡呆復(fù)征(ALS-PDC)、阿爾茨海默病、或進(jìn)行性核上麻痹(PSP)，運(yùn)動(dòng)障礙如帕金森病，或者運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病如肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)。
本發(fā)明提供通過(guò)分析受試者的組織樣品，確定是否存在與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物，來(lái)篩選患有或有患神經(jīng)障礙風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法，其中該方法可用于預(yù)測(cè)發(fā)展為神經(jīng)疾病的可能性、和/或預(yù)測(cè)神經(jīng)障礙發(fā)作前的潛伏期、和/或預(yù)測(cè)神經(jīng)障礙的嚴(yán)重程度?？墒褂冒?，但不限于，神經(jīng)組織或非神經(jīng)組織的組織樣品實(shí)施本發(fā)明的方法。神經(jīng)組織可能是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)有關(guān)的組織，包括腦組織或腦脊液(CSF)，或者可能是與周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)有關(guān)的組織。非神經(jīng)組織可以是角質(zhì)組織，包括，但不限于，毛發(fā)、皮膚、指甲(包括手指甲或腳趾甲)、羽毛、爪、蹄或角。非神經(jīng)組織可以是非角質(zhì)組織，包括，但不限于，血液、血清、唾液或尿液。
本發(fā)明提供篩選環(huán)境樣品以確定環(huán)境樣品是否與神經(jīng)障礙有關(guān)的方法，其通過(guò)分析環(huán)境樣品以確定是否存在與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物來(lái)實(shí)現(xiàn)。神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物可以是谷氨酸受體激動(dòng)劑，如甲基化丙氨酸，特別是BMAA。合適的環(huán)境樣品包括水和/或食物產(chǎn)品或來(lái)源。
本發(fā)明提供篩選環(huán)境樣品以確定該樣品是否與神經(jīng)障礙相關(guān)的方法，其通過(guò)檢測(cè)環(huán)境樣品中產(chǎn)生神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的藍(lán)細(xì)菌來(lái)實(shí)現(xiàn)。神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物可以是谷氨酸受體激動(dòng)劑，如甲基化丙氨酸，特別是BMAA。本發(fā)明的方法適于檢測(cè)產(chǎn)生神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的藍(lán)細(xì)菌，包括念珠藻屬(Nostoc)和/或魚腥藻屬(Anabena)的藍(lán)細(xì)菌。合適的環(huán)境樣品包括水和/或食物產(chǎn)品或來(lái)源。
本發(fā)明提供通過(guò)降低與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平，在受試者中抑制神經(jīng)障礙的方法，特別是通過(guò)將神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物從內(nèi)源貯池(reservoir)中釋放。神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物可以是谷氨酸受體激動(dòng)劑如甲基化丙氨酸，特別是BMAA。
本發(fā)明提供通過(guò)提高神經(jīng)保護(hù)劑化合物的細(xì)胞濃度在受試者中抑制神經(jīng)障礙的方法，所述化合物阻斷與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物與靶分子的相互作用。神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物可以是谷氨酸受體激動(dòng)劑如甲基化丙氨酸，特別是BMAA。神經(jīng)保護(hù)劑化合物可以是谷氨酸?？砂ńY(jié)合或螯合神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的試劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用于篩選患有或有患神經(jīng)障礙風(fēng)險(xiǎn)的受試者的試劑盒，其中該試劑盒包括從受試者中獲得組織樣品的工具和分析組織樣品以確定是否存在與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的工具。該試劑盒可包括測(cè)定是否存在谷氨酸受體激動(dòng)劑如甲基化丙氨酸，特別是BMAA的工具。該試劑盒可包括用于分析樣品中蛋白結(jié)合的BMAA、游離BMAA、或者蛋白結(jié)合的BMAA和游離的BMAA兩者的工具。該試劑盒可包括獲取并分析受試者的多個(gè)組織樣品的工具。該組織樣品可包括已知累積神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的組織樣品以及已知不累積神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的組織樣品。組織樣品可包括至少兩個(gè)已知累積神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的不同組織的樣品。試劑盒可包括進(jìn)行重復(fù)篩選受試者的工具。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示Cycas micronesia Hill中BMAA和谷氨酸(GLU)的濃度，通過(guò)除每種氨基酸的最大濃度進(jìn)行歸一化，其允許比較整個(gè)植物的相對(duì)豐度；9μg/g以下的值由于相對(duì)于最大濃度太小而不能在本圖中見(jiàn)到。
表1顯示Cycas micronesia Hill的各種組織中的BMAA和GLU的濃度；濃度表示為μg/g。
表2顯示蘇鐵科植物組織、蘇鐵科植物粉和狐蝠組織樣品中的BMAA濃度。
表3顯示查莫羅人和加拿大人群體患者的額上回組織樣品中游離的和蛋白結(jié)合的BMAA水平。
發(fā)明詳述本發(fā)明公開內(nèi)容提供篩選神經(jīng)障礙的方法?？墒褂眠@里所提供的方法在受試者中診斷或預(yù)測(cè)神經(jīng)障礙，篩選與神經(jīng)障礙相關(guān)的環(huán)境因素，以及在受試者中抑制神經(jīng)障礙。
本發(fā)明提供通過(guò)分析受試者的組織樣品以確定是否存在與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物，來(lái)篩選患神經(jīng)障礙的受試者的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供篩選環(huán)境樣品以確定是否存在與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的方法。短語(yǔ)“以確定是否存在神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物”或“確定是否存在神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物”或類似短語(yǔ)，不僅包括確定存在或不存在可檢測(cè)水平的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物，而且也包括定量樣品中所檢測(cè)到的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平。因此，在具體的實(shí)施方案中，在樣品中“確定是否存在神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物”可包括測(cè)定神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平，以及可進(jìn)一步包括確定樣品中的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平與其它樣品中所檢測(cè)的水平相比，是提高還是降低。
篩選包括但不限于，通過(guò)分析受試者的組織樣品在受試者中診斷或預(yù)測(cè)神經(jīng)障礙。篩選可在患有神經(jīng)障礙的受試者上進(jìn)行，或者可在有患神經(jīng)障礙風(fēng)險(xiǎn)的受試者上進(jìn)行，或者可在沒(méi)有已知的患神經(jīng)障礙風(fēng)險(xiǎn)的受試者上進(jìn)行。篩選進(jìn)一步包括分析環(huán)境樣品以確定受試者實(shí)際上或潛在地接觸與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物。
如這里所提供的，與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物包括，但不限于，非蛋白氨基酸、興奮性氨基酸、氨基酸類似物、氨基酸代謝物、氨基酸的氨基甲酸酯加合物以及氨基酸的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定從受試者中獲得的組織樣品中是否存在β-N-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)，可在受試者中篩選一個(gè)或多個(gè)神經(jīng)障礙。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定從受試者中獲得的組織樣品中是否存在(S)-2-氨基-3-(3-羥基-5-甲基異唑-4-基)丙酸(AMPA)，可篩選一個(gè)或多個(gè)神經(jīng)障礙。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定從受試者中獲得的組織樣品中是否存在β-N-草酰-氨基-L-丙氨酸(BOAA，也描述為S-(-)-β-N-草酰-，β-二氨基丙酸)，可在受試者中篩選一個(gè)或多個(gè)神經(jīng)障礙。應(yīng)當(dāng)理解的是，測(cè)定神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的方法包括，當(dāng)必需時(shí)，區(qū)分相同化合物的神經(jīng)毒性異構(gòu)體和非神經(jīng)毒性異構(gòu)體的方法，例如，區(qū)分神經(jīng)毒性L-BOAA和非神經(jīng)毒性D-BOAA的方法。
本發(fā)明的神經(jīng)毒性氨基酸可以是非蛋白氨基酸包括，但不限于，β-丙氨酸(3-丙氨酸)、4-氨基丁酸(GABA)、3-氰丙氨酸(β-氰丙氨酸)、2-氨基丁酸、2-亞甲基-4-氨基丁酸、3-亞甲基-4-氨基丁酸、2-氨基異丁酸、5-氨基酮戊酸、2-氨基-4-甲基己酸(高異亮氨酸)、2-氨基-4-甲基己-4-烯酸、2-氨基-4-甲基己-5-炔酸、2-氨基-3-甲基戊酸、2-氨基己二酸、4-亞乙基谷氨酸、3-氨基戊二酸、2-氨基庚二酸、N4-乙基天冬酰胺、N4-甲基天冬酰胺、赤型-4-甲基谷氨酸、4-亞甲基谷氨酸、4-亞甲基谷氨酰胺、N5-甲基谷氨酰胺、N5-乙基谷氨酰胺(茶氨酸)、N5-異丙基谷氨酰胺、2-氨基-4-(氨氧基(aminoxy))丁酸(副刀豆氨酸)、2，4-二氨基丁酸、N4-乙酰-2，4-二氨基丁酸、N4-乳酰-2，4-二氨基丁酸、N4-草酰-2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸、N3-乙酰-2，3-二氨基丙酸、N3-甲基-2，3-二氨基丙酸、N3-草酰-2，3-二氨基丙酸、N6-乙酰賴氨酸、N6-甲基賴氨酸、N6-三甲基賴氨酸(昆布氨酸)、鳥氨酸(2，5-二氨基戊酸)、酵母氨酸(N6-(2′-谷氨酰)賴氨酸、2，6-二氨基庚二酸、N4-(2-羥乙基)天冬酰胺、赤型-3-羥基天冬氨酸、4-羥基精氨酸、4-羥基瓜氨酸、蘇型-4-羥基谷氨酸、3，4-二羥基谷氨酸、3-羥基-4-甲基谷氨酸、3-羥基-4-亞甲基谷氨酸、4-羥基-4-甲基谷氨酸、4-羥基-谷氨酰胺、N5-(2-羥乙基)谷氨酰胺、5-羥基正亮氨酸、蘇型-4-羥基高精氨酸、高絲氨酸、O-乙酰高絲氨酸、O-草酰高絲氨酸、O-磷酸高絲氨酸、4-羥基異亮氨酸、5-羥甲基高半胱氨酸、蘇型-3-羥基亮氨酸、5-羥基亮氨酸、2-羥基賴氨酸、4-羥基賴氨酸、5-羥基賴氨酸、N6-乙酰-5-羥基賴氨酸、N6-三甲基-5-羥基賴氨酸、4-羥基鳥氨酸、含羞草氨酸、4-羥基正纈氨酸、5-羥基正纈氨酸、2-氨基-4，5-二羥基戊酸、2-氨基-4-羥基庚二酸、4-羥基纈氨酸、O-乙酰絲氨酸、O-磷酸絲氨酸、哌啶酸(哌啶-2-羧酸)、3-羥基哌啶酸、反-4-羥基哌啶酸、反-5-羥基哌啶酸、5-羥基-6-甲基哌啶酸、4，5-二羥基哌啶酸、反-3-羥基脯氨酸、反-4-羥基脯氨酸、反-4-羥甲基脯氨酸、鈴蘭氨酸、N-(3-氨基-3-羧基丙基)鈴蘭氨酸、4，5-脫氫哌啶酸(蓓豆氨酸)、3-氨基-3-羧基吡咯烷酮(南瓜子堿)、2-(環(huán)戊-2′-烯基)甘氨酸、5-羥基色氨酸、合歡氨酸(2-氨基-3-脲基丙酸)、精氨基琥珀酸、刀豆氨酸琥珀酸、瓜氨酸、高精氨酸、高瓜氨酸、穗花木蘭氨酸、O-脲基高絲氨酸、6-羥基犬尿氨酸、3-(4-氨基苯基)丙氨酸、3-(3-氨基甲基苯基)丙氨酸、3-(3-羧苯基)丙氨酸、3-羧基酪氨酸、3-(3-羥甲基苯基)丙氨酸、3-(3-羥苯基)丙氨酸、3-(3，4-二羥苯基)丙氨酸(L-DOPA)、2-(苯基)甘氨酸、2-(3-羧苯基)甘氨酸、2-(3-羧基-4-羥苯基)甘氨酸、2-(3-羥苯基)甘氨酸、2-(3，5-二羥苯基)甘氨酸、4-氨基哌啶酸、四氫煙酸、2-氨基-4-(異唑-5-酮)-2-基)丁酸、黧豆素或四氫黧豆素。(Spencer和Berman，2003，PlantToxins and Human Health，CABI，pp 1-23)。本公開內(nèi)容為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供充分的指導(dǎo)以鑒定本發(fā)明的神經(jīng)毒性非蛋白氨基酸。
