專利名稱：HIF-1α在治療白血病藥物的篩選中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于HIF-1α在治療白血病藥物的篩選中的應(yīng)用，其通過將HIF-1α作為藥物靶標(biāo)，在低氧環(huán)境下來篩選可對(duì)白血病細(xì)胞產(chǎn)生分化作用的藥物。
背景技術(shù)：
白血病是嚴(yán)重危害人類生命健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。其中，急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)由于起病急，病死率高等特點(diǎn)而受到更為廣泛的重視。另一方面，由于白血病取材方便，并且易于觀察療效，有關(guān)AML發(fā)病學(xué)和治療學(xué)的研究在過去十多年中所取得的進(jìn)展令人矚目。人們相信，未來腫瘤治療學(xué)上的突破很有可能首先源自于對(duì)白血病的研究。已知大多數(shù)白血病細(xì)胞存在特異的細(xì)胞遺傳學(xué)改變，尤其是染色體易位。這些易位常常形成異常融合基因和產(chǎn)生相應(yīng)的融合蛋白，干擾造血干細(xì)胞的正常分化過程并使該過程受阻于某一分化階段。例如，約占成人AML10-15％的急性早幼粒細(xì)胞性白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)以骨髓粒系細(xì)胞發(fā)育停滯在早幼粒細(xì)胞階段為特征。它的發(fā)生與位于人類17號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的維甲酸受體α(retinoic acid receptorα，RARα)基因的異常重排密切相關(guān)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，95％以上的APL患者的白血病細(xì)胞存在非隨機(jī)染色體易位t(15；17)(q22；q21)，該染色體易位使17號(hào)染色體上的RARα基因與15號(hào)染色體上的PML(promyelocyticleukemia)基因融合，形成PML-RARα融合基因。一些變異型染色體易位也存在少數(shù)APL病人中，并且?guī)缀鹾翢o例外地累及RARα。這些易位包括t(11；17)(q23；q21)、t(11；17)(q13；q21)、t(5；17)(q35；q21)和dup(17)(q21.3；q23)，它們分別產(chǎn)生PLZF-RARα、NuMA-RARα、NPM-RARα和STAT5b-RARα融合基因。這些融合基因蛋白產(chǎn)物均對(duì)野生型RARα具有顯性負(fù)調(diào)節(jié)作用，被認(rèn)為是APL發(fā)病的直接原因。
上世紀(jì)八十年代中期，我國(guó)學(xué)者率先運(yùn)用全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)治療APL，并在臨床實(shí)踐中取得良好療效。緩解率達(dá)到了90％以上，為腫瘤的治療提供了全新的模式——“誘導(dǎo)分化治療”(differentiation therapy)，即運(yùn)用誘導(dǎo)分化劑誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向成熟階段分化，恢復(fù)其正常的表型及功能，同時(shí)抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖。誘導(dǎo)分化療法正日益受到眾多學(xué)者的關(guān)注，但迄今為止，誘導(dǎo)分化治療的成功模式仍限于ATRA治療APL。因此，該治療模式在其它類型的白血病以及實(shí)體瘤中取得突破是各國(guó)學(xué)者共同追求的目標(biāo)，也是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的重要熱點(diǎn)之一。
上世紀(jì)末，我國(guó)學(xué)者成功地應(yīng)用三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)治療ATRA治療后復(fù)發(fā)以及對(duì)ATRA和化療藥物不敏感的難治性APL病人，并在短期內(nèi)得到世界大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)的廣泛證實(shí)。于是，許多醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室致力于對(duì)ATO治療APL的藥理機(jī)制的研究。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ATO具有雙重性的藥理效應(yīng)，即高濃度(1-2μM)的ATO能有效地誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡，而低濃度(0.1-0.5μM)ATO經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的處理，則可誘導(dǎo)APL細(xì)胞發(fā)生部分分化。但是，APL動(dòng)物模型以及臨床實(shí)驗(yàn)觀察提示，ATO的治療效果在很大程度上取決于其對(duì)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效應(yīng)。另一方面，越來越多的體外研究顯示，ATO的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)并不局限于APL，它也可以誘導(dǎo)許多其它白血病和實(shí)體瘤細(xì)胞凋亡。但是，迄今為止尚未見到ATO對(duì)APL以外的惡性腫瘤治療效果的報(bào)道。
基于ATO的體外誘導(dǎo)分化效應(yīng)遠(yuǎn)不如其在白血病病人體內(nèi)的作用效應(yīng)明顯，我們推測(cè)存在體內(nèi)骨髓微環(huán)境中的某些因素可能影響ATO的誘導(dǎo)分化作用，而氧濃度可能屬于這些影響因素之一，因?yàn)轶w外細(xì)胞培養(yǎng)通常在氧濃度為21％左右的大氣環(huán)境中；而人體內(nèi)環(huán)境的氧分壓卻要低得多，如肺泡的氧濃度僅為16％，而人體其它臟器的氧濃度均低于6％。雖然在骨髓中惡性增殖的白血病細(xì)胞，并未形成如同于實(shí)體瘤的局部病灶所形成的低氧環(huán)境，然而AML病人中普遍存在貧血等癥狀，并且隨著白血病細(xì)胞的迅速增生，可能進(jìn)一步加重骨髓中的低氧狀況。事實(shí)上，Jensen等科學(xué)家最近的發(fā)現(xiàn)也證實(shí)了這種推測(cè)。他們發(fā)現(xiàn)移植到Brown Norwegan小鼠的白血病細(xì)胞在骨髓中呈現(xiàn)明顯的低氧狀態(tài)。
