專利名稱：磷酸單酯化合物分子量的求得方法及質(zhì)譜測定用的添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含于生物體試樣等中的磷酸單酯化合物分子量的求得方法及在該方法中使用的質(zhì)譜測定用的添加劑。
背景技術(shù)：
某種生物體內(nèi)的酶，在以活性中心為代表的特定部位上具有絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基，它們的羥基由被稱為激酶的酶進行磷酸化(磷酸單酯化)或脫磷酸化來調(diào)節(jié)其酶活性。也有的酶是通過賴氨酸、精氨酸、組氨酸的氮及天冬氨酸、谷氨酸的羧基被磷酸化(或脫磷酸化)來調(diào)節(jié)其酶活性。
作為上述藉由磷酸化—脫磷酸化調(diào)節(jié)的代謝系統(tǒng)，熟知的是糖原合成的抑制及其分解系統(tǒng)。該代謝系統(tǒng)主要由磷酸化—脫磷酸化進行級聯(lián)控制及調(diào)節(jié)。
近年來，明顯的是，上述磷酸化—脫磷酸化在有關(guān)疾病的代謝系統(tǒng)中具有重要的作用。
例如，對于細胞的癌變，磷酸化—脫磷酸化的異常被認為是一個原因。即，細胞周期的進行及停止由各種各樣的酶(蛋白質(zhì))的磷酸化(或脫磷酸化)控制，上述磷酸化與周期素及依賴周期素的激酶(CDK)有關(guān)。但如果上述功能受到損傷，則磷酸化(或脫磷酸化)發(fā)生紊亂，其結(jié)果引發(fā)細胞的增殖異常。
其他，明顯的是，蛋白激酶C與作為特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis)及花粉癥(pollenallergy)等過敏性疾病原因的組胺的脫顆粒(degranulation)有關(guān)，及發(fā)生于阿耳茨海默病患者的腦中的神經(jīng)原纖維變化(neurofibrillary tangle)也源于磷酸化的T型蛋白質(zhì)(tau protein)。
因此，若能把握生物體試樣中的哪一種酶(蛋白質(zhì))被磷酸化(或脫磷酸化)，則不僅有利于對生物體組織細胞的基因的發(fā)現(xiàn)的探索及酶活性的評價，也可能有利于疾病的診斷、治療。
可是，以往使用的磷酸化蛋白質(zhì)(或脫磷酸化蛋白質(zhì))的檢測方法存在各種缺陷。
例如，酶免疫法雖然具有即使作為對象的蛋白質(zhì)試樣微量也可進行分析的優(yōu)點，但要獲得足夠量的必要的抗體卻有困難，另外，對象蛋白質(zhì)在幾個kDa以下時，無法配制結(jié)合于蛋白質(zhì)中的磷酸化部位的抗體。
又，有人考慮藉由由放射性同位素32P所標記的磷酸的使用，來檢測對蛋白質(zhì)的特異結(jié)合的方法，但使用該方法理所當(dāng)然地必須注意放射性同位素的處理，對其廢液的管理、處理等也有要求。
再有，磷酸化蛋白質(zhì)和脫磷酸化蛋白質(zhì)的電荷不同，因此，也有人考慮應(yīng)用二維電泳法。然而，在對生物體試樣進行分析的場合，試樣中含有多種類的蛋白質(zhì)，由此，也使得斑點的鑒定非常困難。而且，為了斑點的鑒定而使用放射性同位素，則會發(fā)生如上所述的問題。
另外，下列非專利文獻1(Yashiro Morio等二人，”Preparation and Study of DinuclearZinc(II)complex for the Efficient Hydrolysis of the Phosphodiester Linkage in aDiribonucleotide″，《Journal ofthe chemical Socicty，Chemical communications》，P.1793-1794(1995年))中記載了鋅的配位化合物。該鋅配位化合物中的兩個鋅離子具有作用于二核苷酸中的磷酸根，并切斷該酸根的功能。然而，非專利文獻1中的該配位化合物的功能主要是用作催化劑的，有關(guān)與磷酸根的配位結(jié)合能，未作任何記載。實際上，根據(jù)本發(fā)明人的實驗，該配位化合物和兩個核苷之間的磷酸根(磷酸二酯基)的離解常數(shù)非常大。即，該配位化合物對磷酸二酯基的配位結(jié)合能很低。