非蛋白氨基酸的神經(jīng)毒性衍生物包括但不限于代謝物、氨基甲酸酯加合物、類似物以及具有神經(jīng)毒性活性的其它氨基酸。根據(jù)一個(gè)方面，神經(jīng)毒性衍生物是神經(jīng)毒性氨基酸的氨基甲酸酯加合物(氨基甲酸酯)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的神經(jīng)毒性衍生物是BMAA的氨基甲酸酯加合物，包括α-N-羧基-β-N-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA-α-NCO2)和/或β-(N-羧基-N-甲基)-氨基-L-丙氨酸(BMAA-β-NCO2)，(Brownson等，2002，J Ethnopharmacol 82159-167；Myers和Nelson，1990，J Biol Chem 26510193-10195)。根據(jù)另一個(gè)方面，神經(jīng)毒性衍生物包括神經(jīng)毒性氨基酸的神經(jīng)毒性異構(gòu)體，盡管可選擇地被理解為神經(jīng)毒性異構(gòu)體是具體實(shí)施方案中的神經(jīng)毒性氨基酸。神經(jīng)毒性衍生物也可能是甲基化的、氨甲酰化的或羥基化的代謝物，或者與糖、脂質(zhì)或蛋白綴合的代謝物。應(yīng)當(dāng)理解的是這里所提供的方法適于測(cè)定與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒素，并且甚至當(dāng)測(cè)量的化合物不必是在特定受試者體內(nèi)起作用的一種或多種化合物時(shí)也可提供對(duì)神經(jīng)毒素的有力測(cè)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供測(cè)定組織樣品和環(huán)境樣品中BMAA水平的方法，并且這些方法產(chǎn)生有力的結(jié)果，甚至當(dāng)這些方法不能區(qū)分在具體實(shí)施方案中是BMAA還是衍生物如BMAA的氨基甲酸酯加合物(例如，(BMAA-α-NCO2或β-(N-羧基-N-甲基)-氨基-L-丙氨酸(BMAA-β-NCO2)是最有活性的化合物時(shí)。這里提出的方法是有力的，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)具體實(shí)施方案的具體情況進(jìn)一步改進(jìn)。
根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供篩選環(huán)境樣品中與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的方法。篩選環(huán)境樣品中神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物包括，但不限于，進(jìn)行篩選以確定受試者實(shí)際上或潛在地接觸與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物，以及進(jìn)行篩選以鑒定受與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物污染的環(huán)境樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供測(cè)定包括水樣品或食物產(chǎn)品的環(huán)境樣品中BMAA水平的方法。
根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供通過(guò)降低與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平來(lái)在受試者中抑制神經(jīng)障礙的方法，例如，通過(guò)排盡神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的內(nèi)源性貯池。抑制包括，但不限于，治療已存在的神經(jīng)障礙或者預(yù)防神經(jīng)障礙。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在受試者中排盡BMAA或其衍生物的內(nèi)源性貯池的方法。
根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供通過(guò)干擾神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物和其靶分子之間的相互作用，在受試者中抑制神經(jīng)障礙的方法。具體地，本發(fā)明提供通過(guò)提高神經(jīng)保護(hù)劑化合物的細(xì)胞濃度，來(lái)抑制神經(jīng)障礙的方法，所述化合物阻斷神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物與靶分子的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物是BMAA或BMAA衍生物，且神經(jīng)保護(hù)劑化合物是谷氨酸或谷氨酸類似物。可包括結(jié)合神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的試劑以便螯合從內(nèi)源性貯池中釋放的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物。可包括當(dāng)神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物從內(nèi)源性貯池中釋放時(shí)，螯合釋放的金屬離子的螯合劑。
如這里所提供的，受試者可以是適合實(shí)施本發(fā)明方法的任何生物。具體地，受試者是哺乳動(dòng)物，更具體地是靈長(zhǎng)類，甚至更具體的是人。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是暴露于與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。這種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括，但不限于，小鼠、兔子、大鼠、蝙蝠、豬、羊、母牛、猴子、猿或適于研究神經(jīng)障礙的其它動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用存在一種或多種神經(jīng)疾病動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施本發(fā)明的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用作為開發(fā)一種或多種神經(jīng)疾病動(dòng)物模型一部分的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施本發(fā)明的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施本發(fā)明的方法，其中通過(guò)大腦的化學(xué)、結(jié)構(gòu)或功能的研究，測(cè)量暴露于與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的效果。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是患一種或多種神經(jīng)障礙的人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是無(wú)一種或多種神經(jīng)障礙癥狀的人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是已鑒定為有發(fā)展成神經(jīng)障礙風(fēng)險(xiǎn)的人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是已知或被懷疑已經(jīng)接觸至少一種與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的人。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供用于分析受試者組織樣品或在環(huán)境篩選中所使用的環(huán)境樣品中一種或多種形式的與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的方法。方法包括分析游離(例如，未結(jié)合的、胞質(zhì)的、循環(huán)的)形式的與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物、蛋白結(jié)合形式的與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物(例如，結(jié)合到蛋白或摻入到蛋白內(nèi))、或者綴合形式的與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物(例如，與糖或脂質(zhì)綴合)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可測(cè)定樣品中存在哪種形式的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物，并可進(jìn)一步測(cè)定對(duì)于給定的實(shí)施方案而言哪種是診斷或預(yù)測(cè)感興趣的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，分析組織樣品中一種或多種形式的BMAA。在組織中BMAA可以以游離的(未結(jié)合的)形式存在，或者可以以蛋白結(jié)合的形式存在，其中BMAA可整合到蛋白內(nèi)或者其可以以其它方式與蛋白結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定游離的和蛋白結(jié)合的BMAA水平兩者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，僅測(cè)定游離的BMAA水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，僅檢測(cè)蛋白結(jié)合的BMAA水平。
根據(jù)另一個(gè)方面，可使用從受試者中獲得的任何組織樣品實(shí)施本發(fā)明的方法，前提是分析該組織樣品便可確定是否存在與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可分析組織樣品以確定是否存在BMAA，且如果存在BMAA，則測(cè)定BMAA的量。根據(jù)組織樣品的性質(zhì)以及在具體實(shí)施方案中將要回答的問(wèn)題，可定量游離的BMAA和/或蛋白結(jié)合的BMAA的量。在一些實(shí)施方案中，可能期望測(cè)定游離的和蛋白結(jié)合的BMAA水平兩者。在其它實(shí)施方案中，可能期望僅測(cè)定游離的BMAA水平。在其它的實(shí)施方案中，可能期望僅測(cè)定蛋白結(jié)合的BMAA水平。組織樣品可從有生命的受試者中獲得，或者可從保存的標(biāo)本中獲得，所述標(biāo)本包括貯藏的組織、活組織檢查和/或尸體解剖樣品或者博物館標(biāo)本。貯藏的組織可以是冷凍的組織、組織學(xué)標(biāo)本、在固體貯藏介質(zhì)上干燥的組織或者其它形式的貯藏組織。合適的組織樣品包括但不限于神經(jīng)組織或者非神經(jīng)組織。神經(jīng)組織可能是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)有關(guān)的組織，包括腦組織或者腦脊液(CSF)，或者可能是與周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)有關(guān)的組織。非神經(jīng)組織可以是角質(zhì)組織，包括，但不限于，毛發(fā)、皮膚、指甲(包括手指甲或腳趾甲)、羽毛、爪、蹄或角。非神經(jīng)組織可以是非角質(zhì)組織，包括，但不限于，血液、血清、唾液或尿液。在一個(gè)實(shí)施方案中，分析毛發(fā)樣品以測(cè)定蛋白結(jié)合的BMAA的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分析皮膚以測(cè)定BMAA的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，分析皮膚以測(cè)定游離的BMAA水平和蛋白結(jié)合的BMAA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分析皮膚，僅測(cè)定游離的BMAA水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分析皮膚，僅測(cè)定蛋白結(jié)合的BMAA水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分析腦組織以測(cè)定BMAA水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分析腦脊液(CSF)樣品以測(cè)定BMAA水平。可分析腦或CSF組織以測(cè)定蛋白結(jié)合的BMAA、游離的BMAA，或者蛋白結(jié)合的和游離的BMAA兩者的水平，其中蛋白結(jié)合的BMAA可能結(jié)合神經(jīng)蛋白或結(jié)合其它蛋白。
篩選神經(jīng)障礙本發(fā)明提供篩選神經(jīng)障礙的方法。如這里所提供的，神經(jīng)障礙(也稱作神經(jīng)障礙(neurologic disorder)，或神經(jīng)病，或神經(jīng)病(neurologicdisease))是涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦、腦干和小腦)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)(包括腦神經(jīng))以及自主神經(jīng)系統(tǒng)(其部分位于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)兩者中)的障礙。應(yīng)當(dāng)理解的是神經(jīng)障礙可能具有復(fù)雜的病因，從而一種或多種環(huán)境或遺傳因素可能在受試者中有助于發(fā)展神經(jīng)障礙。神經(jīng)障礙包括充分描述的障礙或綜合征如阿爾茨海默病或帕金森病，或者可以是在多個(gè)障礙中觀察到的病征(例如失語(yǔ)癥)或癥狀(例如，震顫)。進(jìn)一步應(yīng)當(dāng)理解的是，在受試者中發(fā)展神經(jīng)障礙可能歸因于一種因素或多種因素的組合。同樣地，應(yīng)當(dāng)理解的是，在受試者中具體的神經(jīng)障礙可能歸因于不同因素或者是在其它受試者中導(dǎo)致相同神經(jīng)障礙的因素的不同組合。這里所提供的篩選方法適合篩選一種或多種環(huán)境的或者遺傳的因素可能起作用的神經(jīng)障礙。