低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是受控于氧濃度變化一個(gè)至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1由α和β亞基組成。這些亞基都屬于具有螺旋一環(huán)一螺旋(BHLH)/Per-Arnt-Sim(PAS)結(jié)構(gòu)域的蛋白家族成員。該家族由兩大類蛋白質(zhì)組成。第一類包括HIF-1α、HIF-2α(EPAS-1/HLF/HRF/MOP2)和HIF-3α。第二類則有Arnt1(HIF-1β)、Arnt2和Arnt3。其中HIF-1α是依賴于低氧情況而存在的轉(zhuǎn)錄因子，它在維持氧濃度平衡中起著舉足輕重的作用。HIF-2α和HIF-3α的表達(dá)同樣也受到氧濃度的調(diào)節(jié)，但與HIF-1α相比，它們更具有組織特異性功能。HIF-1的活性實(shí)際上依賴HIF-1α的穩(wěn)定表達(dá)。在正常氧濃度時(shí)，HIF-1α受細(xì)胞內(nèi)泛素的蛋白酶體系統(tǒng)的作用發(fā)生降解。而在低氧時(shí)，HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與HIF-1β形成異二聚體。此異二聚體作用于靶基因的低氧反應(yīng)元件(HRE)，啟動(dòng)一系列基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生特定的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)對(duì)低氧的適應(yīng)性反應(yīng)而維持機(jī)體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)。HIF-1在心臟缺血、大腦缺氧、慢性阻塞性肺病、腫瘤中都有過度表達(dá)。
雖然目前關(guān)于低氧和HIF-1α的研究涉及很多領(lǐng)域，但迄今為止，還沒有關(guān)于其在白血病分化中的作用以及如何利用低氧和HIF-1α相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)分化治療白血病的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供HIF-1α在治療白血病藥物的篩選中的應(yīng)用，其通過將HIF-1α作為藥物靶標(biāo)，在低氧環(huán)境下來篩選可對(duì)白血病細(xì)胞產(chǎn)生分化作用的藥物。
本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)是提供HIF-1α在治療白血病藥物的篩選中的應(yīng)用，其特征在于通過將HIF-1α作為藥物靶標(biāo)，來篩選能使HIF-1α的降解被抑制、從而對(duì)白血病細(xì)胞產(chǎn)生分化作用的藥物。
利用低氧環(huán)境抑制HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶的活性，使得HIF-1α的降解被抑制的特性，可將HIF-1α用于篩選適當(dāng)?shù)牡脱跄M物用于使白血病細(xì)胞進(jìn)行分化本發(fā)明利用HIF-1α作為藥物靶標(biāo)，篩選出氯化鈷用于實(shí)現(xiàn)對(duì)白血病細(xì)胞的分化作用。所述白血病細(xì)胞是指NB4細(xì)胞、U937細(xì)胞及Kasumi細(xì)胞和各型AML細(xì)胞等。
本發(fā)明利用低氧環(huán)境抑制HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶的活性，使得HIF-1α的降解被抑制的特性，來篩選適當(dāng)?shù)乃幬铮绕涫强赡艿牡脱跄M物，用于使白血病細(xì)胞進(jìn)行分化，從而達(dá)到治療白血病的目的。


圖1是CoCl2對(duì)NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)、活力和細(xì)胞周期的影響的示意圖。
圖1A是不同濃度的CoCl2對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)影響的示意圖。
圖1B是不同濃度的CoCl2對(duì)NB4細(xì)胞活力影響的示意圖。
圖1C是用25μM和50μM CoCl2處理3天后，對(duì)NB4細(xì)胞細(xì)胞周期影響的示意圖。
圖1D是NB4細(xì)胞經(jīng)過50μM CoCl2、0.5μM ATO以及聯(lián)合用藥后第3天時(shí)Annexin V檢測(cè)的示意圖。
圖2是25μM和50μM CoCl2誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的示意圖。
圖2A是用25μM和50μM CoCl2處理NB4細(xì)胞6天時(shí)的形態(tài)學(xué)觀察示意圖。
圖2B是經(jīng)25μM和50μM CoCl2處理2、4、6天時(shí)的NB4細(xì)胞CD11b的表達(dá)增加的示意圖。
圖3是50μM CoCl2和/或0.5μM ATO與0.1μM ATRA處理NB4細(xì)胞3天對(duì)PML/PML-RARα細(xì)胞內(nèi)定位的影響示意圖。
圖4是經(jīng)50μM CoCl2和/或0.5μM ATO與0.1μM ATRA處理3天后，NB4細(xì)胞的PML-RARα蛋白表達(dá)情況的示意圖。
圖5是CoCl2對(duì)于ATRA和ATO誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的影響示意圖。
圖5A是NB4經(jīng)過50μM CoCl2和/或0.1μM ATRA處理4后，對(duì)CD11b以及CD14影響的示意圖。
圖5B是NB4經(jīng)過50μM CoCl2和/或0.5μM ATO處理4天后，對(duì)CD11b表達(dá)影響的示意圖。
圖6是CoCl2誘導(dǎo)U937和Kasumi-1細(xì)胞分化，但不誘導(dǎo)HL60細(xì)胞發(fā)生分化。
圖6A是U937細(xì)胞經(jīng)過25μM和50μM CoCl2處理后第6天的形態(tài)學(xué)改變及其細(xì)胞表面抗原CD11b的表達(dá)情況示意圖。
圖6B是Kasumi-1細(xì)胞經(jīng)過50μM CoCl2處理至第6天的形態(tài)學(xué)變化示意圖。
圖6C是Kasumi-1細(xì)胞經(jīng)過50μM CoCl2誘導(dǎo)后對(duì)細(xì)胞表面抗原CD11b影響的示意圖。
圖6D是HL60細(xì)胞經(jīng)50μM CoCl2處理后對(duì)其表面抗原CD11b影響的示意圖。
圖7是2％O2誘導(dǎo)U937細(xì)胞發(fā)生成熟相關(guān)的形態(tài)學(xué)改變示意圖。
圖8是CoCl2對(duì)來源于AML病人的新鮮白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)分化情況的示意圖。
圖8A是用50μM的CoCl2處理6天后，對(duì)新鮮白血病細(xì)胞表面抗原CD11b表達(dá)的影響的示意圖。
圖8B是來自AML-M2型白血病病人的新鮮細(xì)胞，經(jīng)過50μM的CoCl2處理6天后出現(xiàn)了明顯的形態(tài)學(xué)改變示意圖。