另外，下列非專利文獻2(Hidekazu Arii等六人，”A novel diiron coplex as a functionalModel for hemerythrin″，《Journal of Inorganic Biochemistry》，第82卷，P.153-162(2000年))中也記載了具有類似于上述鋅配位化合物結(jié)構(gòu)的鐵的配位化合物。但是，所述鐵的配位化合物是作為氧分子的傳輸?shù)鞍踪|(zhì)的蚯蚓血紅蛋白(hemerythrin)的模型合成的。有關(guān)該鐵配位化合物與磷酸單酯基的配位結(jié)合能未作任何記載，也未作任何啟示，這一點如同上述非專利文獻1。
本發(fā)明者們已經(jīng)開發(fā)了一種鑒定具有磷酸單酯基的肽等的方法。在該技術(shù)中，利用與磷酸單酯基等的陰離子取代基特有地配位結(jié)合的配位化合物，例如對使該配位化合物作用的試樣和未使該配位化合物作用的試樣進行質(zhì)譜比較，能夠得到與磷酸單酯基結(jié)合的化合物的信息。也就是說，因為與該配位化合物結(jié)合的化合物和未與該配位化合物結(jié)合的化合物，應(yīng)該只在配位化合物部分的分子離子峰的值不同，所以能夠知道含有磷酸單酯基的化合物的分子量。
可是，單一試樣(精制的試樣)暫且不說，在含有多個化合物的混合試樣的分析中，即使放大記錄，也不能鑒定到目的分子離子峰。也就是，在質(zhì)譜中，因為構(gòu)成化合物的原子的同位體分布使離子峰的表現(xiàn)方式不同，所以，在與該配位化合物結(jié)合的化合物和未與該配位化合物結(jié)合的化合物之間，分子離子峰的表現(xiàn)方式不同，峰的鑒定困難。

發(fā)明內(nèi)容
在上述狀況之下，本發(fā)明所要解決的課題在于提供一種磷酸單酯化的化合物(蛋白質(zhì)和糖類等)的分子量的容易的鑒定方法，根據(jù)該方法，即使是含有多個化合物的生物體試樣，也能容易地從中鑒定磷酸單酯化的化合物(蛋白質(zhì)和糖類等)的分子量。
并且，根據(jù)本發(fā)明，其課題也在于提供一種能使用于上述方法中的質(zhì)譜測定用的添加劑。
為了解決所述課題，本發(fā)明者們對于已完成開發(fā)、顯示了相對磷酸單酯基高的結(jié)合能的金屬配位化合物進行進一步刻意研究，發(fā)現(xiàn)使配位有單一的鋅同位體的配位化合物作用于受檢試樣，取得多個質(zhì)譜測定結(jié)果，對這些進行比較的話，能夠容易地鑒定磷酸單酯化合物的分子量，由此完成了本發(fā)明。
也就是，本發(fā)明有關(guān)的磷酸單酯化合物的分子量的求得方法，其特征在于，所述方法包括(1)將含有由單一的鋅同位體構(gòu)成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物和受檢試樣在溶劑中混合，配成溶液后，對所述溶液進行質(zhì)譜測定的工序； 式中，R1～R4表示氫原子或取代基，(2)將含有由與上述同位體不同的單一的鋅同位體構(gòu)成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物和受檢試樣在溶劑中混合，配成溶液后，對所述溶液進行質(zhì)譜測定的工序；(3)通過對上述質(zhì)譜測定結(jié)果進行比較，求得磷酸單酯化合物的分子量的工序。
在上述方法中，在受檢試樣含有磷酸單酯化合物的情況下，在兩個質(zhì)譜中存在出現(xiàn)在不同位置上的分子離子峰。將其兩個分子離子峰進行比較，作為化合物(1)，除鋅同位體之外基本骨架相同的場合，只在使用的兩個鋅同位體的分子量差為2倍的值(在對于1個分子的磷酸單酯化合物存在多個磷酸單酯基的場合，該值為再乘上該多個磷酸單酯基數(shù)的值)的部分位置錯移，且兩峰具有大致相同的形狀，由此，能夠容易地鑒定磷酸單酯化的化合物的分子離子峰，且能求出分子量。
作為上述配位化合物(1)，理想的是，R1～R4全都是氫原子。因為在化合物(1)中結(jié)構(gòu)最簡單而容易制造，并且分子離子峰更簡單化。
又，本發(fā)明的質(zhì)譜測定用的添加劑，用于求出磷酸單酯化合物的分子量，其特征在于，所述質(zhì)譜測定用的添加劑含有一種試劑，含有由單一的鋅同位體構(gòu)成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物；以及另一種試劑，含有由與所述同位體不同的單一的鋅同位體構(gòu)成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物。