篩選的方法包括，但不限于，在受試者中診斷一種或多種神經(jīng)障礙的方法、在受試者中預(yù)測(cè)發(fā)展一種或多種神經(jīng)障礙的可能性的方法、在受試者中預(yù)測(cè)神經(jīng)障礙嚴(yán)重性的方法以及測(cè)定受試者是否接觸與發(fā)展神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的方法。本發(fā)明的方法包括進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)以產(chǎn)生關(guān)于受試者中神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的存在及其水平，和/或環(huán)境樣品中神經(jīng)毒性氨基酸或神經(jīng)毒性衍生物的存在及其水平的時(shí)序數(shù)據(jù)的方法。
根據(jù)一個(gè)方面，提供在受試者中診斷一種或多種神經(jīng)障礙的方法。方法包括將在受試者的組織樣品中存在或不存在神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物和與評(píng)估神經(jīng)障礙有關(guān)的其它體格或心理測(cè)定聯(lián)系起來(lái)。方法進(jìn)一步包括將在受試者的一個(gè)或多個(gè)組織樣品中所測(cè)量的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平和與評(píng)估神經(jīng)障礙有關(guān)的其它體格或心理測(cè)定聯(lián)系起來(lái)。在一個(gè)實(shí)施方案中，從診斷為患神經(jīng)障礙的受試者中獲取組織樣品，測(cè)定BMAA水平，并將這些結(jié)果與受試者的其它體格或心理測(cè)量值進(jìn)行比較，作為診斷一種或多種神經(jīng)障礙方法的一部分?？赏瑯拥貙?shí)施本發(fā)明的方法以改進(jìn)或證實(shí)一種或多種神經(jīng)障礙的診斷，或者排除其它可能的診斷。
在一個(gè)實(shí)施方案中，從懷疑患神經(jīng)障礙的受試者中獲得組織樣品，測(cè)定BMAA水平，并將這些結(jié)果與受試者的其它體格或心理測(cè)量值進(jìn)行比較，作為診斷一種或多種神經(jīng)障礙方法的一部分。如在下面實(shí)施例4和表3中所公開的，發(fā)現(xiàn)在6個(gè)患ALS-PDC(lytico-bodig)的查莫羅人死亡時(shí)的腦組織中，BMAA水平提高。如在實(shí)施例4中進(jìn)一步公開的，也發(fā)現(xiàn)在診斷為患阿爾茨海默病(AD)的加拿大人患者死亡時(shí)的腦組織中，BMAA水平提高。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量當(dāng)前無(wú)一種或多種神經(jīng)障礙癥狀的受試者的組織樣品中的BMAA水平。如在下面實(shí)施例4和表3中所公開的，發(fā)現(xiàn)在無(wú)ALS-PDC癥狀的查莫羅人患者死亡時(shí)的腦組織中，BMAA水平提高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量當(dāng)前無(wú)一種或多種神經(jīng)障礙癥狀的受試者的組織樣品中的BMAA水平，作為鑒定受試者有發(fā)展成神經(jīng)障礙風(fēng)險(xiǎn)的方法的一部分，其可能需要另外的監(jiān)控。
根據(jù)另一個(gè)方面，提供在受試者中測(cè)定一種或多種神經(jīng)障礙嚴(yán)重性的方法。不希望受這種理論限制，神經(jīng)障礙的嚴(yán)重性的一個(gè)指標(biāo)是受試者組織樣品中所測(cè)量的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量診斷為患有，或者懷疑患有一種或多種神經(jīng)障礙的受試者的組織樣品中的BMAA水平，其中更高的BMAA水平與更嚴(yán)重的神經(jīng)障礙相關(guān)。
根據(jù)另一個(gè)方面，提供預(yù)測(cè)發(fā)展成為神經(jīng)病的可能性的方法。方法包括將在一種或多種組織樣品中所測(cè)量的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平和與評(píng)估神經(jīng)障礙有關(guān)的其它體格或心理測(cè)定聯(lián)系起來(lái)。本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將在受試者的一種或多種組織樣品中所測(cè)量的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平和受試者的遺傳分析聯(lián)系起來(lái)，以確定發(fā)展成為神經(jīng)病的可能性。遺傳分析包括分析家族史和/或區(qū)分組織樣品的基因型，作為確定發(fā)展成為神經(jīng)病的可能性的方法的一部分。不希望受這種理論限制，受試者發(fā)展成神經(jīng)障礙的可能性顯示，與在受試者組織樣品中測(cè)得的存在神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物正相關(guān)。如在下面實(shí)施例4中公開的，發(fā)現(xiàn)在六名患ALS-PDC(lytico-bodig)的查莫羅人的腦組織中，BMAA的水平提高。如進(jìn)一步在實(shí)施例4中所公開的，也發(fā)現(xiàn)在死于阿爾茨海默病的個(gè)體的腦組織中，BMAA的水平提高。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在具有一種或多種神經(jīng)障礙癥狀的受試者的組織樣品中測(cè)定BMAA水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在無(wú)神經(jīng)障礙癥狀的受試者的組織樣品中測(cè)定BMAA水平。
根據(jù)另一個(gè)方面，提供在被認(rèn)為有發(fā)展成一種或多種神經(jīng)障礙風(fēng)險(xiǎn)的受試者中，預(yù)測(cè)神經(jīng)病的嚴(yán)重性的方法。不希望受這種理論限制，受試者組織樣品中的BMAA水平應(yīng)當(dāng)理解為一旦在受試者中發(fā)展神經(jīng)障礙，則與神經(jīng)障礙的嚴(yán)重性正相關(guān)。本發(fā)明的方法因此包括將在一種或多種組織樣品中測(cè)量的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平和與預(yù)測(cè)神經(jīng)障礙的嚴(yán)重性有關(guān)的其它體格或心理測(cè)定聯(lián)系起來(lái)。本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將在受試者的一種或多種組織樣品中所測(cè)量的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平和受試者的遺傳分析聯(lián)系起來(lái)，以在被認(rèn)為可能發(fā)展成一種或多種神經(jīng)障礙的受試者中預(yù)測(cè)神經(jīng)病的嚴(yán)重性。遺傳分析包括分析家族史和/或區(qū)分組織樣品的基因型。
根據(jù)另一個(gè)方面，提供縱向研究神經(jīng)障礙的方法，其通過(guò)在一段時(shí)間內(nèi)在重復(fù)的時(shí)間間隔采集組織樣品并且測(cè)定每個(gè)組織樣品中的BMAA水平，從而提供用于縱向研究的關(guān)于BMAA水平的時(shí)序數(shù)據(jù)。隨時(shí)間推移測(cè)量患進(jìn)行性核上麻痹(PSP)的受試者的BMAA水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，為了測(cè)定隨時(shí)間推移的BMAA釋放的水平，在一段時(shí)間期間內(nèi)重復(fù)測(cè)量受試者組織樣品中的BMAA水平，從而提供用于預(yù)測(cè)未來(lái)一種或多種神經(jīng)障礙發(fā)作的可能性和/或定時(shí)和/或嚴(yán)重性的數(shù)據(jù)。
本發(fā)明提供篩選神經(jīng)障礙的方法，所述神經(jīng)障礙包括，但不限于，帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)、進(jìn)行性核上麻痹(PSP)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)以及稱作ALS-PDC(或，lytico-bodig病)的神經(jīng)病理學(xué)疾病。本發(fā)明公開內(nèi)容的教導(dǎo)為對(duì)鑒定其它神經(jīng)障礙提供了充分的指導(dǎo)，本發(fā)明提供了對(duì)所述其它神經(jīng)障礙的篩選方法本領(lǐng)域技術(shù)人員可實(shí)施本發(fā)明的方法，以測(cè)定受試者組織樣品中的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平，然后將這些水平與受試者中神經(jīng)病的其它標(biāo)記進(jìn)行比較，并確定神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平和特定神經(jīng)病的標(biāo)記之間是否相關(guān)。
根據(jù)一個(gè)方面，這里所提供的方法適于篩選具有神經(jīng)原纖維纏結(jié)的神經(jīng)變性病(稱作神經(jīng)原纖維纏結(jié)病或NFT病)，包括但不限于嗜銀顆粒病、阿爾茨海默病、關(guān)島ALS-PDC、皮層基底變性、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良、Pick氏病、腦炎后帕金森綜合征、原發(fā)性進(jìn)行性失語(yǔ)癥、進(jìn)行性核上麻痹(PSP)以及亞急性硬化性全腦炎。通常這些障礙的特征是導(dǎo)致病理tau蛋白在神經(jīng)元內(nèi)累積形成異常纖絲的神經(jīng)原纖維變性(NFD)，有時(shí)稱作“tauopathies”。不同的NFT障礙具有不同的tau病理學(xué)(即，tau蛋白同工型和在腦中的分布)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，測(cè)量已知或者懷疑患NFT障礙的受試者組織樣品中的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物，例如BMAA的水平。根據(jù)另一個(gè)方面，測(cè)量無(wú)NFT障礙癥狀的受試者組織樣品中的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物，例如，BMAA的水平。根據(jù)另一個(gè)方面，測(cè)量受試者組織樣品中的修飾的酸，例如，BMAA的水平，其中受試者無(wú)NFT障礙的癥狀但被認(rèn)為有發(fā)展成NFT障礙的風(fēng)險(xiǎn)，例如基于NFT障礙的家族史，或者基于已知的或懷疑接觸與NFT障礙相關(guān)的環(huán)境因素。根據(jù)本發(fā)明的方法，腦組織的分析允許將BMAA水平和其它因素進(jìn)行比較，包括但不限于，鑒定是否存在NFTs、鑒定存在哪種tau蛋白同工型以及研究tau蛋白和/或NFTs在受試者腦中的分布模式。
在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量已知或者懷疑患ALS-PDC的受試者腦組織中的BMAA水平，該病具有不同于其它NFT障礙的tau病理學(xué)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量已知或者懷疑患阿爾茨海默病的受試者腦組織中的BMAA水平，該病具有不同于其它NFT障礙的tau病理學(xué)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量已知或者懷疑患進(jìn)行性核上麻痹(PSP)和/或皮層基底變性的受試者腦組織中的BMAA水平，所述病具有不同于其它NFT障礙的tau病理學(xué)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量已知或者懷疑患Pick氏病的受試者腦組織中的BMAA水平，該病具有不同于其它NFT障礙的tau病理學(xué)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量已知或者懷疑患強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良的受試者腦組織中的BMAA水平，該病具有不同于其它NFT障礙的tau病理學(xué)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法測(cè)定診斷為患阿爾茨海默病受試者的組織樣品中的BMAA水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定無(wú)阿爾茨海默病癥狀的受試者的組織樣品中的BMAA水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法測(cè)定無(wú)阿爾茨海默病癥狀，但懷疑有發(fā)展成阿爾茨海默病風(fēng)險(xiǎn)的受試者的組織樣品中的BMAA水平。
根據(jù)另一方面，這里所提供的方法可用于區(qū)分神經(jīng)障礙和/或篩選患神經(jīng)障礙的個(gè)體是否還患有另外的神經(jīng)障礙。在一個(gè)實(shí)施方案中，篩選患唐氏綜合征的個(gè)體中如這里所提供的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物，所述唐氏綜合征為一種由21染色體三體性導(dǎo)致并且其特征為具有包括NFTs的癥狀的神經(jīng)障礙。在一個(gè)實(shí)施方案中，在患唐氏綜合征的受試者中檢測(cè)是否存在BMAA，可用于鑒定有發(fā)展成與神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物相關(guān)的神經(jīng)障礙風(fēng)險(xiǎn)的受試者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在患唐氏綜合征的受試者中檢測(cè)是否存在BMAA，可用于在受試者中區(qū)分多種神經(jīng)障礙。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在患唐氏綜合征的受試者中檢測(cè)是否存在BMAA，可用于辨別神經(jīng)障礙的體征或癥狀的可能原因(病因?qū)W)。