圖9是NB4細(xì)胞經(jīng)過50μMCoCl2處理48小時(shí)以后，對(duì)C-myc和P53蛋白水水平的影響的示意圖。
圖10是50μM CoCl2處理后，對(duì)白血病細(xì)胞中HIF-1α蛋白水平的影響的示意圖。
圖11是用HIF-1α的特異性抑制劑SIN-1處理后，對(duì)白血病細(xì)胞NB4分化的影響的示意圖。
圖11A是SIN-1能夠明顯地抑制HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性表達(dá)示意圖。
圖11B是HIF-1α蛋白的特異性抑制劑SIN-1對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)的影響示意圖。
圖11C是HIF-1α蛋白的特異性抑制劑SIN-1降低CoCl2誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞分化指標(biāo)CD11b的表達(dá)示意圖。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果分析和相應(yīng)的說明書附圖，對(duì)本發(fā)明CoCl2在制備治療白血病的藥物中的應(yīng)用作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
本發(fā)明涉及人轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的分離和功能研究，調(diào)控該轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的藥物、抗體等化合物和方法。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可以廣泛定義為組成性和組織特異性的，其中之一是低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)，該基因及其產(chǎn)物在表1所述的30多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄中具有重要作用。而且，低氧誘導(dǎo)因子1可能還在尚未發(fā)現(xiàn)的諸多基因的轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要調(diào)控作用。
表1是將U937細(xì)胞放置于2％的O2中培養(yǎng)時(shí)，相應(yīng)的細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)。表1中所示的這些基因主要涉及血管形成、血管重建、葡萄糖和能量代謝、細(xì)胞的增殖及存活，紅細(xì)胞生成等。
表1 低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)的靶基因HIF-1參與的生理功能 HIF-1靶基因氧氣的運(yùn)輸紅細(xì)胞生成 促紅細(xì)胞生成素運(yùn)鐵蛋白運(yùn)鐵蛋白受體氧氣的運(yùn)輸新生血管的形成 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)VEGF受體1(F1t-1)纖溶酶原激活物抑制劑內(nèi)皮素-1一氧化碳合成酶血紅素氧化酶1α1B-腎上腺素能受體無氧酵解相關(guān)酶類 磷酸果糖激酶L醛縮酶A3磷酸甘油醛脫氫酶磷酸甘油酸激酶1烯醇化酶1乳糖脫氫酶A果糖轉(zhuǎn)移子-1HIF-1功能的負(fù)反饋調(diào)節(jié)P35SRJ(CBP/p300拮抗劑)其它 胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子VL30
大量研究認(rèn)為，在人類生長(zhǎng)發(fā)育的生理過程中，細(xì)胞及組織中的氧濃度的維持主要通過體內(nèi)短期或長(zhǎng)期的適應(yīng)性反應(yīng)信號(hào)來調(diào)節(jié)，以維持機(jī)體處于適宜的氧環(huán)境下。其中，轉(zhuǎn)錄因子HIF-1發(fā)揮了重要作用。HIF-1是由低氧敏感性的α-亞單位(HIF-1α)與基礎(chǔ)表達(dá)的β-亞單位(HIF-1β，也稱為ARNT)形成的異二聚體。
人體所有組織中均表達(dá)HIF-1α和HIF-1βmRNA。ARNT2主要是在大腦和腎臟中表達(dá)，而HIF-2α則主要在胚胎發(fā)生過程中的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，同時(shí)在產(chǎn)生兒茶酚胺類細(xì)胞、腎臟以及肺臟也有表達(dá)。在正常鼠的生長(zhǎng)發(fā)育過程中均有ARNT、HIF-1α和HIF-1β的參與。HIF-1α在機(jī)體的發(fā)育生長(zhǎng)中發(fā)揮了重要作用。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)30多個(gè)基因受到HIF-1調(diào)節(jié)。
已知HIF-1α存在一個(gè)結(jié)合抑癌蛋白Von Hippel Lindar(VHL)的結(jié)構(gòu)域。VHL是一個(gè)多蛋白復(fù)合體，具有E3泛素連接酶活性。它與HIF-1α的結(jié)合導(dǎo)致HIF-1α泛素化，并被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體系統(tǒng)降解。HIF-1α的564位和402位脯氨酸的羥化狀態(tài)調(diào)節(jié)α亞單位與VHL的結(jié)合能力，而涉及這個(gè)羥化反應(yīng)的酶已被命名為HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶，其活性需要氧氣、二價(jià)鐵離子等的參與。
所以，在正常氧濃度時(shí)，HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶因O2的存在而激活，使HIF-1α中的564位脯氨酸殘基羥化。于是，VHL上的E3泛素連接酶結(jié)合脯氨酸羥化的HIF-1α，引發(fā)HIF-1α的降解。相反，低氧時(shí)，HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶的活性因?yàn)檠醯娜鄙俣艿揭种疲虼薍IF-1α則不能被羥化，亦不能被VHL識(shí)別。于是，HIF-1α聚集，并通過其核定位信號(hào)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與胞核內(nèi)持續(xù)表達(dá)的HIF-1β亞單位結(jié)合形成異二聚體。形成的異二聚體與靶基因的低氧反應(yīng)元件(HRE)結(jié)合，啟動(dòng)某些基因如VEGF、EPO等的轉(zhuǎn)錄活性(參閱表1)，通過增加新生血管形成，調(diào)節(jié)葡萄糖代謝及轉(zhuǎn)移，降低氧耗量等，使細(xì)胞內(nèi)、組織內(nèi)的缺氧狀態(tài)得到改善，可知HIF-1α也是低氧反應(yīng)信號(hào)途徑中一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。
