專利名稱：一種簡(jiǎn)單的磁顆粒功能化修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及的是一種簡(jiǎn)單的磁顆粒功能化修飾方法。
背景技術(shù)：
磁納米和微米顆粒是一種在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著重大應(yīng)用價(jià)值的新型材料。磁顆粒的表面性質(zhì)對(duì)其實(shí)際應(yīng)用有著極其重要的影響?？傮w而言，磁顆粒通過表面功能化修飾 起到如下三個(gè)方面的作用(1)控制磁顆粒的尺寸和形貌；(2)賦予磁顆粒合適的表面官能團(tuán)和膠體穩(wěn)定性；(3)進(jìn)行磁顆粒的生物學(xué)功能化。在磁顆粒生物學(xué)功能化方面，針對(duì)不同的生物分子，如寡聚核苷酸、蛋白質(zhì)(含抗原、抗體、酶)、多肽等，不同的修飾方法已經(jīng)被用來對(duì)磁顆粒表面進(jìn)行功能化修飾。比如，F(xiàn)engqin Hu等人(Adv. Mat. 2006. 18，2553-2556)利用蛋白質(zhì)修飾試劑N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)和I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)將癌靶區(qū)抗體上的氨基和Fe3O4磁納米顆粒表面的羧基相連接，從而構(gòu)建了靶向到癌部位的磁納米顆粒。但是這種連接方法反應(yīng)活性較低，連接到磁顆粒表面的生物分子較少。Hao Shang等人(J Am. Chem.Soc. 2007. 129,6640-6646)將Fe3O4磁微米顆粒表面的羧基氨基化，將蛋白質(zhì)的伯胺通過N-琥珀酰亞胺-S-乙?；虼宜狨マD(zhuǎn)化成巰基，隨后利用N-羥基琥珀酰亞胺-聚乙二醇-乙烯砜，將巰基化的蛋白質(zhì)與氨基化的磁微米顆粒連接起來。但是這種連接方法中所用的N-羥基琥珀酰亞胺-聚乙二醇-乙烯砜?jī)r(jià)格昂貴。因此，有必要尋找一種簡(jiǎn)單的磁顆粒功能化修飾方法，能夠具有高的反應(yīng)活性，并且，反應(yīng)中所用的試劑便宜，最后，有必要在雙功能化的聚乙二醇分子中加入分子量小的單功能化聚乙二醇分子，從而在長(zhǎng)的雙功能化的聚乙二醇分子將蛋白質(zhì)連接到磁顆粒上后，既能給與蛋白質(zhì)一定的自由度，又能保證磁顆粒的生物相容性和降低非特異性相互作用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單的磁顆粒功能化修飾方法，即用于表面羧基化的磁顆粒表面功能化修飾蛋白質(zhì)的方法，該方法步驟簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，價(jià)格相對(duì)便宜，可以實(shí)現(xiàn)蛋白等的分離純化，臨床分子診斷，單分子磁鑷技術(shù)研究蛋白分子間相互作用等的目標(biāo)。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是本發(fā)明所述簡(jiǎn)單的磁顆粒功能化修飾方法，首先利用聚醚酰亞胺(PEI)將磁納米或者微米顆粒表面的羧基官能團(tuán)氨基化；隨后將一端氨基甲酸叔丁酯(Boc)基團(tuán)保護(hù)而另外一端為N-羥基琥珀酰亞胺的聚乙二醇(PEG)高分子偶聯(lián)到氨基化的磁顆粒上；其次將蛋白的伯胺利用蛋白修飾試劑N-琥珀酰亞胺-S-乙?；虼宜狨?SATA)或者N-琥珀酰亞胺-3-乙酰硫代丙酸酯(SATP)修飾為巰基；最后將Boc保護(hù)基團(tuán)脫除，并與巰基化的蛋白反應(yīng)，從而將蛋白修飾到磁納米或者微米顆粒上。進(jìn)一步的，本發(fā)明所述方法具體操作包括以下步驟