根據(jù)另一個(gè)方面，這里所提供的方法可用于篩選癡呆，包括但不限于阿爾茨海默病(AD)、雷維小體(Lewy body)癡呆(LBD，也稱作具有雷維小體的癡呆(DLB))和血管性癡呆。根據(jù)另一個(gè)方面，這里所提供的方法可用于篩選運(yùn)動(dòng)障礙，包括，但不限于，帕金森病(PD)、張力障礙(持續(xù)的不隨意肌收縮)、亨廷頓舞蹈病(亨廷頓舞蹈癥)、多系統(tǒng)萎縮、進(jìn)行性核上麻痹、皮層基底變性、運(yùn)動(dòng)障礙、特發(fā)性震顫、遺傳性痙攣性截癱、肌陣攣、下肢不寧綜合征、Rett綜合征、痙攣狀態(tài)、小舞蹈病、Tourette氏綜合征以及Wilson氏病。根據(jù)另一個(gè)方面，這里所提供的方法可用于篩選運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(MND)包括，但不限于，肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、進(jìn)行性肌萎縮(肌營(yíng)養(yǎng)不良(MD))和脊髓灰質(zhì)炎后綜合征。根據(jù)另一個(gè)方面，這里所提供的方法可用于篩選關(guān)島肌萎縮性側(cè)索硬化癥/帕金森-癡呆復(fù)征(ALS/PDC，也稱作lytico-bodig)。
應(yīng)當(dāng)理解的是這里所提供的方法適于篩選神經(jīng)障礙，而不管是否存在神經(jīng)障礙的任何病征或癥狀。如在下面實(shí)施例4中所公開的，發(fā)現(xiàn)在一名無(wú)ALS-PCD癥狀的查莫羅人的腦組織中BMAA的水平提高，而另一名無(wú)癥狀的查莫羅人沒(méi)有可檢測(cè)到的BMAA水平。該結(jié)果與在不表現(xiàn)ALS-PDC癥狀的某個(gè)查莫羅人的腦組織中觀察到神經(jīng)原纖維纏結(jié)的觀察一致。
進(jìn)一步應(yīng)當(dāng)理解的是這里所提供的方法適于篩選神經(jīng)障礙，而不管是否可診斷特定的神經(jīng)障礙。因?yàn)椴煌恼系K常常具有相似的病征和癥狀(例如，震顫、癡呆、失語(yǔ))，所以本發(fā)明的方法可適于作為初篩神經(jīng)病的一部分，其中依賴初篩的結(jié)果來(lái)確定對(duì)于整個(gè)評(píng)估來(lái)說(shuō)是否需要另外的檢驗(yàn)。例如，患ALS-PDC的受試者可能具有類似阿爾茨海默病或帕金森病，或者兩種疾病的癥狀，且盡管ALS-PDC被認(rèn)為是一種獨(dú)立的障礙，但是患ALS-PDC的受試者也可能患阿爾茨海默病或帕金森病。因此，受試者中BMAA水平的測(cè)量值可能有助于鑒定存在的哪種神經(jīng)障礙導(dǎo)致在受試者中所觀察到的病征和癥狀。
神經(jīng)障礙包括，但不限于獲得性癲癇樣失語(yǔ)；急性播散性腦脊髓炎；腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；胼胝體發(fā)育不全；失認(rèn)癥；Aicardi綜合征；亞歷山大?。籄lpers氏??；交叉性偏癱；阿爾茨海默病(AD)；肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)；關(guān)島肌萎縮性側(cè)索硬化癥/帕金森-癡呆復(fù)征(ALS/PDC)；無(wú)腦畸形；Angelman綜合征；血管瘤?。蝗毖醢Y；失語(yǔ)癥；失用癥；蛛網(wǎng)膜囊腫；蛛網(wǎng)膜炎；Arnold-Chiari畸形；動(dòng)靜脈畸形；Asperger綜合征；共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥；注意力不集中的過(guò)度反應(yīng)癥；孤獨(dú)癥；自主功能障礙；Batten??；Behcet氏病；Bell氏麻痹；良性自發(fā)性瞼痙攣；良性局灶性肌萎縮；良性顱內(nèi)高血壓；Binswanger氏??；瞼痙攣；Bloch-Sulzberger綜合征；臂叢損傷；腦膿腫；腦損傷；腦腫瘤；脊髓腫瘤；Brown-Sequard綜合征；Canavan??；腕管綜合征(CTS)；灼痛；中樞性痛綜合征；腦橋中央髓鞘溶解；頭部障礙(cephalic disorder)；腦動(dòng)脈瘤；腦動(dòng)脈硬化；腦萎縮；大腦性巨人癥；大腦性癱瘓；Charcot-Marie-Tooth??；Chiari畸形；舞蹈??；慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(CIDP)；慢性疼痛，慢性局部疼痛綜合征；Coffin Lowry綜合征；昏迷，包括持續(xù)植物性狀態(tài)；先天性面癱；皮層基底變性；顱動(dòng)脈炎；顱縫早閉；Creutzfeldt-Jakob病；累積性創(chuàng)傷障礙(cumulative trauma disorders)；Cushing氏綜合征；巨細(xì)胞包涵體病(CIBD)；巨細(xì)胞病毒感染；舞蹈眼-舞蹈腳綜合征(dancing eyes-dancing feet syndrome)；Dandy-Walker綜合征；Dawson??；De Morsier氏綜合征；Dejerine-Klumpke麻痹；癡呆；皮肌炎；糖尿病性神經(jīng)病；彌漫性硬化；自主神經(jīng)功能異常；書寫困難；誦讀困難；張力障礙；早期幼兒癲癇性腦??；空蝶鞍綜合征；腦炎；腦膨出；腦三叉神經(jīng)血管瘤?。话d癇；Erb氏麻痹；特發(fā)性震顫；Fabry氏病；Fahr氏綜合征；暈厥；家族性痙攣性麻痹；熱性癲癇發(fā)作；Fisher綜合征；Friedreich氏共濟(jì)失調(diào)；Gaucher氏病；Gerstmann氏綜合征；巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎；巨細(xì)胞包涵體??；球樣細(xì)胞腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；Guillain-Barre綜合征；HTLV-1相關(guān)性脊髓??；Hallervorden-Spatz??；頭部損傷；頭痛；半側(cè)面肌痙攣；遺傳性痙攣性截癱；遺傳性共濟(jì)失調(diào)性多發(fā)性神經(jīng)炎樣病；耳帶狀皰疹；帶狀皰疹；Hirayama綜合征；前腦無(wú)裂畸形；亨廷頓舞蹈?。环e水性無(wú)腦畸形；腦積水；皮質(zhì)醇增多癥；缺氧；免疫介導(dǎo)的腦脊髓炎；包涵體肌炎；色素失禁(incontinentia pigmenti)；嬰兒植烷酸貯積病；嬰兒Refsum病；嬰兒痙攣；炎性肌??；顱內(nèi)囊腫；顱內(nèi)高壓；Joubert綜合征；Kearns-Sayre綜合征；Kennedy??；Kinsbourne綜合征；Klippel Feil綜合征；Krabbe??；Kugelberg-Welander?。粠?kù)魯癥(kuru)；Lafora病；Lambert-Eaton肌無(wú)力綜合征；Landau-Kleffner綜合征；側(cè)髓(Wallenberg)綜合征；學(xué)習(xí)能力缺失；Leigh氏病；Lennox-Gastaut綜合征；Lesch-Nyhan綜合征；腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；雷維小體癡呆；無(wú)腦回；閉鎖綜合征；Lou Gehrig氏病(ALS)；腰椎間盤疾?。籐yme病，神經(jīng)后遺癥；Lytico-Bodig綜合征(ALS-PCD)；Machado-Joseph??；巨腦；巨腦；Melkersson-Rosenthal綜合征；Menieres病，腦膜炎；Menkes?。划惾拘阅X白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；小頭畸形；偏頭痛；Miller Fisher綜合征；小中風(fēng)(mini-stroke)；線粒體肌??；Mobius綜合征；單肢肌萎縮；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元??；Moyamoya??；粘多糖貯積癥；多發(fā)梗塞性癡呆；多病灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)??；多發(fā)性硬化；具有體位性低血壓的多系統(tǒng)萎縮；肌營(yíng)養(yǎng)不良；重癥肌無(wú)力；髓鞘破壞性彌漫性硬化；嬰兒肌陣攣性腦?。患￡嚁?；肌?。幌忍煨约?qiáng)直；發(fā)作性睡??；神經(jīng)纖維瘤??；精神阻滯劑惡性綜合征；AIDS的神經(jīng)表現(xiàn)；狼瘡的神經(jīng)后遺癥；Lyme病的神經(jīng)后遺癥；神經(jīng)肌強(qiáng)直；神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥；神經(jīng)元遷移障礙；Niemann-Pick??；O′Sullivan-McLeod綜合征，枕神經(jīng)痛；隱性脊柱神經(jīng)管閉合不全序列征；Ohtahara綜合征；橄欖體腦橋小腦萎縮；斜視眼陣攣肌陣攣；視神經(jīng)炎；直立性低血壓；過(guò)度使用綜合征；感覺(jué)異常；帕金森病(PD)；先天性肌強(qiáng)直??；副腫瘤病；陣發(fā)性發(fā)作；Parry Romberg綜合征；Pelizaeus-Merzbacher病；周期性麻痹；周圍神經(jīng)?。怀掷m(xù)植物性狀態(tài)；全身性發(fā)育遲緩；感光噴嚏反射(photic sneeze reflex)；植烷酸貯積??；Pick氏??；擠壓的神經(jīng)；垂體瘤；多發(fā)性肌炎；腦穿通畸形；脊髓灰質(zhì)炎后綜合征；帶狀皰疹后神經(jīng)痛；感染后腦脊髓炎；體位性低血壓；Prader-Willi綜合征；原發(fā)性側(cè)索硬化；朊病毒病；進(jìn)行性半面萎縮；進(jìn)行性多病灶腦白質(zhì)病；進(jìn)行性硬化性灰質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；進(jìn)行性核上麻痹(PSP)；腦假瘤；Ramsay-Hunt綜合征；I型RamsayHunt綜合征；II型Ramsay Hunt綜合征；Rasmussen氏腦炎；反射性交感神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良綜合征；嬰兒Refsum??；Refsum?。恢貜?fù)性運(yùn)動(dòng)障礙；重復(fù)性應(yīng)激損傷；下肢不寧綜合征；逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)的脊髓??；Rett綜合征；Reye氏綜合征；舞蹈?。籗andhoff?。籗childer氏??；腦裂畸形；鼻中隔-眼發(fā)育不良；帶狀皰疹；Shy-Drager綜合征；Sjogren氏綜合征；Soto氏綜合征；痙攣狀態(tài)；脊柱裂；脊髓損傷；脊髓腫瘤；脊髓性肌萎縮；Stiff-Person綜合征；中風(fēng)；Sturge-Weber綜合征；亞急性硬化性全腦炎；皮層下動(dòng)脈硬化性腦?。籗ydenham舞蹈??；暈厥；脊髓空洞癥；遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙；Tay-Sachs?。伙D動(dòng)脈炎；脊髓栓系綜合征；Thomsen病；胸出口綜合征；痛性痙攣；Todd氏麻痹；Tourette氏綜合征；短暫性缺血發(fā)作；傳染性海綿狀腦??；橫貫性脊髓炎；創(chuàng)傷性腦損傷；震顫；三叉神經(jīng)痛；熱帶痙攣性下肢輕癱；結(jié)節(jié)性硬化；包括顳動(dòng)脈炎的結(jié)節(jié)性脈管炎；Von Hippel-Lindau病(VHL)；Wallenberg氏綜合征；Werdnig-Hoffman??；West綜合征；Williams綜合征；Wilson氏?。籞ellweger綜合征。
篩選與神經(jīng)障礙相關(guān)的環(huán)境因素根據(jù)一個(gè)方面，提供篩選與神經(jīng)障礙相關(guān)的環(huán)境因素的方法。與神經(jīng)障礙相關(guān)的環(huán)境因素包括，但不限于，神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物，例如，BMAA。這里所提供的篩選包括，但不限于，檢驗(yàn)環(huán)境樣品以確定受試者是否實(shí)際上或潛在地接觸與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物。環(huán)境樣品可來(lái)自被攝取的材料，例如水樣品或食物樣品。環(huán)境樣品可以是故意攝取的材料，例如喝的水，或者是食物供應(yīng)或食物鏈一部分的植物或動(dòng)物?？蛇x擇地，環(huán)境樣品可來(lái)自偶然攝取的材料，例如，從其內(nèi)含物或分泌物與其它被攝入的材料有關(guān)的生物中獲得的材料，如在用作食物的植物中存在的藍(lán)細(xì)菌的共生生物，或者洗滌或飲用水中的藍(lán)細(xì)菌。
在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量環(huán)境樣品中的BMAA水平以確定受試者是否實(shí)際上或潛在地接觸BMAA。環(huán)境樣品中BMAA水平的測(cè)量導(dǎo)致確定是否潛在地或?qū)嶋H上接觸BMAA，且這些測(cè)量可用于在接觸這些環(huán)境樣品的受試者中預(yù)測(cè)將發(fā)展成神經(jīng)障礙的可能性。應(yīng)當(dāng)理解的是，蘇鐵科植物組織和其它植物組織中的BMAA，是由藍(lán)細(xì)菌的共生生物產(chǎn)生并被蘇鐵科植物和以蘇鐵科植物為食物的其它生物攝入的(實(shí)施例3)。已檢驗(yàn)藍(lán)細(xì)菌檔案中的許多樣品產(chǎn)生BMAA的能力，且?guī)缀跛斜粰z驗(yàn)的菌株都產(chǎn)生BMAA。根據(jù)發(fā)現(xiàn)共生的藍(lán)細(xì)菌是蘇鐵科植物中BMAA的來(lái)源(實(shí)施例3)，結(jié)合土壤和水中幾乎普遍存在的藍(lán)細(xì)菌，以及許多藍(lán)細(xì)菌株產(chǎn)生BMAA的發(fā)現(xiàn)，提出在許多環(huán)境中可能存在BMAA。因此，本發(fā)明的方法除了篩選特定因素如BMAA外，可能還進(jìn)一步包括篩選環(huán)境樣品中藍(lán)細(xì)菌的存在。