因此，可以利用低氧環(huán)境抑制HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶的活性，使得HIF-1α的降解被抑制的特性，來篩選適當(dāng)?shù)乃幬?，尤其是可能的低氧模擬物，用于使白血病細(xì)胞進(jìn)行分化，從而可達(dá)到治療白血病的目的。
以下為本發(fā)明的基本思路1.低氧模擬物的篩選、該低氧模擬物有效劑量的確定、及其是否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的確證。
通過細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞周期及annexin V檢測(cè)分析不同濃度的待測(cè)化合物對(duì)APL細(xì)胞系NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)及活力的影響。選擇能夠有效地抑制NB4細(xì)胞生長(zhǎng)，并呈時(shí)間和劑量依賴性的低氧模擬物化合物CoCl2。根據(jù)早期細(xì)胞凋亡的重要分子標(biāo)志annexinV陽(yáng)性細(xì)胞有無明顯增加，確定待測(cè)化合物CoCl2最佳的作用濃度(見實(shí)施例1和實(shí)施例2)。在上述研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察有效劑量范圍內(nèi)的化合物是否誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化。
根據(jù)經(jīng)待測(cè)化合物CoCl2處理一段時(shí)間后，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的成熟、及相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變情況，如核染色質(zhì)濃縮、核/漿比例減少、核變小并伴隨部分細(xì)胞核形的改變、能否見到核仁、受誘導(dǎo)的細(xì)胞是否表達(dá)與粒細(xì)胞分化相關(guān)的細(xì)胞表面抗原CD11b等，確定待測(cè)化合物是否促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化。
2.檢測(cè)待測(cè)化合物CoCl2能否調(diào)控HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性。
為了檢測(cè)待測(cè)化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化是否與HIF-1α存在著聯(lián)系，我們運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測(cè)待測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的mRNA和蛋白的表達(dá)水平的可能影響(實(shí)施例3)。
3.確證待測(cè)化合物(CoCl2)的作用靶標(biāo)是HIF-1α蛋白，以明確HIF-1α蛋白在待測(cè)化合物(CoCl2)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化中的作用，即HIF-1α蛋白是否可用于篩選該待測(cè)化合物CoCl2。
為了明確HIF-1α蛋白是否參與了待測(cè)化合物(CoCl2)誘導(dǎo)的腫瘤(白血病)細(xì)胞分化過程，應(yīng)用該蛋白的抑制劑來觀察其對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)效應(yīng)的影響是目前生物學(xué)研究的常用方法。某些一氧化氮供體，如3-morpholinosychnonimine(SIN-1)能夠降低HIF-1α表達(dá)的穩(wěn)定性，因此本發(fā)明檢測(cè)了在HIF-1α蛋白表達(dá)降低的前提下，其對(duì)待測(cè)化合物誘導(dǎo)分化效應(yīng)的影響(實(shí)施例4)。
因此，本發(fā)明即欲通過相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果來推證這樣的結(jié)論可將HIF-1α作為藥物靶標(biāo)，來篩選能使HIF-1α的降解被抑制、從而對(duì)白血病細(xì)胞產(chǎn)生分化作用的藥物。
本發(fā)明采用下列具體實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行證實(shí)，但是本發(fā)明的范圍并不僅限于下列實(shí)驗(yàn)所公開的范圍。
實(shí)驗(yàn)方法步驟一、預(yù)備待測(cè)化合物CoCl2制劑。
取購(gòu)自上海化學(xué)試劑公司(上海，中國(guó))的純度為99％的CoCl2，用滅菌后的雙蒸水配制成50mmol/L的儲(chǔ)存液，4℃保存，需每月新鮮配制以保持藥物的藥效。取0.1％的三氧化二砷(ATO)以少量1.0mol/L的NaOH溶解后，用PBS配制成5.0mmol/L的儲(chǔ)存液，4℃保存。取0.1％的一氧化氮供體3-morpholinosydnonimine(SIN-1)和全反式維甲酸(ATRA)分別用PBS和無水乙醇配制成10mmol/L和1mmol/L的儲(chǔ)存液，-20℃保存。
以上0.1％的三氧化二砷、全反式維甲酸和一氧化氮供體試劑均購(gòu)自Sigma公司(St Louis，MO，USA)。
步驟二、白血病細(xì)胞培養(yǎng)。
本研究采用的白血病細(xì)胞系包括存在t(15；17)和對(duì)ATRA敏感的APL細(xì)胞系NB4、無t(15；17)但對(duì)ATRA敏感的AML細(xì)胞系HL60、人類單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞系U937以及攜帶t(8；21)融合基因的M2b型白血病細(xì)胞系Kasumi-1。原代細(xì)胞來源于通過形態(tài)學(xué)、免疫表型分析和細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)診斷后的各型AML病人骨髓，用淋巴細(xì)胞分離液從患者的骨髓中分離出單個(gè)核細(xì)胞后，再裂解紅細(xì)胞，洗滌后，以4-5×105/ml的起始濃度培養(yǎng)。
將上述白血病細(xì)胞系和處理以后的原代細(xì)胞分別接種于含10％胎牛血清(FBS)(Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland)、100u/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素和2mmol/ml谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)液(Sigma公司，St Louis，Missouri)中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(37℃，5％CO2，/95％O2)。同時(shí)，每天換液以保持細(xì)胞濃度維持在2-5×105/ml的最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，并根據(jù)需要分別加入適量的待測(cè)化合物CoCl2制劑，準(zhǔn)備單獨(dú)加入上述預(yù)備好的CoCl2、或同時(shí)加入CoCl2、三氧化二砷和/或全反式維甲酸的加藥組和不加入任何藥劑的對(duì)照組。