式中，R1～R4表示氫原子或取代基。
作為所述配位化合物，適合的是，R1～R4全都是氫原子。這還是因為，其結(jié)構(gòu)最簡單，容易制造。
作為上述配位化合物，理想的是，化合物(1)與乙酸離子進一步形成配位化合物。因為其比未與乙酸離子配位的化合物穩(wěn)定而易于保存，還因為若加入受檢試樣和該配位化合物，磷酸單酯基能夠與乙酸離子進行交換配位，與未與乙酸離子配位的化合物相同，能夠檢測磷酸單酯化合物。
作為所述試劑，理想的是呈鹽的狀態(tài)。因為在保存穩(wěn)定性方面優(yōu)良。又，合適的是溶液狀態(tài)。因為通過將其添加在試樣溶液中或?qū)⒃嚇犹砑釉谔砑觿┤芤褐?，這樣就能夠直接作成質(zhì)譜測定用的試樣。


圖1是本發(fā)明的配位化合物的1H NMR測定結(jié)果；圖2是本發(fā)明的配位化合物的IR測定結(jié)果；圖3是受檢試樣和天然同位體鋅配位化合物的復(fù)合體的質(zhì)譜，由于多個鋅同位體的存在，峰變得復(fù)雜化；圖4是受檢試樣和64Zn鋅配位化合物的復(fù)合體的質(zhì)譜，因其所含的鋅是單一的同位體，所以與天然同位體鋅配位化合物相比，峰更簡單化；圖5是受檢試樣和68Zn鋅配位化合物的復(fù)合體的質(zhì)譜，與圖4相同，比起使用天然同位體鋅配位化合物的場合，峰更簡單化；圖6是受檢試樣和64Zn鋅配位化合物的復(fù)合體的質(zhì)譜；圖7是受檢試樣和68Zn鋅配位化合物的復(fù)合體的質(zhì)譜，通過與圖6的比較，能夠求出磷酸單酯化合物的分子量。
具體實施例方式
本發(fā)明擁有的一個最大特征是，使用含有分子量分別不同的鋅同位體的二個配位化合物，通過比較分別與不同的配位化合物配位的試樣的質(zhì)譜，能夠容易地確認含于受檢試樣中的磷酸單酯化合物的存在，且能夠求出其分子量。
即，以往，雖然大家知道各種能與磷酸根結(jié)合的金屬配位化合物，但是并沒有完全認識到本發(fā)明的配位化合物具有與磷酸單酯基的強的結(jié)合能。還有，本發(fā)明者們已經(jīng)開發(fā)了一種使用本發(fā)明的配位化合物作為質(zhì)譜測定用的添加劑(質(zhì)量分析用添加劑)的發(fā)明，但本發(fā)明是對該發(fā)明進行的改良，能更容易地進行磷酸單酯化合物的確認和其分子量的鑒定。
以下，對發(fā)揮所述特征的本發(fā)明的實施形態(tài)以及其效果進行說明。
根據(jù)本發(fā)明的方法，首先，進行(1)將含有由單一的鋅同位體構(gòu)成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物和受檢試樣在溶劑中混合，配成溶液后，對所述溶液進行質(zhì)譜測定的工序；
式中，R1～R4表示氫原子或取代基。
首先，對“含有由單一的鋅同位體構(gòu)成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物”進行說明。
在“用式(I)表示的化合物”中，R1～R4定義中的“取代基”只要是不阻礙化合物(1)向磷酸單酯基的配位既可，并無特別限定。例如，舉例有直鏈或支鏈狀的C1-6烷基、氨基、羥基、氨基甲?；?、直鏈或支鏈狀的C1-6烷氧基、鹵素原子、硝基、磺酸基、羧基、甲?；Ⅴ；?、氰基、酰甲基、羥甲基等。
作為R1～R4，理想的是氫原子。因為廉價且很容易合成，并且得到的分子離子峰更簡單。還有，作為R1～R4，吡啶環(huán)上的4位或6位的給電子性取代基也合適。因為，由于在適宜的取代位置導(dǎo)入給電子性取代基，則使吡啶氮的電性變強，對鋅的配位性優(yōu)良，結(jié)果使得制造容易且具有穩(wěn)定性。
R1～R4可以相同，也可以互不相同，理想的是相同的。這主要是由于合成容易。
在所述式(I)中，選擇鋅作為配位金屬的理由是，其對磷酸單酯基的配位能極高?！昂杏檬?I)表示的化合物的配位化合物”的意思指，配位化合物的主要部分是用式(I)表示的化合物。例如，為了使用式(I)表示的化合物更穩(wěn)定化，也可以如下圖所示的使乙酸離子等配位。因為，用式(I)表示的化合物對磷酸單酯基具有極高的配位能，即使配位有其它化合物，如果在溶液中存在具有磷酸單酯基的化合物，就能快速地進行交換，可以形成配位化合物和磷酸單酯化合物的復(fù)合體。