根據(jù)另一個(gè)方面，環(huán)境樣品是已知含有藍(lán)細(xì)菌的水。在另一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)境樣品是被懷疑含有藍(lán)細(xì)菌的水。在另一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)境樣品是其內(nèi)含物未知的水。在另一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)境樣品可能是攝取含有藍(lán)細(xì)菌的水的食物動(dòng)物，例如魚、鳥、鹿或家畜。在另一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)境樣品可能是含有藍(lán)細(xì)菌或者與藍(lán)細(xì)菌共生的地衣或蘚類或苔類。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)境樣品可能是含有藍(lán)細(xì)菌或者與藍(lán)細(xì)菌共生的海洋的或淡水的藻類或者海洋的或淡水的真菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)境樣品可能是含有藍(lán)細(xì)菌或者與藍(lán)細(xì)菌共生的海洋的或淡水的無(wú)脊椎動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)境樣品可能是由藍(lán)細(xì)菌留下的疊層石，或石油化學(xué)沉積物，或礦物沉積物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)境樣品可能是攝取含有藍(lán)細(xì)菌或者由藍(lán)細(xì)菌留下的疊層石、石油化學(xué)沉積物或礦物沉積物的植物、地衣、蘚類、藻類、海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的食物動(dòng)物，例如，馴鹿、北美馴鹿、鹿、駝鹿、海洋或淡水魚、鳥、爬行動(dòng)物或家畜。
根據(jù)另一個(gè)方面，篩選環(huán)境樣品以確定樣品是否與神經(jīng)障礙相關(guān)，這通過(guò)檢測(cè)環(huán)境樣品中是否存在產(chǎn)生神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的藍(lán)細(xì)菌實(shí)現(xiàn)。通過(guò)篩選環(huán)境樣品以檢測(cè)產(chǎn)生神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的藍(lán)細(xì)菌，可能確定受試者是否實(shí)際上或潛在地接觸與神經(jīng)障礙相關(guān)的環(huán)境因素。已在許多屬包括，但不限于，念珠藻屬和魚腥藻屬的藍(lán)細(xì)菌菌株中發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物，例如，BMAA。
根據(jù)另一個(gè)方面，在整個(gè)食物鏈的不同水平檢測(cè)多個(gè)環(huán)境樣品以確定與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平。不希望受這種理論限制，通過(guò)因素在不同營(yíng)養(yǎng)水平的生物組織中的累積，可發(fā)生與神經(jīng)障礙相關(guān)因素，例如，BMAA的生物放大作用，結(jié)果，消費(fèi)更高營(yíng)養(yǎng)水平的生物可導(dǎo)致比消費(fèi)更低營(yíng)養(yǎng)水平的生物更多地接觸神經(jīng)毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)食物鏈中的多個(gè)環(huán)境樣品，包括蘇鐵科植物珊瑚形根、蘇鐵科植物葉、蘇鐵科植物種子，以及已知食用蘇鐵科植物種子的狐蝠(蝙蝠)的組織樣品。在另一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)食物鏈中的多個(gè)環(huán)境樣品，包括水、水生植物、攝取水或水生植物的食物動(dòng)物，例如魚、鳥、野生動(dòng)物或家畜，以及攝取植食動(dòng)物的食肉動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可檢驗(yàn)多個(gè)環(huán)境樣品以確定是否在特定的食物鏈中發(fā)現(xiàn)了因素如BMAA。檢驗(yàn)多個(gè)環(huán)境樣品后，可比較神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平并分析食物鏈中累積或生物放大作用的證據(jù)。
根據(jù)另一個(gè)方面，除了檢驗(yàn)環(huán)境樣品中與神經(jīng)病相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物外，也檢驗(yàn)受試者的組織樣品。這提供測(cè)定食物鏈中環(huán)境因素(神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物)的累積或生物放大作用，以及將食物鏈每一步中的這些環(huán)境因素的水平與在消費(fèi)食物鏈各種營(yíng)養(yǎng)水平的材料的受試者中神經(jīng)障礙的頻率或嚴(yán)重性聯(lián)系起來(lái)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢驗(yàn)有神經(jīng)障礙的癥狀或診斷為神經(jīng)障礙的受試者的組織樣品中與神經(jīng)病相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，檢驗(yàn)無(wú)神經(jīng)障礙癥狀的受試者的組織樣品中與神經(jīng)病相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物。本發(fā)明的這個(gè)方面提供一種有力的工具，用于將神經(jīng)障礙與接觸已知的或懷疑與神經(jīng)障礙相關(guān)的環(huán)境因素聯(lián)系起來(lái)。如在下面實(shí)施例4中所示，在已知接觸已知的或懷疑含有BMAA的食物來(lái)源后，在死于ALS-PDC的受試者的腦組織中檢測(cè)到BMAA水平提高-即，死于ALS-PDC的受試者是在他們一生中的某些時(shí)間食用傳統(tǒng)查莫羅人飲食的查莫羅人。不希望受這種理論限制，這些結(jié)果與下面實(shí)施例2中所描述的結(jié)果一致，顯示在狐蝠，即一種傳統(tǒng)查莫羅人食物的標(biāo)本中BMAA的濃度很高，從而導(dǎo)致發(fā)明人預(yù)測(cè)消費(fèi)一只狐蝠將導(dǎo)致BMAA的劑量等同于食用174-1,014kg加工過(guò)的蘇鐵科植物粉所獲得的劑量。另外，在一名無(wú)ALS-PDC癥狀并死于其它原因的查莫羅人受試者中檢測(cè)到BMAA水平提高。不希望受這種理論限制，應(yīng)當(dāng)注意到這種結(jié)果與Forman等關(guān)于30名查莫羅人的研究(Forman等，2002，Am J Pathol 1601725-1731)的報(bào)道一致，其在患病(ALS-PDC)和未患病(無(wú)癥狀)的查莫羅人的腦組織中都發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)原纖維纏結(jié)。相反，另一名無(wú)ALS-PDC癥狀并死于其它原因的查莫羅人受試者，在腦組織中沒(méi)有可檢測(cè)到的BMAA水平。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供檢測(cè)由與神經(jīng)障礙相關(guān)的環(huán)境因素導(dǎo)致的環(huán)境污染的方法。令人驚奇地是，在患阿爾茨海默病的非查莫羅人(加拿大人)受試者的腦組織中(見(jiàn)，下面的實(shí)施例)和在患進(jìn)行性核上麻痹(PSP)的非查莫羅人(加拿大人)中發(fā)現(xiàn)BMAA水平提高。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，在這些阿爾茨海默病患者的腦組織中BMAA提高，以及在PSP患者的組織樣品中BMAA提高，表明這些受試者在他們一生中的某些時(shí)間已接觸BMAA的環(huán)境來(lái)源。這些結(jié)果提示可能通過(guò)其它地區(qū)的不同食物鏈發(fā)生藍(lán)細(xì)菌BMAA的生物累積。由于在暴露于神經(jīng)毒素的人群中疾病的頻率是劑量的函數(shù)，所以甚至漸進(jìn)的神經(jīng)障礙的低水平也可能與接觸受藍(lán)細(xì)菌污染的水供應(yīng)中低濃度的BMAA有關(guān)。因此，可進(jìn)行這里所提供的環(huán)境篩選，以調(diào)查BMAA或與神經(jīng)障礙相關(guān)的其它環(huán)境因素的可能的環(huán)境來(lái)源。可進(jìn)行這里所提供的環(huán)境篩選，以預(yù)防或者將其它受試者接觸BMAA或與神經(jīng)障礙相關(guān)的其它環(huán)境因素降到最低，因而降低發(fā)展與BMAA或其它因素相關(guān)的神經(jīng)障礙的風(fēng)險(xiǎn)。
根據(jù)另一個(gè)方面，通過(guò)開發(fā)用于這種因素的測(cè)定和測(cè)定試劑盒，本發(fā)明可用于保護(hù)受試者不接觸與神經(jīng)障礙相關(guān)的環(huán)境因素。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供檢測(cè)食物樣品，包括植物或動(dòng)物物質(zhì)中的BMAA的測(cè)定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供檢測(cè)水供應(yīng)中BMAA的測(cè)定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于篩選環(huán)境中BMAA的測(cè)定試劑盒，其中試劑盒包括實(shí)施本發(fā)明檢測(cè)水供應(yīng)、食物供應(yīng)以及其它環(huán)境樣品的方法的材料，以保護(hù)受試者不接觸BMAA。根據(jù)另一個(gè)方面，可將對(duì)于BMAA的測(cè)定和測(cè)定試劑盒用于公共健康目的，例如，指示水供應(yīng)或食物來(lái)源是否受產(chǎn)生BMAA的藍(lán)細(xì)菌污染。
與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的貯池神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物可在受試者內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源貯池中累積。BMAA是自然來(lái)源的，不同于與神經(jīng)障礙相關(guān)的某些其它環(huán)境因素，例如，汞或PCBs。已在各種組織中發(fā)現(xiàn)了蛋白結(jié)合的BMAA，提示可能在蛋白合成期間摻入或通過(guò)載體蛋白結(jié)合。更早的報(bào)道指出90％注射的BMAA不能從大鼠的尿或糞便中被清除，提示BMAA在受試者中，特別是在哺乳動(dòng)物中累積。這些發(fā)現(xiàn)，結(jié)合與ALS-PDC有關(guān)的潛伏期的流行病學(xué)觀察，提示可隨時(shí)間推移釋放BMAA的內(nèi)源性神經(jīng)毒性貯池，可能作為蛋白代謝的結(jié)果。不希望受這種理論束縛，BMAA貯池可能在受試者中通過(guò)至少五種不同的可能的神經(jīng)病理學(xué)途徑起導(dǎo)致?lián)p害的“慢性毒素”的作用(1)非-蛋白氨基酸如BMAA的摻入可能改變神經(jīng)蛋白的三級(jí)折疊，從而改變它們的生物活性；(2)蛋白結(jié)合的BMAA可能形成共價(jià)結(jié)合金屬離子的二聚體，其將導(dǎo)致蛋白被反應(yīng)性非蛋白氨基酸復(fù)合物打斷，其改變神經(jīng)元細(xì)胞中的離子平衡，產(chǎn)生自由基，或者甚至催化有害的化學(xué)過(guò)程；(3)通過(guò)BMAA復(fù)合物，金屬離子如Zn2+、Cu2+或Ca2+的捕獲和釋放可能干擾NMDA和AMPA受體的正當(dāng)功能；(4)BMAA摻入可能在完成合成前截短蛋白或在從核糖體釋放后折攏蛋白，其中蛋白合成的這種截短是許多tauopathies(NFT障礙)的特征；以及(5)BMAA可在腦中通過(guò)蛋白代謝以游離型緩慢釋放，從而作為AMPA、NMDA和其它神經(jīng)受體的激動(dòng)劑。后一種活性可有效地將一次攝取的或偶爾攝取的BMAA轉(zhuǎn)化成在額上回內(nèi)BMAA長(zhǎng)時(shí)間的、恒定的低水平接觸，從而可能通過(guò)興奮性中毒導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。在病因?qū)W上，這種長(zhǎng)時(shí)間的低水平接觸可能不產(chǎn)生急性疾病，如已經(jīng)在動(dòng)物模型中觀察到的，但是相反可能導(dǎo)致查莫羅人群中以ALS-PDC為代表的潛伏性和漸進(jìn)性的性質(zhì)。內(nèi)源貯池中蛋白結(jié)合的BMAA可能因此是假定的ALS-PDC的“慢性毒素”。
進(jìn)行研究以確定BMAA是否與食物鏈中的蛋白有關(guān)。如在下面的實(shí)施例中所示，通過(guò)從藍(lán)細(xì)菌、蘇鐵科植物種子組織、狐蝠(蝙蝠)毛發(fā)和皮膚以及人腦組織的樣品中除去所有游離氨基酸，來(lái)測(cè)量蛋白結(jié)合的BMAA。除去所有游離氨基酸后，水解蛋白級(jí)分。然后檢測(cè)經(jīng)水解的蛋白的BMAA。在所有檢測(cè)的組織中都發(fā)現(xiàn)了蛋白結(jié)合的BMAA。不希望受這種理論限制，在所有組織中都發(fā)現(xiàn)蛋白結(jié)合的BMAA的這種發(fā)現(xiàn)提示可能在蛋白合成期間摻入，或者通過(guò)與載體蛋白結(jié)合。
這里所公開的結(jié)果表明來(lái)源于藍(lán)細(xì)菌的BMAA在是食物鏈一部分的植物和動(dòng)物組織中累積。具體地，這些結(jié)果顯示藍(lán)細(xì)菌來(lái)源的BMAA在關(guān)島食物鏈中累積，其中其通過(guò)消費(fèi)含BMAA的蘇鐵科植物種子并累積BMAA的狐蝠被生物放大，且當(dāng)查莫羅人食用含有大量BMAA的狐蝠時(shí)可能被進(jìn)一步生物放大，結(jié)果腦組織中BMAA累積與查莫羅人中的ALS-PDC神經(jīng)障礙有關(guān)。