為了觀察低氧條件對(duì)白血病細(xì)胞的作用，將細(xì)胞放置于由90-93％的N2、5％CO2和2-5％O2組成的混合氣體產(chǎn)生的特殊低氧培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation，F(xiàn)orma，Massachusetts)中，37℃培養(yǎng)。細(xì)胞的活力通過苔盼蘭拒染法檢測(cè)。
步驟三、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞分化抗原表達(dá)。
自步驟二準(zhǔn)備的各加藥組和對(duì)照組中分別取1×106細(xì)胞，PBS清洗兩次，加入熒光標(biāo)記的抗人CD11b/FITC抗體和相應(yīng)的同型對(duì)照抗體(均購(gòu)自Coulter-Immunotech，Paris，F(xiàn)rance)10ul，于室溫避光反應(yīng)30分鐘；PBS清洗一次。置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)(Beckmon-Coulter，Miami，F(xiàn)lorida)。
步驟四、細(xì)胞周期分析與凋亡指標(biāo)的檢測(cè)。
自步驟二準(zhǔn)備的各加藥組和對(duì)照組中分別收集約106細(xì)胞，PBS清洗兩次，經(jīng)70％冷乙醇固定24小時(shí)以上后，再用PBS清洗兩次，加1％RNA酶37℃消化30分鐘。隨后，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)50ug/ml染色，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后，所得資料再經(jīng)LYSIS II軟件(Beckon Dickson產(chǎn)品)收集處理分析。
根據(jù)Clontech公司提供的ApoAlert Annexin-V kit(Palo Alto，CA)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，在步驟二準(zhǔn)備的各加藥組和對(duì)照組中分別收集2×105細(xì)胞，用PBS洗一遍，加入200μl結(jié)合溶液并懸浮細(xì)胞，再加5μl AnnexinV和10μl PI(Propidium Iodine)置于室溫避光10分鐘，流式細(xì)胞儀(Beckmon-Coulter，Miami，F(xiàn)lorida)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
步驟五、免疫熒光分析。
在步驟二準(zhǔn)備的各加藥組和對(duì)照組中分別收集約106細(xì)胞，PBS清洗兩次，細(xì)胞涂片儀離心涂片，過夜自然涼干后，先用預(yù)冷丙酮4℃固定10分鐘，自然涼干20分鐘；用PBS預(yù)先孵育15分鐘，再用1∶400稀釋的抗人PML N端抗體(Santa Cruz，CA，USA)，37℃孵育1小時(shí)；PBS清洗3次，加1∶50稀釋的FITC標(biāo)記的二抗(Santa Cruz，CA，USA)，37℃孵育1小時(shí)，PBS清洗3次，加抗淬滅劑，熒光顯微鏡(MRC-600 Confocal Imaging System；Bio-Rad MicroscienceLtd，Hertfordshire，UK)下進(jìn)行觀察。
步驟六、Western蛋白印跡。
自步驟二準(zhǔn)備的各加藥組和對(duì)照組中分別取2×106細(xì)胞，經(jīng)PBS清洗、離心(2000rpm/min，5分鐘)沉淀后加入100ul 2×SDS上樣緩沖液(100mMTris堿，4％SDS，0.2％溴酚藍(lán)，20％甘油和5％β巰基乙醇)并超聲裂解細(xì)胞。細(xì)胞裂解產(chǎn)物經(jīng)煮沸(5分鐘)后離心13000r/min 15分鐘，棄沉淀物，剩余的溶液即為抽取的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)經(jīng)Bradford法定量后上樣于8％SDS聚丙稀酰胺凝膠，電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)膜，0.2％麗春紅染色估計(jì)轉(zhuǎn)移效率，膜經(jīng)5％脫脂奶粉(0.1％Tween-20)室溫封閉1小時(shí)后，與相應(yīng)一抗(包括HIF-1α、P53、RARα、C-myc)按一定的稀釋度室溫孵育2小時(shí)或4℃過夜，經(jīng)PBS(含0.1％Tween-20)充分洗滌后與相應(yīng)稀釋度的二抗室溫反應(yīng)60分鐘，洗滌后經(jīng)ECL試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，England)顯色。所用抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司。
步驟七、半定量RT-PCR。
在步驟二準(zhǔn)備的各加藥組和對(duì)照組中分別收集1×107細(xì)胞，根據(jù)TRIzol kit(Invitrogen，Scotland，UK)抽提總RNA。以管家基因G3PDH為內(nèi)參，取藥物處理的不同細(xì)胞的cDNA作為模板，采用G3PDH引物和基因特異性引物同時(shí)進(jìn)行單管擴(kuò)增的策略。擴(kuò)增條件25ul反應(yīng)體系95℃，5分鐘；94℃，30秒；55℃，40秒；72℃，60秒；72℃，10分鐘；30個(gè)循環(huán)。
HIF-1α的引物5’-CGTTGTGAGTGGTATTATTCAGC-3’5’-CAGTTTCTGTGTCGTTGCTGC-3’擴(kuò)增1019bp-1265bp HIF-1αcDNA片段。
運(yùn)用SmartView version 5.0軟件(Furi Corporation，上海，中國(guó))對(duì)擴(kuò)增的單個(gè)HIF-1α片段強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，并與內(nèi)參G3PDH比較分析得到樣本的表達(dá)強(qiáng)度。
步驟八、HIF-1αcDNA測(cè)序。
運(yùn)用如下兩對(duì)引物擴(kuò)增全長(zhǎng)的HIF-1αcDNA(GenBank accessionno.NM-001530)①正向引物5’-ATTCACCATGGAGGGCGC-3’和反向引物5’-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3’；②正向引物5’-GATGCTTTAACTTTGCTGGC-3’和反向引物5’-TCAGTTAACTTGATCCAAAGCTC-3’。這兩對(duì)引物分別擴(kuò)增HIF-1α的1-1265和1173-2481cDNA片段。