作為天然存在的鋅的同位體，有其分子量為64、66、67、68、70。在工序(1)中，使用由從中選擇的單一的同位體構(gòu)成的配位化合物。
在工序(1)中，將該配位化合物和受檢試樣在溶劑中混合配成溶液。于是，因式(I)表示的化合物對磷酸單酯基的配位結(jié)合能極高，所以快速地與受檢試樣中的磷酸單酯化合物配位形成復(fù)合體。因此，該混合溶液無需加熱或為了要形成復(fù)合體而花費時間，當(dāng)然，在無損本發(fā)明目的的范圍內(nèi)也可以進行加熱等。
還有，為了“將配位化合物和試樣在溶劑中混合”，也可以向溶液中加入配位化合物和受檢試樣，也可以向配位化合物溶液加入受檢試樣或其溶液，或向受檢試樣溶液加入配位化合物或其溶液。
作為在這里使用的溶劑，只要是在能發(fā)揮本發(fā)明效果的范圍內(nèi)，能夠溶解本發(fā)明的配位化合物和受檢試樣的話，就不作特別地限定。例如，可以舉例有水(含有緩沖溶液和其他鹽溶液)；甲醇、乙醇等醇類；乙氰；二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等的胺類；以及這些的混合溶液。理想的是水或水和水溶性有機溶劑的混合溶液(水系溶劑)。因其具有優(yōu)異的溶解本發(fā)明的配位化合物和生物體試樣等的性能。
在工序(1)中，雖要“將配位化合物和試樣在溶劑中混合配成溶液”，但無需將配位化合物和受檢試樣完全溶解，只要在能夠使受檢試樣所含的磷酸單酯化合物與配位化合物配位的范圍內(nèi)溶解即可。即無需完全“溶解”，也可殘留部分的不溶成份。
其次，對含有本發(fā)明的配位化合物和磷酸單酯化合物的復(fù)合體的該溶液(混合液)進行質(zhì)譜測定。質(zhì)譜的測定方法，只要是使用以檢測為目的、適用于化合物的方法既可，但在本發(fā)明中，因主要以求出生物體試樣中所含的高分子的分子量為目的，所以理想的是采用MALDI TOF-MAS(基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜測量法)。因為該方法也能測定蛋白質(zhì)這樣的巨大分子的質(zhì)量。
本發(fā)明主要以鑒定磷酸單酯化肽的分子量為目的，但受檢試樣不限于此，例如，本發(fā)明也能夠應(yīng)用于磷酸化蛋白質(zhì)和糖類的復(fù)合體以及磷酸化的糖類等。
其次，通過與所述工序(1)同樣的手法進行工序(2)。尤其理想的是，化合物(1)，在工序(1)和工序(2)中使用的是相同種化合物。因為，用來比較的分子離子峰的形狀大致相同，則分子離子峰的鑒定變得更容易。只是，必須使用由與在所述工序(1)中使用的單一的鋅同位體不同的鋅同位體構(gòu)成的配位化合物。因為在工序(1)和(2)中使用相同種鋅同位體不能發(fā)揮本發(fā)明的效果。
又，所述工序(1)和(2)也可同時進行。即，將含有由分子量相互不同的鋅同位體構(gòu)成的2種化合物(1)的質(zhì)譜用添加劑添加到受檢試樣中，進行質(zhì)譜測定這樣的形態(tài)也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。只是，因為在含有較多化合物的受檢試樣的場合，對磷酸單酯化合物和化合物(1)的配位化合物的分子離子峰進行鑒定變得困難，所以理想的是在工序(1)之后實施工序(2)。
接著，作為工序(3)，通過將工序(1)和(2)得到的質(zhì)譜測定結(jié)果進行比較，求出磷酸單酯化合物的分子量。
首先，比較兩質(zhì)譜的測定結(jié)果，找到不同的峰。在這里，由不同的鋅同位體構(gòu)成的式(I)的化合物或配位化合物的分子離子峰當(dāng)然不同，但在受檢試樣中含有磷酸單酯化合物的場合，因為式(I)的化合物與磷酸單酯化合物大致定量地配位形成復(fù)合體，所以該復(fù)合體的分子離子峰的值也僅在有賴于鋅同位體的分子量差而形成的部分不同。
由上述工序(1)和(2)所得到的質(zhì)譜的結(jié)果，容易鑒定該復(fù)合體的分子離子峰。其原因是，兩分子離子峰大致呈現(xiàn)為相同的形狀，放大兩峰進行比較的話，容易判斷兩者是否為由相同的磷酸單酯化合物引起的分子離子峰。又，兩峰的分子量差，若使用所述工序(1)和(2)中的相同的化合物(I)的話，等于在鋅同位體分子量差的2倍值上再乘整數(shù)倍，由此，也可使兩分子離子峰的測定變得容易。這是因為在本發(fā)明所使用的配位化合物中配位有2個鋅原子，又因為，本發(fā)明的配位化合物大致定量地與受檢化合物中存在的磷酸單酯基配位，所以在某種程度上能預(yù)測兩分子量差。