檢測(cè)到BMAA的腦組織顯示細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)、細(xì)胞外神經(jīng)原纖維纏結(jié)和細(xì)胞喪失。在一名Lytico-Bodig(ALS-PDC)患者中，在腦組織中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)未結(jié)合的BMAA，但是從蛋白結(jié)合的級(jí)分回收到超過(guò)1mg/g的BMAA。在所有其它患者中，有大約為從游離氨基酸池中回收的BMAA(游離BMAA)的60-130倍量的蛋白結(jié)合的BMAA。這提示在個(gè)體之間蛋白結(jié)合的BMAA和游離BMAA之間氨基酸流出率有變化，且可能受營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、遺傳傾向、年齡、內(nèi)分泌功能或自發(fā)性差異的支配。不希望受這種理論限制，蛋白結(jié)合的BMAA代表受試者的BMAA貯池，且可能在篩選神經(jīng)障礙中是更有力的指標(biāo)。應(yīng)當(dāng)將蛋白結(jié)合型(例如，在“內(nèi)源神經(jīng)毒性貯池”中)和游離氨基酸池中未結(jié)合型的BMAA的相對(duì)量與神經(jīng)障礙的臨床表現(xiàn)進(jìn)行比較，以確定劑量/持續(xù)時(shí)間的關(guān)系。
在加拿大人阿爾茨海默病患者的腦組織中蛋白結(jié)合的BMAA的發(fā)現(xiàn)，支持在世界的其它地區(qū)中藍(lán)細(xì)菌BMAA的生物累積的另外途徑的可能性。如在表3中所示，在所有六名死于ALS-PDC的查莫羅人患者的額皮質(zhì)組織中都發(fā)現(xiàn)了高水平的蛋白結(jié)合的BMAA(149-1190μg/g)。在六名死于ALS-PDC的查莫羅人患者中，五名患者的額皮質(zhì)組織中也具有高水平的游離BMAA(3-10μg/g)。另外，在一名無(wú)癥狀的，不是死于ALS-PDC的查莫羅人患者中發(fā)現(xiàn)了大量游離的和蛋白結(jié)合的BMAA，與以前顯示無(wú)ALS-PCD的臨床表現(xiàn)，但是當(dāng)尸體解剖時(shí)顯示顯著的神經(jīng)解剖病理學(xué)的查莫羅人的發(fā)現(xiàn)一致。在兩名診斷為患阿爾茨海默病的加拿大人患者死亡時(shí)，在腦皮層的額回中發(fā)現(xiàn)了顯著濃度的BMAA。在同樣的研究中，沒(méi)有診斷為阿爾茨海默病并死于其它原因的十三名加拿大人患者的腦組織，沒(méi)有可檢測(cè)到水平的BMAA。在患阿爾茨海默病的加拿大人患者中BMAA的意外發(fā)現(xiàn)，提示BMAA存在于其它食物鏈中并且可能累積，最后在人受試者中在可隨時(shí)間推移釋放BMAA的貯池中累積，其中阿爾茨海默病是具有不同于ALS-PDC的tau病理學(xué)的障礙。由于沒(méi)有加拿大人阿爾茨海默病患者曾在關(guān)島居住或者消費(fèi)查莫羅人飲食的跡象，所以必須將在他們腦中發(fā)現(xiàn)的MDAA最后追蹤到非蘇鐵科植物來(lái)源。因此，本發(fā)明提供確定接觸與神經(jīng)障礙相關(guān)的環(huán)境因素和所述環(huán)境因素的生物放大的方法，包括鑒定生物放大載體的方法。
抑制神經(jīng)障礙治療和/或預(yù)防根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供在受試者中抑制神經(jīng)障礙的方法。根據(jù)一個(gè)方面，通過(guò)降低與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平來(lái)抑制神經(jīng)障礙。根據(jù)另一個(gè)方面，通過(guò)降低與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的毒性作用來(lái)抑制神經(jīng)障礙。根據(jù)一個(gè)方面，通過(guò)干擾神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物與靶分子的相互作用，來(lái)抑制神經(jīng)障礙。應(yīng)當(dāng)理解的是，可通過(guò)治療一種或多種存在的障礙，或者通過(guò)治療障礙的早期癥狀或病征，或者通過(guò)預(yù)防一種或多種障礙的發(fā)作，或者通過(guò)預(yù)防一種或多種障礙的進(jìn)展(惡化)來(lái)抑制神經(jīng)障礙。
根據(jù)一個(gè)方面，通過(guò)從受試者體內(nèi)內(nèi)源貯池中釋放神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物，可降低神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平。本發(fā)明進(jìn)一步提供將由從內(nèi)源貯池中釋放神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物造成的損害減少到最小的方法，其包括，但不限于，提供神經(jīng)保護(hù)劑化合物，其干擾神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物與靶分子相互作用，或者提供化合物結(jié)合并使神經(jīng)毒性氨基酸或神經(jīng)毒性衍生物失活。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)從內(nèi)源貯池中釋放(“排出”)BMAA，來(lái)抑制神經(jīng)障礙以預(yù)防在受試者中累積。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)BMAA從貯池中釋放時(shí)，向受試者輸注抗BMAA的單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)BMAA從貯池中釋放時(shí)，向受試者輸注作為神經(jīng)保護(hù)劑化合物的谷氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)BMAA從貯池中釋放時(shí)，向受試者輸注金屬螯合劑化合物以吸收釋放的金屬離子。
根據(jù)另一方面，通過(guò)添加干擾神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物與靶分子相互作用的神經(jīng)保護(hù)劑化合物，來(lái)降低與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的毒性效應(yīng)，借此稀釋神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的有效水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)增加谷氨酸(可能離子化成谷氨酸鹽)或谷氨酸同系物的細(xì)胞內(nèi)水平，來(lái)降低BMAA的毒性效應(yīng)，從而稀釋BMAA的有效池并且保護(hù)靶分子。在這個(gè)實(shí)施方案中，谷氨酸或谷氨酸鹽作為神經(jīng)保護(hù)劑化合物起作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，添加螯合劑。
篩選神經(jīng)毒性氨基酸或其衍生物的試劑盒本發(fā)明進(jìn)一步提供篩選患有或有患神經(jīng)障礙風(fēng)險(xiǎn)的受試者的試劑盒，其中該試劑盒包括從受試者中獲得組織樣品的工具和分析組織樣品以確定存在與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的工具。現(xiàn)有技術(shù)中已知獲得組織樣品的工具?，F(xiàn)有技術(shù)中已知分析組織樣品以確定存在神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的工具；這里公開了不受限制的實(shí)施方案。試劑盒可包括測(cè)定存在谷氨酸受體激動(dòng)劑如甲基化丙氨酸，特別是BMAA的工具。試劑盒可包括分析樣品中蛋白結(jié)合的BMAA、游離的BMAA，或者蛋白結(jié)合的BMAA和游離的BMAA兩者的工具。根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明的試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)被測(cè)定的神經(jīng)毒性氨基酸的“對(duì)照”樣品，以便于樣品中被測(cè)定的每種神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的檢測(cè)和定量。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括薄層層析(TLC)板，這樣組織樣品和對(duì)照樣品可被點(diǎn)樣在板上，通過(guò)溶劑遷移分離以及測(cè)定。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，試劑盒可包括分析受試者的多個(gè)組織樣品的工具。在一個(gè)實(shí)施方案中，組織樣品可包括已知累積神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的組織樣品以及已知不累積神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的組織樣品，因此允許確定神經(jīng)毒性氨基酸是否已在某種組織中累積。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組織樣品可包括至少兩個(gè)已知累積神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的不同組織的樣品，從而允許確定不同組織中相對(duì)的累積水平。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，試劑盒可包括進(jìn)行重復(fù)篩選受試者的工具。在一個(gè)實(shí)施方案中，在可延續(xù)幾天、幾個(gè)月或者幾年的重復(fù)的時(shí)間間隔篩選受試者?？稍谏鲜隹v向研究中使用本發(fā)明的試劑盒。
實(shí)施例實(shí)施例1Cycas micronesica Hill中BMAA的公布測(cè)量不同蘇鐵科植物的組織中的BMAA和谷氨酸(GLU)的濃度。也測(cè)量其它已知的含氮神經(jīng)毒素，包括氨基甲酸酯前體DAB、DAP和ODAP(也稱作BOAA)。
測(cè)量從關(guān)島收集的Cycas micronesica Hill的野生種子，以及已知原產(chǎn)于Fairchild Tropical Garden，Montgomery Botanical Center和National Tropical Botanical Garden的Cycas micronesica Hill活標(biāo)本的各種組織中的BMAA、GLU、DAB、DAP和ODAP(BOAA)。因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)BMAA在很老的干燥的哺乳動(dòng)物標(biāo)本中很穩(wěn)定(Banack& Cox，2003)，所以也分析National Tropical Botanical Garden的蠟葉標(biāo)本組織。
根據(jù)Kisby，Roy & Spencer(1988)的技術(shù)，稍作修改，定量蘇鐵科植物組織游離的氨基酸提取物中的BMAA和GLU。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案(Cohen & Michaud，1993)，用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(ACQ)衍生化水性的或三氯乙酸樣品提取物。在37℃，在梯度HPLC系統(tǒng)(Waters 717自動(dòng)注射器，Waters 1525二元溶劑遞送系統(tǒng)和Waters Nova-Pak C18柱，300mm×3.9mm)上通過(guò)反相分離法分離游離氨基酸。用140mM醋酸鈉、5.6mM三乙胺，pH5.2和60％乙腈的梯度洗脫從柱中洗脫單個(gè)化合物(Cohen & Michaud，1993)。BMAA峰和GLU峰的性質(zhì)通過(guò)比較經(jīng)過(guò)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步證實(shí)并且通過(guò)經(jīng)過(guò)修改的梯度洗脫再次證實(shí)。通過(guò)在250nm激發(fā)和在395nm發(fā)射的熒光檢測(cè)(Waters 2487 Dual-1熒光檢測(cè)儀)與同時(shí)在254nm進(jìn)行的UV檢測(cè)(Waters 2488W檢測(cè)儀)，測(cè)定樣品中BMAA和GLU的濃度。ACQ衍生的BMAA的檢測(cè)取決于濃度以及等量BMAA和導(dǎo)致平均反應(yīng)為51.2％的正亮氨酸內(nèi)標(biāo)的比較。這些數(shù)據(jù)可能表示衍生物的內(nèi)淬滅，但是由于在可定量的濃度范圍內(nèi)百分比反應(yīng)一致，所以并不顯著影響樣品定量。通過(guò)經(jīng)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)的濃度梯度，確定檢測(cè)的極限(LOD)和定量的極限(LOQ)。對(duì)于所有測(cè)定每次注射的LOD和LQD分別是0.00013微摩爾和0.013微摩爾。如在下面表1中所示，為了數(shù)據(jù)解釋的目的，在LOQ的范圍內(nèi)對(duì)所有樣品分析進(jìn)行定量，或者報(bào)告為不存在。也使用對(duì)于DAB(2，4-二氨基丁酸)、DAP(2，3-二氨基丙酸)和BOAA(β-N-草酰-氨基-L-丙氨酸)的經(jīng)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)鑒定對(duì)應(yīng)的HPLC峰中是否存在或不存在這些化合物，但是不嘗試定量它們的濃度。使用Breeze科學(xué)軟件(Trinity Consultants Inc.，Dallas TX)控制系統(tǒng)操作和采集并分析數(shù)據(jù)。
如在表1中所示，在各種蘇鐵科植物組織中存在BMAA和GLU，也存在對(duì)應(yīng)于神經(jīng)毒素DAB、DAP和BOAA的化合物。在所有組織中都發(fā)現(xiàn)GLU的量大大高于BMAA。