PCR擴(kuò)增條件95℃，30秒；55℃，40秒；72℃，1分鐘，35個(gè)循環(huán)，用GeneAmp PCR System9600(Perkin-Elmer Norwalk，USA)。擴(kuò)增后的產(chǎn)物構(gòu)件至pGEM-T載體中(Promega，Madison)，最后在ABI377 DNA測(cè)序儀上檢測(cè)(Perkin-Elmer，Boston，Massachusetts)步驟九、cDNA-微陣列分析。
采用cDNA-微陣列方法，收集步驟二準(zhǔn)備的各加藥組和對(duì)照組的NB4細(xì)胞，用Trizol抽提總RNA并經(jīng)過RT-PCR獲取cDNA。步驟二準(zhǔn)備的對(duì)照組以及加入CoCl2的加藥組分別用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP標(biāo)記，標(biāo)記后的cDNA與帶有8464基因的基因芯片(BioStar H-80s，United Gene Co，Shanghai，China)進(jìn)行雜交，并經(jīng)過ScanArray4000激光掃描儀(Perkin-Elmer，Boston，Massachusetts)掃描。得到的圖象再經(jīng)過GenePix Pro3.0(Axon，Union City，California)分析處理。首先對(duì)芯片上40個(gè)管家基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化參數(shù)分析后，通過計(jì)算機(jī)軟件分析得到相應(yīng)每一個(gè)點(diǎn)的Cy5/Cy3比值，比值大于2者為上調(diào)基因，比值小于2者為下調(diào)基因。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.CoCl2對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)和活力的影響劑量-效應(yīng)關(guān)系---實(shí)施例1。
CoCl2是一種模擬低氧環(huán)境的常用試劑，廣泛應(yīng)用于低氧的研究。本發(fā)明首先通過細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞周期及annexinV檢測(cè)分析不同濃度(12.5-200μM)的CoCl2對(duì)APL細(xì)胞系NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)及活力的影響。如圖1A所示是不同濃度的CoCl2對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)影響的示意圖，從圖中可看出，CoCl2能夠有效地抑制NB4細(xì)胞生長(zhǎng)，并呈時(shí)間和劑量依賴性。其中，如圖1B所示，100-200μM CoCl2明顯降低細(xì)胞活力，而12.5-50μM CoCl2對(duì)細(xì)胞活力無明顯影響。從圖1C和圖1D可進(jìn)一步看出，12.5-50μM CoCl2并不明顯改變NB4細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因?yàn)樵缙诩?xì)胞凋亡的重要分子標(biāo)志annexinV陽(yáng)性細(xì)胞無明顯增加。
2.非毒性劑量的CoCl2誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化---實(shí)施例2。
在上述實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步觀察25-50μM CoCl2是否誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化。如圖2A所示，經(jīng)25-50μM CoCl2處理6天后NB4細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的成熟，且相關(guān)的細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，如核染色質(zhì)濃縮、核/漿比例減少、核變小并伴隨部分細(xì)胞核形的改變，但是仍可見到核仁。更為重要的是，這些受誘導(dǎo)的細(xì)胞也表達(dá)與粒細(xì)胞分化相關(guān)的細(xì)胞表面抗原CD11b(圖2B)，提示非毒性作用濃度的CoCl2能夠在一定程度上促進(jìn)NB4細(xì)胞分化。
3.CoCl2并不降解APL細(xì)胞特異的融合蛋白PML-RARα。
如前所述，95％以上的APL病人存在染色體易位t(15，17)，并表達(dá)PML-RARα融合蛋白。該融合蛋白與APL的發(fā)病具有重要關(guān)系。另一方面，PML-RARα融合蛋白的降解或剪切在ATRA或ATO誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化和(或)凋亡中發(fā)揮了重要作用。
為此，本發(fā)明觀察了CoCl2是否也同樣調(diào)變PML-RARα蛋白的表達(dá)。以抗PML抗體進(jìn)行的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示(圖3)，在未經(jīng)任何藥物處理的NB4細(xì)胞中，由于存在特異融合蛋白PML-RARα形成的同二聚體或PML-RARα/PML異二聚體，呈現(xiàn)大量細(xì)小的顆粒彌散地分布于整個(gè)細(xì)胞核中。經(jīng)過0.1μM ATRA和0.5μM ATO作用后，PML在細(xì)胞內(nèi)的分布呈現(xiàn)明顯的改變。經(jīng)0.1μM ATRA處理3天后的NB4細(xì)胞逐漸恢復(fù)PML在細(xì)胞內(nèi)的正常分布，表現(xiàn)為熒光顆粒減少，顆粒直徑增大等；而經(jīng)0.5μM ATO處理后可見細(xì)胞核內(nèi)的熒光顆粒數(shù)量明顯地減少。然而，50μM CoCl2處理3天后的加藥組與對(duì)照組比較無明顯的改變，同時(shí)也不影響ATRA和ATO對(duì)融合蛋白的作用在白血病細(xì)胞內(nèi)的定位。
如圖4所示，由Western blot證實(shí)，50μM CoCl2并不調(diào)變PML-RARα蛋白表達(dá)水平。但值得注意的是，經(jīng)過ATRA和CoCl2共同處理的NB4細(xì)胞在72小時(shí)可見到PML-RARα蛋白的剪切片段，提示50μM CoCl2可加速ATRA引起的PML-RARα蛋白的剪切。
4.CoCl2加強(qiáng)ATRA和ATO對(duì)NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效應(yīng)。