例如，作為化合物(I)使用相同的化合物，作為鋅同位體使用64Zn和68Zn，則在工序(1)和(2)中所得的磷酸化肽等與配位化合物的復(fù)合體的分子量的差為8的整數(shù)倍(8乘以1分子化合物中存在的磷酸單酯基的個數(shù)的數(shù))。又，通過測定的分子量差，也能知道1分子磷酸單酯化合物中存在的磷酸單酯基的數(shù)目。
還有，因為在本發(fā)明中使用單一的鋅同位體，所以能抑制由多個鋅同位體引起的分子離子峰復(fù)雜化，分子離子峰的“裂紋”僅限于由碳同位體引起，這也是分子離子峰的鑒定變得容易的理由之一。
接著，從鑒定的分子離子峰讀取分子量，減去化合物(I)的分子量，能夠鑒定磷酸單酯化合物的分子量。例如，作為化合物(I)使用如下所示的化合物(R1～R4都是氫原子，鋅同位體為64Zn的化合物)時，在磷酸單酯化合物中結(jié)合的磷酸單酯基的數(shù)目為1的話，從復(fù)合體的分子離子峰的值中減去579，由此可求出磷酸單酯化合物的分子量。在這里，之所以不減去下述化合物(I)的分子量581，是因為，考慮到磷酸單酯化合物與化合物(I)配位時，從磷酸單酯基上脫去2個氫陽離子，所以需要補足其分子量。
C27H29N6O64Zn23+精確的質(zhì)量581.10摩爾重量581.42本發(fā)明的質(zhì)譜測定用的添加劑，是用于求出磷酸單酯化合物的分子量的添加劑，包括含有由單一的鋅同位體構(gòu)成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物的試劑；以及含有由與所述同位體不同的單一的鋅同位體構(gòu)成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物的試劑。
在這里，“由單一的鋅同位體構(gòu)成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物”和“含有由與所述同位體不同的單一的鋅同位體構(gòu)成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物”，與前述化合物具有同樣的意義。
“含有配位化合物的試劑”的意思是，該試劑也可以取配位化合物的鹽及溶劑合物(水合物等)的形態(tài)。在這里，作為鹽的構(gòu)成成分的抗衡離子，只要不妨礙本發(fā)明的效果就不作特別地限定。理想的是，以結(jié)晶態(tài)獲得的含有配位化合物的試劑及可提高配位化合物的穩(wěn)定性的試劑。例如，合適的是高氯酸根(ClO4-)。還有，也考慮通過特定的水合物的狀態(tài)，提高對于潮濕的穩(wěn)定性。
還有，本發(fā)明的質(zhì)譜測定用的添加劑，也可以是溶液狀態(tài)。因為，如果是溶液，可以直接加入到受檢試樣溶液中，或可以在溶液中加入受檢試樣或受檢試樣溶液，所以很便利。該溶液所使用的溶劑，可以使用與混合配位化合物和試樣用的所述溶劑相同的。又，也可以加入提高配位化合物的穩(wěn)定性的添加劑。
“包含”試劑的意思是一種組合物中可以包含二種試劑。然而，如上所述，由于本發(fā)明的工序(1)和(2)可以同時進行，但理想的是按順序進行，所以本發(fā)明的質(zhì)譜測定的添加劑理想的是分別含有各自試劑的試劑盒。
用所述式(I)表示的化合物，通過方案1能夠更容易地制造。
方案1 式中，R1～R4表示氫原子或取代基。
在所述方案1中，通過使化合物(II)與單一的鋅同位體化合物反應(yīng)，合成式(I)的化合物。作為原料化合物的化合物(II)通過后述的方案2能夠合成，作為單一的鋅同位體化合物，使用金屬鋅或氧化鋅、鋅鹽等。還有，化合物(II)也可以是鹽。
在所述方案1中，通過在調(diào)整為中性的水系溶劑中加熱，容易使鋅配位在化合物(II)上。只是，因為需要充分地溶解鋅化合物，所以較好的是，通過事先用超聲波處理暫且溶解在鹽酸里使粒子微?；＿€有，在這里，“中性”的意思并不嚴格，“大致中性”既可，理想的是pH調(diào)整為6.8以上。
在方案1中所使用的水系溶劑，能夠溶解化合物(II)和鋅化合物的既可，不作特別的限定，除純水、蒸餾水、自來水、緩沖液之外，也可以在其中加入醇類、酰胺類、乙氰等。