I)磁顆粒表面氨基化取表面羧基化磁顆粒溶液，通過磁鐵吸引在反應(yīng)器壁上，移液槍取走液體，加入碳酸鹽緩沖液，超聲振動(dòng)分散磁顆粒，重復(fù)上述清洗過程兩次，隨后聚醚酰亞胺(PEI)的碳酸鹽緩沖液，反應(yīng)一段時(shí)間，利用碳酸鹽緩沖液，清洗磁顆粒。2)磁顆粒表面聚乙二醇化將步驟I)得到的磁顆粒，加入氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇(分子量為3000)4-羥基琥珀酰亞胺(80(^^6-3000-順5)和甲氧基-聚乙二醇(分子量為2000) -N-羥基琥珀酰亞胺(mPEG-2000-NHS)混合碳酸鹽緩沖液中，反應(yīng)一段時(shí)間，利用超純水溶液，清洗磁顆粒。從而將磁顆粒表面聚乙二醇化，長(zhǎng)鏈雙功能化PEG(Boc-PEG-3000-NHS)和短鏈單功能化PEG (mPEG-2000-NHS)的混合使用可以在保證在利用長(zhǎng)鏈雙功能化PEG來連接蛋白分子的同時(shí)，也利用長(zhǎng)短鏈PEG分子的差別來保證給與所連接蛋白一定的空間自由度。3)磁顆粒表面Boc官能團(tuán)脫保護(hù)將步驟2)得到的磁顆粒，加入適量的三氟乙酸，超聲振蕩，反應(yīng)一段時(shí)間。利用磷酸鹽緩沖液，清洗磁顆粒。 4)磁顆粒表面馬來酰亞胺活化將步驟3)得到的磁顆粒，加入蛋白交聯(lián)劑4- (N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-I-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)或者4- (N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(Sulf0-SMCC)的二甲基甲酰胺溶液中，反應(yīng)一段時(shí)間。利用磷酸鹽緩沖液，清洗磁顆粒。5)蛋白質(zhì)交聯(lián)劑修飾引入受保護(hù)的巰基在蛋白溶液中加入蛋白修飾試劑N-琥珀酰亞胺-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)或者N-琥珀酰亞胺-3-乙酰硫代丙酸酯(SATP)，并反應(yīng)一段時(shí)間。6)蛋白質(zhì)巰基化將步驟5)得到的蛋白質(zhì)溶液，加入脫乙酰緩沖液，反應(yīng)一段時(shí)間，隨后利用脫鹽柱脫去蛋白溶液中的鹽。7)磁顆粒表面功能化修飾蛋白質(zhì)將步驟4)得到的磁顆粒，加入步驟6)中處理得到的蛋白溶液，反應(yīng)一段時(shí)間，利用磷酸鹽緩沖液，清洗磁顆粒。4攝氏度保存?zhèn)溆?。本發(fā)明選用磁顆粒為表面羧基化修飾的納米或者微米顆粒。步驟I)中所用碳酸鹽緩沖液為pH條件為8. 2的0. 05mol/L碳酸鈉水溶液，所用聚醚酰亞胺的碳酸鹽緩沖液濃度為2-10%，反應(yīng)時(shí)間為l-3h。步驟2)中所用的聚乙二醇混合液中Boc-PEG-3000-NHS摩爾百分比率為5%_20%，總PEG濃度為l-40mM，反應(yīng)時(shí)間為l_3h。步驟3)中與三氟乙酸反應(yīng)時(shí)間為5-10min。步驟4)中所用的交聯(lián)劑SMCC先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亞砜，或者Sulfo-SMCC首先溶解于超純水中，隨后再將SMCC或者Sulfo-SMCC溶液加入到PBS緩沖體系中，濃度為0. l-2mg/mL,反應(yīng)時(shí)間為15_45min。步驟5)中蛋白修飾試劑SATA (SATP)先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亞砜，隨后再加入到蛋白溶液中，其與蛋白的摩爾比率范圍為10:1到250:1，反應(yīng)時(shí)間為0. 5-3h。