為了了解CoCl2對(duì)于ATRA和ATO誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化效應(yīng)的影響(圖5)，本發(fā)明進(jìn)一步觀察了0.1μM ATRA和0.5μM ATO單獨(dú)以及聯(lián)合50μMCoCl2作用于NB4細(xì)胞的效應(yīng)。結(jié)果顯示，50μM CoCl2聯(lián)合0.1μM ATRA處理NB4細(xì)胞4天后，CD11b和CD14的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比0.1μM ATRA單獨(dú)處理有明顯的增加，分別達(dá)到了97.23±0.58％和87.93±7.98％，而單獨(dú)用ATRA處理的只達(dá)到了81.4±2.17％和45.87±1.62％。因此，提示CoCl2和ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的作用具有明顯的疊加效應(yīng)。0.5μM ATO和50μM CoCl2的聯(lián)合運(yùn)用也產(chǎn)生同樣的效果。
5.CoCl2和低氧誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的效應(yīng)譜分析CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞分化并不伴隨PML-RARα蛋白水平的調(diào)變，提示CoCl2模擬的低氧環(huán)境可能對(duì)其它類型的AML細(xì)胞系具有同樣的誘導(dǎo)分化效應(yīng)。為此，我們選用了其它三種白血病細(xì)胞系即U937(M5型AML)、Kasumi-1(M2b型AML)和HL60(M3型AML)作為研究對(duì)象。結(jié)果顯示，25μM和50μM的CoCl2在抑制這三種細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，的確能有效地誘導(dǎo)U937細(xì)胞和Kasumi-1細(xì)胞分化。如圖6所示，經(jīng)50μM的CoCl2處理6天的U937和Kasumi-1細(xì)胞，呈現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)分化，同時(shí)伴隨有功能性分化指標(biāo)CD11b的表達(dá)上升。但是CoCl2雖然也能抑制HL60細(xì)胞的生長(zhǎng)但并不誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化。
6.2-3％的低氧環(huán)境對(duì)AML細(xì)胞分化的影響。
為了證實(shí)真正的低氧環(huán)境是否同樣也具有誘導(dǎo)這些白血病細(xì)胞系的分化作用，我們將NB4、U937和HL60分別置于2-5％O2和21％O2環(huán)境下培養(yǎng)。結(jié)果顯示，在2-3％的低氧環(huán)境下，NB4和U937細(xì)胞經(jīng)過2至9天的培養(yǎng)，出現(xiàn)了明顯的形態(tài)學(xué)分化，同時(shí)伴隨有功能性分化指標(biāo)CD11b的表達(dá)增加，而在5％和21％的低氧環(huán)境下則無類似的改變。如圖7所示，U937細(xì)胞在2％O2的環(huán)境下處理第4至第9天時(shí)，細(xì)胞體積明顯縮小，染色質(zhì)濃縮，核/漿比例減小，核變小，核仁消失，尤其是某些細(xì)胞核的形狀還出現(xiàn)了明顯的馬蹄樣改變以及伴隨有粒系分化指標(biāo)CD11b的表達(dá)上升(參表2)。然而這些分化相關(guān)的改變并不存在于在2-3％的低氧環(huán)境下培養(yǎng)的HL60細(xì)胞。
表2.U937細(xì)胞放置于2％O2培養(yǎng)時(shí)，相應(yīng)的細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)6天 9天21％O22％O221％O22％O2CD11b24.6±4.10 38.9±3.39 18.6±1.2250.27±5.90CD11c25.0±2.05 60.5±6.79 26.13±1.55 61.2±3.987.CoCl2誘導(dǎo)部分新鮮AML細(xì)胞分化。
由于細(xì)胞系經(jīng)過體外的長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，可能已經(jīng)不能真正反映急性白血病細(xì)胞的特性。于是，本發(fā)明也研究了50μM CoCl2對(duì)來自3例存在t(15，17)的APL病人，4例存在t(8，21)的M2型病人，2例M4型病人和2例M5型病人的新鮮白血病細(xì)胞的體外效應(yīng)。結(jié)果顯示，50μM的CoCl2單獨(dú)處理上述3例APL細(xì)胞并不能有效誘導(dǎo)其細(xì)胞分化，但在其中一例(case3)，CoCl2能加強(qiáng)0.1μM ATRA誘導(dǎo)的分化效應(yīng)。另外，ATRA和ATO不能誘導(dǎo)其它8例AML病人原代細(xì)胞發(fā)生分化，但是50μM的CoCl2卻能誘導(dǎo)其中4例病人細(xì)胞發(fā)生分化，包括2例M2b型以及2例M4型病人。如圖8所示，是具有代表性的存在t(8，21)以及AML1-ETO轉(zhuǎn)錄本的AML-M2b型白血病病人原代細(xì)胞，經(jīng)50μM CoCl2處理6天后出現(xiàn)了明顯的形態(tài)學(xué)分化。
8.CoCl2對(duì)NB4細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響源于cDNA陣列的結(jié)果。
為了進(jìn)一步探索低氧模擬環(huán)境下CoCl2誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的分子機(jī)制，本發(fā)明運(yùn)用cDNA micro array技術(shù)觀察了NB4細(xì)胞經(jīng)過50μM的CoCl2處理及未處理3天時(shí)的基因表達(dá)量的變化。在功能已知的8000多個(gè)基因中，大多數(shù)基因的RNA水平無改變，包括P53以及C-myc等。后兩者經(jīng)Western blot所證實(shí)(圖9)。但是，有68個(gè)基因下調(diào)2倍以上，這些基因主要涉及細(xì)胞代謝、細(xì)胞骨架、DNA合成和修復(fù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)行以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。受50μM CoCl2誘導(dǎo)后上調(diào)的基因只有二個(gè)，即白介素8(IL-8)和細(xì)胞因子C-X-C基元受體4(CXCR4)。基于以上初步發(fā)現(xiàn)，可以推測(cè)可能在低氧條件下，白血病細(xì)胞通過分泌某些因子促使其發(fā)生分化。但是，預(yù)先用CoCl2處理白血病細(xì)胞后的條件培養(yǎng)液并不能誘導(dǎo)這些細(xì)胞發(fā)生分化，提示低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞分化可能是通過白血病細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)途徑而引發(fā)。