作為加熱溫度，理想的是30～90℃，合適的是50～90℃。反應(yīng)時間可以是10分～數(shù)小時。反應(yīng)后，過濾除去過剩的試劑后，濾別緩慢冷卻而析出的結(jié)晶，通過使用通常的再結(jié)晶法得到目的物。又，也可以通過配位乙酸離子等使配位化合物更加穩(wěn)定化。
用式(II)表示的化合物，通過方案2能夠制造。
方案2 (式中，R1～R4表示氫原子或取代基。)方案2是向作為原料化合物的化合物(III)(1，3-二氨基-2-丙醇)中依次導(dǎo)入具有R1～R4的2-吡啶甲基的反應(yīng)路線。方案2所使用的化合物(III)可以使用市售的。又，化合物(IV)及其它的2-甲?；拎せ衔锞哂斜容^簡單的結(jié)構(gòu)，可以使用市售的或用技術(shù)人員知道的方法進行合成。還有，在取代基(R1～R4)為反應(yīng)性基團的場合，可以用一般的保護基保護該取代基，該取代基可適宜地除去。
在方案2中，首先，化合物(III)和(IV)進行縮合反應(yīng)，得到化合物(V)，依次導(dǎo)入2-吡啶甲基而合成化合物(II)。只是，在R1～R4為相同基團的場合，通過一次使用4當(dāng)量以上的2-甲?；拎せ衔?IV)，進行一階段(一步)反應(yīng)也能得到化合物(II)。
在方案2中，作為縮合反應(yīng)進行還原性氨基化反應(yīng)。該場合所使用的溶劑只要能實質(zhì)上溶解化合物(III)和化合物(IV)等的2-甲?；拎せ衔?、不阻礙反應(yīng)的既可，不進行特別地限定。例如，可以使用甲醇、乙醇、異丙醇等的醇類；(二)乙醚、四氫呋喃、二噁烷等的醚類；水；或它們的混合溶劑。
在還原性氨基化反應(yīng)中，首先，將化合物(III)和2-甲?；拎せ衔锟s合后，用一般的還原試劑還原，在縮合時作為催化劑也可以添加鹽酸等。還有，作為化合物(III)也可以使用其鹽酸鹽。
反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間可以根據(jù)原料化合物的種類等采用合適的條件，例如，在20～80℃下反應(yīng)12～100小時。
反應(yīng)結(jié)束后，減壓餾去溶劑等后，加入水，用非水溶性溶劑萃取，無水硫酸鎂等干燥油相后，減壓餾去溶劑。接著，用硅膠柱色譜法等公知方法精制殘渣后，依次進行吡啶甲基的導(dǎo)入反應(yīng)，由此能夠得到化合物(II)。
又，得到化合物(II)的方法不限于方案2表示的方法，例如，也可以由化合物(III)和鹵素化合物合成化合物(II)。又，R1～R4全都是氫原子的化合物(II)的合成方法記載于公知文獻(M.Suzuki等，Bull.Chem.Soc.Jpn.，Vol.63，pp1115-1120(1990))，作為R1～R4都被導(dǎo)入6位(2位)的甲基的化合物(II)的合成方法也被記載于公知文獻(Y.Hayashi等，J.Am.Chem.Soc.，Vol.117，pp11220-11229(1995))中。
以下，顯示制造例以及實驗例，對本發(fā)明進行更詳細的說明，但本發(fā)明的范圍不限于這些。
實施例制造例1-1本發(fā)明的鋅配位化合物(鹽) 在65ml水中加入902mg(1毫摩爾)的N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-羥基丙烷(以下，稱作“TPAHP”)的四高氯酸鹽的2.5水合物和160mg(2毫摩爾)的64ZnO，在50℃作超聲波處理，使ZnO分散溶解。在該溶液中加入1.0ml的1.0M的氫氧化鈉水溶液，在80℃水浴中加熱30分鐘后過濾，一邊在80℃的水浴中加熱一邊攪拌，滴入2.0ml的1.0M醋酸鈉水溶液。在室溫緩慢冷卻反應(yīng)液后，用玻璃過濾器濾取析出的無色結(jié)晶，在50℃、大約10mmHg下，干燥3小時，由此得到760mg(89％)目的物。對該目的物進行1HNMR(1H核磁共振譜)測定和IR(紅外吸收光譜)測定。結(jié)果分別如圖1、2所示。
制造例1-2本發(fā)明的鋅配位化合物(鹽) 在10ml水中加入658mg(0.73毫摩爾)TPAHP的四高氯酸鹽的2.5水合物和100mg(1.47毫摩爾)68Zn，在50℃作超聲波處理，使68Zn分散溶解。對于68Zn，事先將其溶解在5ml濃鹽酸后，減壓餾去水，再進行甲醇共沸的減壓干燥的前處理。在該溶液中加入36.5ml的0.1M的氫氧化鈉水溶液，在80℃水浴中加熱30分鐘后過濾，一邊在80℃的水浴中加熱一邊攪拌，滴入醋酸鈉水溶液(160mg醋酸鈉溶解于5ml的蒸餾水中)。在室溫緩慢冷卻反應(yīng)液后，用玻璃過濾器濾取析出的無色結(jié)晶，在50℃、大約10mmHg下，干燥3小時，得到440mg(70％)目的物。