為了比較的目的，通過(guò)將每個(gè)分子的濃度除以發(fā)現(xiàn)的最大濃度，使BMAA和GLU的相對(duì)濃度歸一化(圖1)。在植物生殖組織中發(fā)現(xiàn)BMAA的濃度最高。在所有檢測(cè)的組織中GLU的濃度相似，并且顯示沒(méi)有清楚的分布模式。盡管GLU似乎分布于整個(gè)植物中而沒(méi)有任何明顯的模式，但是BMAA集中于雄性和雌性的生殖組織中，其可能作為食草的拒食劑。漿果皮外層中高濃度的BMAA表明以蘇鐵科植物漿果皮為飼料的動(dòng)物(例如狐蝠)隨著時(shí)間的推移將接觸高累積劑量的BMAA。在蘇鐵科植物組織的多個(gè)部分檢測(cè)到包括BOAA、DAB、DAP的其它神經(jīng)毒性化合物，但沒(méi)有定量(表1)。
實(shí)施例2關(guān)島狐蝠(蝙蝠)中蘇鐵科植物神經(jīng)毒素的生物放大作用測(cè)量關(guān)島Cycas micronesica Hill組織、以及馬里亞那狐蝠(Pteropus mariannus mariannus)(一種關(guān)島本地的狐蝠(蝙蝠))組織中的BMAA水平。由于馬里亞那狐蝠現(xiàn)在瀕臨滅絕，所以測(cè)量三只狐蝠的博物館標(biāo)本的皮膚組織的BMAA水平，其是五十年前在關(guān)島收集的，作為干燥的研究皮膚保藏的，并且儲(chǔ)藏在University ofCalifornia，Berkeley脊椎動(dòng)物學(xué)博物館(Museum of VertebrateZoology)(MVZ)。
分析從關(guān)島收集的Cycas micronesica Hill種子，以及從關(guān)島收集的經(jīng)過(guò)加工的(洗滌過(guò)的，去毒的)蘇鐵科植物粉標(biāo)本(Dr.J.C.Steele，1987-1988)的樣品中的BMAA含量。查莫羅人對(duì)蘇鐵科植物粉的傳統(tǒng)制備方法包括將Cycas Micronesia Hill種子的配子體浸泡約3周，每2-3天換一次水。
使用高效液相層析(HPLC)檢測(cè)BMAA，且結(jié)果用薄層層析(TLC)和氣相層析-質(zhì)譜分析法(GC-MS)證實(shí)。對(duì)于BMAA分析，制備狐蝠和蘇鐵科植物組織的游離氨基酸提取物。將組織樣品用水或三氯乙酸再水化30分鐘(平均組織制劑80mg/ml±32SD)、浸軟以及過(guò)濾。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(ACQ)衍生化提取物。在37℃，在梯度HPLC系統(tǒng)(Waters717自動(dòng)注射器，Waters 1525二元溶劑遞送系統(tǒng)和Waters Nova-Pak C18柱，300mm×3.9mm)上通過(guò)反相分離法分離游離氨基酸。用140mM醋酸鈉、5.6mM三乙胺，pH5.2(流動(dòng)相A)和60％乙腈(流動(dòng)相B)的梯度洗脫，以1.0ml/分鐘的流速?gòu)闹邢疵搯蝹€(gè)化合物。9個(gè)梯度條件如下最初＝100％A，2.0分鐘90％A曲線11，5.0分鐘＝86％A曲線11，10.0分鐘＝86％A曲線6，18.0分鐘＝73％A曲線6，30.0分鐘＝60％A曲線10，35.0分鐘＝40％A曲線6，39.0分鐘＝10％A曲線6，隨后用100％B洗滌5分鐘并用100％A再次平衡5分鐘。BMAA峰的特征通過(guò)與商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(Sigma B-107；＞94％純度)進(jìn)行比較進(jìn)行證實(shí)并通過(guò)經(jīng)修改的梯度洗脫再次證實(shí)。使用Waters 2487Dual-1熒光檢測(cè)儀，在250nm激發(fā)和在395nm發(fā)射，通過(guò)熒光標(biāo)簽測(cè)定樣品中BMAA的濃度。ACQ衍生化的BMAA的檢測(cè)取決于濃度，并通過(guò)將等量BMAA和導(dǎo)致平均反應(yīng)為51.2％的正亮氨酸內(nèi)標(biāo)(代表一個(gè)中間范圍的濃度)進(jìn)行比較，來(lái)完成定量。這些數(shù)據(jù)表示幾個(gè)試驗(yàn)值的平均反應(yīng)并且描述衍生化方案的效率以及BMAA和內(nèi)標(biāo)之間的相對(duì)比率。結(jié)果可能表示所衍生化的化合物的內(nèi)淬滅，但是由于百分比反應(yīng)在可定量的濃度范圍內(nèi)一致，所以不顯著影響樣品定量。通過(guò)經(jīng)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的濃度梯度，測(cè)定檢測(cè)的極限(LOD，定義為樣品中盡管不必定量但可被檢測(cè)到的分析物的最小濃度)和定量的極限(LOQ，將吸光度與濃度聯(lián)系起來(lái)的校準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)的濃度)。對(duì)于所有分析，每次注射LOD是0.00013微摩爾，每次注射LOQ是0.013微摩爾。為了數(shù)據(jù)解釋，將所有的樣品分析在LOQ的范圍內(nèi)定量或者報(bào)告為沒(méi)有檢測(cè)到(ND)(表1)。使用Breeze科學(xué)軟件(Trinity Consultants Inc.，Dallas TX)控制系統(tǒng)操作以及收集并分析數(shù)據(jù)。
為了證實(shí)HPLC級(jí)分中BMAA的特征，使用HPLC級(jí)分和BMAA標(biāo)準(zhǔn)(BMAA，Sigma B-107；Methionine，Aldrich 15，169-6)進(jìn)行TLC。簡(jiǎn)單地說(shuō)，收集并匯集經(jīng)衍生化的標(biāo)準(zhǔn)和組織樣品的0.5分鐘HPLC級(jí)分，然后在Savant speed-vac濃縮器中濃縮并在TLC板的槽上點(diǎn)樣。使用玻璃支持的250μm分析層硅膠板(20×20cm)，60ml丁醇15ml冰醋酸25ml 0.5N NaCl的流動(dòng)相進(jìn)行TLC。干燥后，用365nm紫外光顯現(xiàn)板上的BMAA。最后，對(duì)于Sigma標(biāo)準(zhǔn)化合物和從狐蝠(蝙蝠)組織(MVZ 114607)中分離的樣品，含有鑒定為BMAA峰的HPLC級(jí)分的GC-MS證實(shí)存在02.1m/z的BMAA。
表2蘇鐵科植物，蘇鐵科植物粉和狐蝠樣品中的BMAA
如在表2中所示，狐蝠皮膚組織所含BMAA的量提高(1,287到7,502μg/g)，相反蘇鐵科植物種子漿果皮中的平均BMAA濃度為9μg/g。然而，種子的最外層珠被具有最多達(dá)2,657μg/g的特別高濃度的BMAA。這些結(jié)果顯示在狐蝠(蝙蝠)組織的50年長(zhǎng)的博物館標(biāo)本中BMAA很豐富，證明消費(fèi)這種曾很豐富的狐蝠物種的查莫羅人不知不覺(jué)地?cái)z入了高劑量的BMAA。例如，消費(fèi)MVZ狐蝠標(biāo)本#114607，假設(shè)鮮重500克并且BMAA在整個(gè)標(biāo)本中均勻分布，導(dǎo)致攝入3,751毫克BMAA，其相當(dāng)于消費(fèi)1,014kg經(jīng)過(guò)加工的蘇鐵科植物粉。表2進(jìn)一步顯示蘇鐵科植物粉樣品中BMAA濃度與所公開報(bào)道的比較值。表2中值的差異反映不同的提取方法，分析方法學(xué)中的差異以及對(duì)于BMAA回收的效率不做調(diào)整的值。
實(shí)施例3藍(lán)細(xì)菌神經(jīng)毒素BMAA的藍(lán)細(xì)菌來(lái)源定量200毫克從Cycas micronesia Hill的感染的珊瑚形的根、蘇鐵科植物組織；滿江紅屬(Azolla)植物(在Hanapepe，Kauai附近收集的)；根乃拉草屬(Gunnera)植物(從Mt.Wailaleale，Kauai收集的)中分離的活躍生長(zhǎng)的藍(lán)細(xì)菌樣品中的BMAA。將所有樣品在0.1N三氯醋酸中勻漿兩次并以15,800xg離心3分鐘以沉淀蛋白并提取游離氨基酸。在氮?dú)庀?，通過(guò)將沉淀物在6N HCl中水解24小時(shí)，釋放蛋白結(jié)合的BMAA，隨后通過(guò)離心和超濾除去沉淀。然后冷凍干燥水解提取物的等分試樣以使其完全干燥，并在20mM HCl中重懸用于衍生化。將樣品提取物用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯衍生化，并通過(guò)上述HPLC分離法對(duì)氨基酸進(jìn)行定量。
通過(guò)液相層析質(zhì)譜分析法(LC-MS)，其中使用偶聯(lián)可變波長(zhǎng)二極管陣列檢測(cè)儀(DAD)，以及使用電噴射離子化界面(ESI)具有氣壓流電離源(API)的SL單一四極MS的Agilent 1100 HPLC，來(lái)證實(shí)樣品中存在BMAA，以及HPLC級(jí)分中BMAA峰的特征和純度。將化合物在于30℃加熱的Waters SymetryShield RP 18柱上，用溶于水的CH3CN的線性梯度洗脫(10 40％)進(jìn)行分離。將氮?dú)饧兓⑻峁┑骄哂徐F化壓為35磅/英寸2(psi)的ESI界面，并使用兩種不同模式檢測(cè)MS內(nèi)的化合物。DAD使用具有200 600nm的全部光譜掃描和在半微量流動(dòng)室內(nèi)0.5nm分辨率在254nm檢測(cè)化合物。在具有100 600Da范圍，50V碰撞解離(fragmentor)電壓，增益為1.0V的陽(yáng)性掃描模式中，測(cè)定最初的信號(hào)。在具有停留時(shí)間為45毫秒和70V碰撞解離電壓的陽(yáng)性離子模式中，通過(guò)選擇性離子監(jiān)控(SIM)鑒定BMAA。對(duì)于兩種信號(hào)，毛細(xì)管電壓是4kV，電子倍增器電壓增益是4V。周期時(shí)間是0.82秒/周期，對(duì)兩個(gè)MS信號(hào)中的每一個(gè)分離50％。
BMAA的藍(lán)細(xì)菌來(lái)源從在National Tropical Botanical Garden，Kalaheo，Kauai中生長(zhǎng)的三個(gè)登記的標(biāo)本(已知原產(chǎn)地的憑證標(biāo)本)中收獲的，Cycasmicronesica Hill的感染的珊瑚形根中分離藍(lán)細(xì)菌的共生生物，并將其培養(yǎng)成具有重復(fù)傳代的純性培養(yǎng)物。為了分析受藍(lán)細(xì)菌的共生生物感染的蘇鐵科植物根組織，通過(guò)將表面滅菌的根浸在70％的乙醇溶液中3分鐘，隨后在含有兩滴表面活性劑的1.6％次氯酸鈉中浸30分鐘以及用無(wú)菌去離子水順序洗滌3次，從Cycas micronesica Hill的根組織中除去土壤傳播的細(xì)菌。切除表面滅菌的根外植體(1-2cm長(zhǎng))并在pH7.1，用gellam膠(Sigma)凝固的標(biāo)準(zhǔn)BG-11培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在具有16小時(shí)光周期，光強(qiáng)度為35-45μmole/m2/s以及溫度為25-30℃的受控環(huán)境室中培養(yǎng)根外植體培養(yǎng)物。培養(yǎng)7-10天后，清楚可見(jiàn)根外植體的藍(lán)細(xì)菌共生生物群體的增殖。單個(gè)藍(lán)細(xì)菌群體的連續(xù)傳代培養(yǎng)確保根組織不存在殘余的BMAA。為了評(píng)價(jià)氨基酸對(duì)藍(lán)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，向BG-11培養(yǎng)基補(bǔ)充谷氨酸或谷氨酰胺(0、126、或250μmol/L)；通過(guò)補(bǔ)充了這些氨基酸，藍(lán)細(xì)菌的生長(zhǎng)增加了兩倍。在化學(xué)分析前進(jìn)行培養(yǎng)物純度的組織學(xué)驗(yàn)證。藍(lán)細(xì)菌群體似乎普遍缺乏異形囊胞，并且觀察到繁殖性絲狀生長(zhǎng)。
結(jié)果.在無(wú)感染的蘇鐵科植物根中沒(méi)有檢測(cè)到BMAA，但是BMAA在受藍(lán)細(xì)菌共生生物念珠藻屬感染的珊瑚形根中很豐富，其中輕微感染的珊瑚形的根具有37μg/g BMAA，而嚴(yán)重感染的珊瑚形根具有2μg/g BMAA。發(fā)現(xiàn)從珊瑚形根分離的念珠藻屬的純性培養(yǎng)物具有0.3μg/g的BMAA。在無(wú)根蘇鐵科植物組織中，BMAA集中在蘇鐵科植物種子中(其被狐蝠食用)，在肉質(zhì)漿果皮中BMAA為9μg/g，而在漿果皮的外珠被層中BMAA最多達(dá)2,657μg/g。也見(jiàn)表1中的結(jié)果。
對(duì)兩種具有藍(lán)細(xì)菌共生生物的不相關(guān)的植物物種進(jìn)行另外的研究以確定藍(lán)細(xì)菌共生生物是否是植物宿主中BMAA的來(lái)源。細(xì)葉滿江紅(Azolla filiculoides)，一種有藍(lán)細(xì)菌共生生物的稻田中的漂浮蕨類，具有2μg/g BMAA。Gunnera kauaiensis，一種有藍(lán)細(xì)菌共生生物的大葉被子植物，在葉柄組織中具有4μg/g BMAA。蛋白沉淀中BMAA的水平(蛋白結(jié)合的BMAA)為定量為游離氨基酸的BMAA的水平的約240倍。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)可在許多環(huán)境中發(fā)現(xiàn)藍(lán)細(xì)菌來(lái)源的BMAA，并且其可能在許多食物鏈中被攝取。
實(shí)施例4腦組織中的BMAA測(cè)量八(8)名關(guān)島查莫羅人患者和十五(15)名加拿大人患者的大腦額上回的200mg樣品中的BMAA水平。組織由University ofBritish Columbia，Vancouver，B.C.，加拿大的Patrick McGeer博士提供。在15％緩沖的蔗糖維持溶液中貯藏前，將患者的尸體解剖組織在低聚甲醛中固定，其中死亡和尸體解剖之間的時(shí)間間隔從4小時(shí)到5天不等。以前已經(jīng)公開了查莫羅人患者的家族關(guān)系、臨床病史以及組織化學(xué)特征(McGeer等，1997，Neurology 49，400-409)。另外，提供加拿大人患者的尸體解剖組織，其包括兩(2)名死前臨床診斷為阿爾茨海默病的加拿大人患者，以及十三(13)名死于自然原因而不是進(jìn)行性神經(jīng)變性病的加拿大人患者的兩個(gè)樣品。