步驟6)中脫乙酰緩沖液為含有0. 5M羥胺、25mM乙二胺四乙酸EDTA的PBS緩沖混合溶液，PH7. 2-7. 5。反應(yīng)時(shí)間為l_3h。步驟7)中蛋白濃度為l_40ii g/mL，反應(yīng)時(shí)間為0. 5_3h。本發(fā)明提供了上述用于表面羧基化的磁顆粒表面功能化修飾蛋白質(zhì)的方法，該方法步驟簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，價(jià)格相對(duì)便宜，可以實(shí)現(xiàn)蛋白等的分離純化，臨床分子診斷，單分子磁鑷技術(shù)研究蛋白分子間相互作用等的目標(biāo)。
圖I為本發(fā)明中磁顆粒表面功能化修飾蛋白質(zhì)的示意圖
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例以本發(fā)明技術(shù)方案為前提進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例II)磁顆粒表面氨基化取ImL表面羧基化的磁顆粒溶液，通過磁鐵吸引在I. 5mL離心管壁上，移液槍取走液體，加入0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH8. 2)，超聲振動(dòng)分散磁顆粒， 重復(fù)上述清洗過程兩次，隨后加入5%聚醚酰亞胺的碳酸鹽緩沖液，反應(yīng)2h。利用碳酸鹽緩沖液清洗磁顆粒三次，去除過量的聚醚酰亞胺。2)磁顆粒表面聚乙二醇化將步驟I)得到的磁顆粒，加入ImL的氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇(分子量為3000) -N-羥基琥珀酰亞胺(Boc-PEG-3000-NHS)和甲氧基-聚乙二醇(分子量為2000) -N-羥基琥珀酰亞胺(mPEG-2000-NHS)混合碳酸鹽緩沖液(總PEG濃度為40mM，Boc-PEG-3000-NHS與mPEG-2000-NHS摩爾比為1:4)中，反應(yīng)2h。利用超純水清洗磁顆粒三次，去除過量的聚乙二醇分子。3)磁顆粒表面Boc官能團(tuán)脫保護(hù)將步驟2)得到的磁顆粒，加入ImL三氟乙酸，超聲振蕩，反應(yīng)5min。利用磷酸鹽緩沖液清洗磁顆粒三次，去除過量的三氟乙酸。4)磁顆粒表面馬來酰亞胺活化將步驟3)得到的磁顆粒,加入ImLO. lmg/mL的蛋白交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-I-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)磷酸鹽緩沖液，反應(yīng)30min。利用磷酸鹽緩沖液，清洗磁顆粒三次，去除過量的SMCC。5)蛋白質(zhì)交聯(lián)劑修飾引入受保護(hù)的巰基在單克隆抗羊IgG溶液中加入蛋白修飾試劑N-琥珀酰亞胺-S-乙?；虼宜狨?SATA)的二甲基甲酰胺溶液，SATA與蛋白的摩爾比率范圍為25:1，并反應(yīng)30min。6)蛋白質(zhì)巰基化將步驟5)得到的蛋白質(zhì)溶液，加入脫乙酰緩沖液(0. 5M羥胺，25mM乙二胺四乙酸(EDTA)，PBS緩沖體系，pH7. 2-7. 5)(脫乙酰緩沖液與蛋白溶液體積比為1:10)，反應(yīng)21!。隨后利用脫鹽柱脫去蛋白溶液中的鹽，得到伯胺巰基活化的蛋白質(zhì)。7)磁顆粒表面功能化修飾蛋白質(zhì)將步驟4)得到的磁顆粒,加入lmL2 U g/mL的步驟6)得到的伯胺巰基活化的蛋白質(zhì)，反應(yīng)2h。利用磷酸鹽緩沖液清洗磁顆粒三次，最后加入ImL磷酸鹽緩沖液，4攝氏度保存?zhèn)溆?。本發(fā)明采用的磁顆粒可以是表面羧基官能團(tuán)修飾的直徑為納米級(jí)或者微米級(jí)的磁顆粒。實(shí)施例2I)磁顆粒表面氨基化取ImL表面羧基化的磁顆粒溶液，通過磁鐵吸引在I. 5mL離心管壁上，移液槍取走液體，加入0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH8. 2)，超聲振動(dòng)分散磁顆粒，重復(fù)上述清洗過程兩次，隨后加入5%聚醚酰亞胺的碳酸鹽緩沖液，反應(yīng)lh。利用碳酸鹽緩沖液清洗磁顆粒三次，去除過量的聚醚酰亞胺。