制造例1-3由天然同位體鋅構(gòu)成的鋅配位化合物(鹽)在TPAHP(4.39毫摩爾)的乙醇溶液(100ml)中加入10M氫氧化鈉水溶液(1.0ep)，接著加入醋酸鋅(9.66毫摩爾、2.2eq)。減壓餾去溶劑，得到褐色油狀殘渣。往該殘渣中加入10ml水，溶解，一邊加熱一邊滴入1.0M高氯酸鈉水溶液(3.0eq)，析出乳白色的結(jié)晶。濾取結(jié)晶，加熱干燥，得到微黃褐色的粉末狀目的物2.99g(79％)。目的物是通過1H-NMR(400MHz)、13C-NMR(13C核磁共振譜)(100MHz)和IR分析確認。
1H-NMR(DMSO-D6、400MHz)δ2.04(2H，dd，J＝12.1和12.4Hz，HC-1，3)，2.53(3H，s，HC-35)，3.06(2H，dd，J＝12.1和12.3Hz，HC-1，3)，3.74(1H，t，J＝10.4Hz，HC-2)，4.02-4.34(82H，m，HC-5，13，20，27)，7.54-7.65(8H，m，HC-10，11，18，19，25，26，32，33)，8.06-8.12(4H，m，HC-9，17，24，31)，8.58(4H，dd，J＝16.3和16.5Hz，HC-8，16，23，30)13C-NMR(DMSO-D6，100MHz)δ58.0，60.1，62.0，64.6，122.7，124.3，124.4，139.9，140.4，147.0，147.2，154.7，155.1IR(cm-1)υas(COO)1556，υ3(ClO4)1090試驗例1分別將在上述制造例1-1～1-3制造的鋅配位化合物(以64Zn、68Zn以及天然同位體Zn為構(gòu)成成分)溶解在蒸餾水，作成1mM水溶液。作為受檢試樣，使用P60c-src肽521-533磷酸型的1mM水溶液。還有，該磷酸化肽的結(jié)構(gòu)如以下所述。
在各個5μL的1mM鋅配位化合物水溶液中加入10μL受檢試樣、30μL緩沖液以及5μL蒸餾水，作成總量為50μL，將此用作測定用試樣對其進行質(zhì)譜測定(MALDITOF-MAS)。將0.5μL該測定用試樣涂敷在采樣板上，作為基質(zhì)快速地在其上加上0.5μL，注意涂敷端不要與采樣板接觸地輕輕地吸移。然后，等到溶劑風(fēng)干(約5分鐘)，進行測定。還有，質(zhì)譜測定的條件如下所述。
MALDI TOF-MASautoflex(BRUCKER DALTONICS社)；基質(zhì)40mg/mlTHAP(2，4，6-三羥基苯乙酮)(在乙氰中)；緩沖液(試樣溶解用)10mM Tris-borate buffer(pH＝8.0)。
將與天然同位體鋅配位化合物的復(fù)合體的結(jié)果表示于圖3，64Zn鋅同位體表示于圖4，68Zn鋅同位體表示于圖5。
根據(jù)該結(jié)果，含有64Zn鋅的復(fù)合體的分子離子峰為2122，含有68Zn鋅的復(fù)合體的分子離子峰為2130。因而，受檢試樣是被磷酸單酯化的，結(jié)合的磷酸根是一個。還有，從含有64Zn鋅的復(fù)合體的分子量減去配位化合物的分子量(581)等于1541。該值與所述結(jié)構(gòu)式所示的值不同，我們考慮這是因為，如下述結(jié)構(gòu)式所示，由配位化合物對肽中的離子化(氫陽離子)的磷酸單酯基配位所引起的。也就是說，加上脫離的2個氫陽離子的分子量，為1543，該分子量與數(shù)據(jù)一致。
又，含有天然同位體鋅的復(fù)合體的分子離子峰，因多個的鋅同位體而復(fù)雜化，通過使用單一的同位體的場合更簡單化，且其峰的表現(xiàn)方式大致為相同形狀。因而，根據(jù)本發(fā)明的方法，證實即使是生物體試樣等的混合試樣，也能容易地鑒定單磷酸酯化合物的分子離子峰。