9.CoCl2能有效抑制NB4和U937細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白的降解---
為了了解HIF-1α與CoCl2誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞的分化是否存在著聯(lián)系，本發(fā)明運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測(cè)了CoCl2對(duì)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的mRNA和蛋白的表達(dá)水平的可能影響(圖10)。結(jié)果顯示，50μM的CoCl2處理并不改變所有檢測(cè)的三種AML細(xì)胞系的HIF-1α的mRNA水平，但它能快速增加NB4和U937細(xì)胞中HIF-1α蛋白水平。因此，與大多數(shù)組織一樣，CoCl2有利于這兩種細(xì)胞穩(wěn)定HIF-1α蛋白水平，值得一提的是，HL60細(xì)胞在mRNA水平也有HIF-1α的表達(dá)以及正常的HIF-1α cDNA序列，但CoCl2卻不誘導(dǎo)HL60細(xì)胞中HIF-1α蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。
10.抑制HIF-1α蛋白水平會(huì)明顯拮抗CoCl2的誘導(dǎo)分化效應(yīng)---
為了進(jìn)一步明確HIF-1α是否參與了CoCl2誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞分化過程，應(yīng)用該蛋白的抑制劑來觀察其對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)效應(yīng)的影響是目前生物學(xué)研究的常用方法。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，某些一氧化氮供體，如3-morpholinosychnonimine(SIN-1)能夠降低HIF-1α表達(dá)的穩(wěn)定性。因此，我們觀察了在HIF-1α蛋白表達(dá)降低的前提下，其對(duì)CoCl2誘導(dǎo)分化效應(yīng)的影響(圖11)。結(jié)果顯示，500μM的SIN-1幾乎完全抑制HIF-1α在NB4和U937細(xì)胞中的聚集。與此同時(shí)，SIN-1在抑制NB4和U937細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，能有效地拮抗CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞分化，因而可知HIF-1α介導(dǎo)或參與了低氧誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞分化過程。
通過前述實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果分析可知，氯化鈷的使用量范圍為非毒性劑量，最優(yōu)范圍為12.5-50μM，并可配合三氧化二砷或全反式維甲酸一起使用。三氧化二砷的使用劑量為10mg/日，靜脈活性；全反式維甲酸的使用劑量為25-45mg/日，一日一次。
本發(fā)明利用低氧環(huán)境抑制HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶的活性，使得HIF-1α的降解被抑制的特性，將HIF-1α用于篩選適當(dāng)?shù)牡脱跄M物，用于使白血病細(xì)胞進(jìn)行分化，從而達(dá)到治療白血病的目的。
本發(fā)明利用低氧模擬物CoCl2可通過其自身造成一個(gè)低氧模擬環(huán)境的特性，或者可以直接將白血病細(xì)胞在低氧環(huán)境下經(jīng)氯化鈷處理，通過抑制HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶的活性，使得可以有效抑制白血病細(xì)胞中的HIF-1α降解，從而誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化，達(dá)到治療腫瘤、尤其是白血病的目的。
采用HIF-1基因的靶向治療可使缺氧組織中誘導(dǎo)新生血管生成，誘導(dǎo)HIF-1活性的小分子物質(zhì)可保護(hù)因缺氧引起的細(xì)胞死亡，抑制HIF-1活性的小分子物質(zhì)則可能有利于腫瘤和肺部高血壓的治療，因此，利用模擬低氧環(huán)境的小分子化合物可能對(duì)于AML具有治療潛力，而HIF-1a及其相關(guān)分子可能成為治療白血病的候選藥物靶標(biāo)，可以根據(jù)不同的治療目的來選用不同的治療策略。
權(quán)利要求
1.HIF-1α在治療白血病藥物的篩選中的應(yīng)用，其特征在于通過將HIF-1α作為藥物靶標(biāo)，來篩選能使HIF-1α的降解被抑制、從而對(duì)白血病細(xì)胞產(chǎn)生分化作用的藥物。
2.如權(quán)利要求1所述的HIF-1α在治療白血病藥物的篩選中的應(yīng)用，其特征在于利用低氧環(huán)境抑制HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶的活性，使得HIF-1α的降解被抑制的特性，將HIF-1α用于篩選適當(dāng)?shù)牡脱跄M物用于使白血病細(xì)胞進(jìn)行分化。
3.如權(quán)利要求1或2所述的HIF-1α在治療白血病藥物的篩選中的應(yīng)用，其特征在于利用HIF-1α作為藥物靶標(biāo)，可篩選出氯化鈷用于實(shí)現(xiàn)對(duì)白血病細(xì)胞的分化作用。
4.如權(quán)利要求3所述的HIF-1α在治療白血病藥物的篩選中的應(yīng)用，其特征在于所述白血病細(xì)胞是指NB4細(xì)胞、或U937細(xì)胞和各型AML細(xì)胞等。
全文摘要
本發(fā)明關(guān)于HIF－1α在誘導(dǎo)分化治療白血病藥物的篩選中的應(yīng)用，其通過將HIF－1α作為藥物靶標(biāo)，在低氧環(huán)境下來篩選可對(duì)白血病細(xì)胞產(chǎn)生分化作用的藥物。利用HIF－1α作為藥物靶標(biāo)，可篩選出氯化鈷用于實(shí)現(xiàn)對(duì)白血病細(xì)胞的分化作用。所述白血病細(xì)胞是指NB4細(xì)胞、U937細(xì)胞及Kasumi細(xì)胞和各型AML細(xì)胞等。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1523357SQ0315082
公開日2004年8月25日 申請(qǐng)日期2003年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月5日
發(fā)明者陳國(guó)強(qiáng), 趙倩, 黃鶯 申請(qǐng)人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院