將組織在0.1N三氯醋酸中勻漿兩次并以15,800xg離心3分鐘，以沉淀蛋白并提取游離氨基酸。通過(guò)將沉淀在持續(xù)沸騰的6N HCl中在110℃水解24小時(shí)，釋放蛋白結(jié)合的BMAA。在15,800xg通過(guò)超濾(Ultrafree-MC，Millipore Corp.)從500μl等分試樣中除去微粒物質(zhì)，并將得到的提取物進(jìn)行冷凍干燥。將氨基酸在20mM HCl中重懸，加到用100％甲醇、溶于水的50％甲醇以及增長(zhǎng)量為20％的硼酸鹽緩沖液乙腈(0.5 M硼酸鹽0-60％ CH3CN)梯度的順序洗滌平衡的Sep-Pac C18柱體上。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯衍生化樣品提取物中的BMAA(Banack等，2003，Neurology 61387-389)。氨基酸通過(guò)上述HPLC分離法(實(shí)施例3)定量。通過(guò)液相層析質(zhì)譜分析法(LC-MS)，其中使用偶聯(lián)可變波長(zhǎng)二極管陣列檢測(cè)儀(DAD)，以及使用電噴射離子化界面(ESI)具有氣壓流電離源(API)的SL單一四級(jí)MS的Agilent 1100 HPLC，來(lái)證實(shí)樣品中存在BMAA，以及HPLC級(jí)分中BMAA峰的特征和純度。將化合物在于30℃加熱的Waters SymetryShield RP 18柱上，用溶于水的CH3CN的線性梯度洗脫(10 40％)進(jìn)行分離。將氮?dú)饧兓⑻峁┑骄哂徐F化壓為35磅/英寸2的ESI界面，并使用兩種不同模式檢測(cè)MS內(nèi)的化合物。DAD使用具有200 600nm全部光譜掃描和在半微量流動(dòng)室內(nèi)0.5nm分辨率在254nm檢測(cè)化合物。在50V碰撞解離電壓具有100 600Da范圍的陽(yáng)性掃描模式中，測(cè)定最初的信號(hào)。使用已證實(shí)分子的離子峰的提取的離子層析譜鑒定BMAA。
結(jié)果.如在表3中所示，在所有六名死于ALS-PDC的查莫羅人患者的額皮質(zhì)組織中都發(fā)現(xiàn)高水平的蛋白結(jié)合的BMAA(149-1190μg/g)。在六名死于ALS-PDC的查莫羅人患者中，五名患者的額皮質(zhì)<p>[表1]
權(quán)利要求
1.一種篩選患有或有患神經(jīng)障礙風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法，其包括分析受試者的組織樣品以確定與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物是谷氨酸受體激動(dòng)劑。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述谷氨酸受體激動(dòng)劑是甲基化的丙氨酸。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述甲基化的丙氨酸是β-N-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中分析蛋白結(jié)合的BMAA。
6.權(quán)利要求5的方法，其中也分析游離的BMAA。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者具有神經(jīng)障礙的癥狀。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者無(wú)神經(jīng)障礙的癥狀。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者已被鑒定為具有發(fā)展成神經(jīng)障礙的風(fēng)險(xiǎn)。
10.權(quán)利要求1的方法，其中可檢測(cè)到水平的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的存在表明患有神經(jīng)障礙。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)障礙是神經(jīng)原纖維纏結(jié)障礙(NFT障礙)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述神經(jīng)障礙是肌萎縮性側(cè)索硬化癥-帕金森癡呆復(fù)征(ALS-PDC)。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述神經(jīng)障礙是阿爾茨海默病。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述神經(jīng)障礙是進(jìn)行性核上麻痹。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)障礙是運(yùn)動(dòng)障礙。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述運(yùn)動(dòng)障礙是帕金森病。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)障礙是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病是肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述篩選方法預(yù)測(cè)發(fā)展成神經(jīng)病的可能性。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述方法進(jìn)一步預(yù)測(cè)神經(jīng)障礙發(fā)作前的潛伏期。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述篩選方法預(yù)測(cè)神經(jīng)障礙的嚴(yán)重性。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述組織樣品是神經(jīng)組織。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述神經(jīng)組織是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)有關(guān)的組織。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述組織是腦組織。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述組織是腦脊液(CSF)。
26.權(quán)利要求22的方法，其中所述神經(jīng)組織是與周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)有關(guān)的組織。
28.權(quán)利要求1的方法，其中所述組織是非神經(jīng)組織。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述組織是角質(zhì)組織。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述組織是毛發(fā)。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述組織是皮膚。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述組織是指甲。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述指甲是手指甲。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述指甲是腳趾甲。
35.權(quán)利要求29的方法，其中所述組織是羽毛。
36.權(quán)利要求29的方法，其中所述組織是爪。
37.權(quán)利要求29的方法，其中所述組織是蹄。
38.權(quán)利要求29的方法，其中所述組織是角。
39.權(quán)利要求28的方法，其中所述組織是非角質(zhì)組織。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述組織是血液。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述組織是血清。
42.權(quán)利要求39的方法，其中所述組織是唾液。
43.權(quán)利要求39的方法，其中所述組織是尿液。
44.一種篩選環(huán)境樣品以確定環(huán)境樣品是否與神經(jīng)障礙相關(guān)的方法，其包括分析環(huán)境樣品以確定與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的存在。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物是谷氨酸受體激動(dòng)劑。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述谷氨酸受體激動(dòng)劑是甲基化的丙氨酸。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述甲基化的丙氨酸是BMAA。
48.權(quán)利要求44的方法，其中所述環(huán)境樣品是水。
49.權(quán)利要求44的方法，其中所述環(huán)境樣品是食物產(chǎn)品。
50.一種篩選環(huán)境樣品以確定所述樣品是否與神經(jīng)障礙相關(guān)的方法，其包括檢測(cè)環(huán)境樣品中產(chǎn)生神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的藍(lán)細(xì)菌。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物是谷氨酸受體激動(dòng)劑。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述谷氨酸受體激動(dòng)劑是甲基化的丙氨酸。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述甲基化的丙氨酸是BMAA。
54.權(quán)利要求50的方法，其中所述藍(lán)細(xì)菌來(lái)自念珠藻屬。
55.權(quán)利要求50的方法，其中所述藍(lán)細(xì)菌來(lái)自魚腥藻屬。
56.權(quán)利要求50的方法，其中所述環(huán)境樣品是水。
57.權(quán)利要求50的方法，其中所述環(huán)境樣品是食物產(chǎn)品。
58.一種在受試者中抑制神經(jīng)障礙的方法，其包括降低與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的水平。
59.權(quán)利要求58的方法，其中從受試者中的內(nèi)源貯池中釋放神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物是谷氨酸受體激動(dòng)劑。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述谷氨酸受體激動(dòng)劑是甲基化的丙氨酸。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述甲基化的丙氨酸是BMAA。
63.一種在受試者中抑制神經(jīng)障礙的方法，其包括提高神經(jīng)保護(hù)劑化合物的細(xì)胞濃度，所述化合物阻斷與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物與靶分子之間的相互作用。
64.權(quán)利要求63的方法，其中所述神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物是谷氨酸受體激動(dòng)劑。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述谷氨酸受體激動(dòng)劑是甲基化的丙氨酸。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述甲基化的丙氨酸是BMAA。
67.權(quán)利要求63的方法，其中所述神經(jīng)保護(hù)劑化合物是谷氨酸。
68.權(quán)利要求63的方法，其進(jìn)一步包括施用神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的結(jié)合劑。
69.權(quán)利要求63的方法，其進(jìn)一步包括施用螯合劑。
70.一種篩選患有或者有患神經(jīng)障礙風(fēng)險(xiǎn)的受試者的試劑盒，其包括分析組織樣品以確定與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的存在的工具。
71.權(quán)利要求70的試劑盒，其中所述神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物是谷氨酸受體激動(dòng)劑。
72.權(quán)利要求71的試劑盒，其中所述谷氨酸受體激動(dòng)劑是甲基化的丙氨酸。
73.權(quán)利要求72的試劑盒，其中所述甲基化的丙氨酸是BMAA。
74.權(quán)利要求70的試劑盒，其中測(cè)定蛋白結(jié)合的BMAA。
75.權(quán)利要求70的試劑盒，其中測(cè)定游離的BMAA。
76.權(quán)利要求70的試劑盒，其進(jìn)一步包括用作對(duì)照的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的樣品。
全文摘要
公開了篩選神經(jīng)障礙的方法。特別是，公開了通過(guò)分析從受試者中獲得的組織樣品中水平提高的與神經(jīng)障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性氨基酸或其神經(jīng)毒性衍生物的存在，在受試者中篩選神經(jīng)障礙的方法。具體地，公開了通過(guò)測(cè)定從受試者中獲得的組織樣品中β－N－甲氨基－L－丙氨酸(BMAA)的水平，在受試者中診斷神經(jīng)障礙，或者在受試者中預(yù)測(cè)發(fā)展成神經(jīng)障礙的可能性的方法。公開了篩選與神經(jīng)障礙相關(guān)的環(huán)境因素的方法。公開了抑制、治療或預(yù)防神經(jīng)障礙的方法。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1860369SQ200380110515
公開日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2003年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月12日
發(fā)明者P·A·科克斯, S·巴納克, S·穆?tīng)柶?申請(qǐng)人:種族醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)