實驗例2使用所述制造例1-1，1-2制造的鋅配位化合物(以64Zn以及68Zn為構(gòu)成成分)，用與所述實驗例1同樣的方法進行質(zhì)譜測定。只是，作為受檢試樣，使用如下述結(jié)構(gòu)所示的P60c-src肽基質(zhì)(Substrate)II磷酸化型，作為測定機器使用Voyager RP型(PE Biosystem社) C33H45N6O12P精確的質(zhì)量748.28摩爾重量748.7264Zn鋅配位化合物的質(zhì)譜結(jié)果表示于圖6中，68Zn鋅配位化合物的質(zhì)譜結(jié)果表示于圖7中。
由該結(jié)果可以明白與實施例1相同，使用本發(fā)明方法，受檢試樣被單磷酸化，結(jié)合的磷酸根是1個。又，兩分子離子峰大致為相同形狀，明顯地，即使是在混合試樣中也能容易地堅定磷酸單酯化合物的分子量。又，從含有64Zn鋅的復(fù)合體的分子量減去配位化合物的分子量(581)等于747。該值與所述結(jié)構(gòu)式所示的值不同，但如同上述實驗例1的結(jié)果，可認為是磷酸單酯基離子化的結(jié)果。加上脫離的氫陽離子的部分為749。
根據(jù)本發(fā)明的方法，即使是含有多個化合物的生物體試樣等，也能從中確認磷酸單酯化合物(磷酸化肽等)的存在，且能夠容易地鑒定其分子量。因此，通過對生物體試樣等合適地使用本發(fā)明方法，可應(yīng)用于疾病的診斷。本發(fā)明在這一點上非常有用。
又，本發(fā)明的質(zhì)譜測定用的添加劑，作為能夠在上述方法中使用的添加劑，在產(chǎn)業(yè)上非常有用。
權(quán)利要求
1.一種磷酸單酯化合物分子量的求得方法，其特征在于，所述方法包括(1)將含有由單一的鋅同位體構(gòu)成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物和受檢試樣在溶劑中混合，配成溶液后，對所述溶液進行質(zhì)譜測定的工序； 式中，R1～R4表示氫原子或取代基，(2)將含有由與所述同位體不同的單一的鋅同位體構(gòu)成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物和受檢試樣在溶劑中混合，配成溶液后，對所述溶液進行質(zhì)譜測定的工序；(3)通過對所述質(zhì)譜測定結(jié)果進行比較，求得磷酸單酯化合物的分子量的工序。
2.如權(quán)利要求1所述的磷酸單酯化合物分子量的求得方法，其特征在于，作為所述配位化合物使用的是R1～R4全部是氫原子的配位化合物。
3.一種質(zhì)譜測定用的添加劑，用于求出磷酸單酯化合物的分子量，其特征在于，所述質(zhì)譜測定用的添加劑含有一種試劑，所述試劑含有由單一的鋅同位體構(gòu)成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物；以及另一種試劑，所述另一種試劑含有由與所述同位體不同的單一的鋅同位體構(gòu)成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物， 式中，R1～R4表示氫原子或取代基。
4.如權(quán)利要求3所述的質(zhì)譜測定用的添加劑，其特征在于，作為配位化合物，其R1～R4全部是氫原子。
5.如權(quán)利要求3或4所述的質(zhì)譜測定用的添加劑，其特征在于，所述配位化合物是由式(I)表示的化合物和乙酸離子進一步配位形成。
6.如權(quán)利要求3～5中的任一項所述的質(zhì)譜測定用的添加劑，其特征在于，所述試劑為鹽的狀態(tài)。
7.如權(quán)利要求3～5中的任一項所述的質(zhì)譜測定用的添加劑，其特征在于，所述試劑為溶液的狀態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于分子量鑒定的方法及在該方法中使用的質(zhì)譜測定用的添加劑，上述方法即使是對于含有多個化合物的生物體試樣等，也能從中確認磷酸單酯化合物(磷酸化肽等)的存在，且能夠容易地鑒定其分子量。本發(fā)明的方法，系使用一種具有對于磷酸單酯基非常高的配位能的、且由單一的鋅同位體構(gòu)成的配位化合物，取得多個質(zhì)譜數(shù)據(jù)，然后對這些質(zhì)譜進行比較的方法。
文檔編號G01N27/62GK1756954SQ200380110118
公開日2006年4月5日 申請日期2003年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月7日
發(fā)明者小池透, 南則雄, 川崎昭彥 申請人:株式會社納德研究所