2)磁顆粒表面聚乙二醇化將步驟I)得到的磁顆粒，加入ImL的氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇(分子量為3000) -N-羥基琥珀酰亞胺(Boc-PEG-3000-NHS)和甲氧基-聚乙二醇(分子量為2000) -N-羥基琥珀酰亞胺(mPEG-2000-NHS)混合碳酸鹽緩沖液(總PEG濃度為20mM，Boc-PEG-3000-NHS與mPEG-2000-NHS摩爾比為1:9)中，反應(yīng)2h。利用超純水清洗磁顆粒三次，去除過量的聚乙二醇分子。3)磁顆粒表面Boc官能團(tuán)脫保護(hù)將步驟2)得到的磁顆粒，加入ImL三氟乙酸，超聲振蕩，反應(yīng)5min。利用磷酸鹽緩沖液清洗磁顆粒三次，去除過量的三氟乙酸。4)磁顆粒表面馬來酰亞胺活化將步驟3)得到的磁顆粒,加入ImLO. 2mg/mL的蛋白交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-I-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)磷酸鹽緩沖液，反應(yīng)30min。利用磷酸鹽緩沖液，清洗磁顆粒三次，去除過量的SMCC。5)蛋白質(zhì)交聯(lián)劑修飾引入受保護(hù)的巰基在多克隆羊IgG蛋白溶液中加入蛋白修飾試劑N-琥珀酰亞胺-S-乙?；虼宜狨?SATA)的二甲基甲酰胺溶液，SATA與蛋白的 摩爾比率范圍為50:1，并反應(yīng)30min。6)蛋白質(zhì)巰基化將步驟5)得到的蛋白質(zhì)溶液，加入脫乙酰緩沖液(0. 5M羥胺，25mM乙二胺四乙酸(EDTA)，PBS緩沖體系，pH7. 2-7. 5)(脫乙酰緩沖液與蛋白溶液體積比為1:10)，反應(yīng)21!。隨后利用脫鹽柱脫去蛋白溶液中的鹽，得到伯胺巰基活化的蛋白質(zhì)。7)磁顆粒表面功能化修飾蛋白質(zhì)將步驟4)得到的磁顆粒,加入ImLlO U g/mL的步驟6)得到的伯胺巰基活化的蛋白質(zhì)，反應(yīng)2h。利用磷酸鹽緩沖液清洗磁顆粒三次，最后加入ImL磷酸鹽緩沖液，4攝氏度保存?zhèn)溆?。?shí)施例3I)磁顆粒表面氨基化取ImL表面羧基化的磁顆粒溶液，通過磁鐵吸引在I. 5mL離心管壁上，移液槍取走液體，加入0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH8. 2)，超聲振動(dòng)分散磁顆粒，重復(fù)上述清洗過程兩次，隨后加入5%聚醚酰亞胺的碳酸鹽緩沖液，反應(yīng)2h。利用碳酸鹽緩沖液清洗磁顆粒三次，去除過量的聚醚酰亞胺。2)磁顆粒表面聚乙二醇化將步驟I)得到的磁顆粒，加入ImL的氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇(分子量為3000) -N-羥基琥珀酰亞胺(Boc-PEG-3000-NHS)和甲氧基-聚乙二醇(分子量為2000) -N-羥基琥珀酰亞胺(mPEG-2000-NHS)混合碳酸鹽緩沖液(總PEG濃度為10mM，Boc-PEG-3000-NHS與mPEG-2000-NHS摩爾比為1:4)中，反應(yīng)2h。利用超純水清洗磁顆粒三次，去除過量的聚乙二醇分子。3)磁顆粒表面Boc官能團(tuán)脫保護(hù)將步驟2)得到的磁顆粒，加入ImL三氟乙酸，超聲振蕩，反應(yīng)5min。利用磷酸鹽緩沖液清洗磁顆粒三次，去除過量的三氟乙酸。4)磁顆粒表面馬來酰亞胺活化將步驟3)得到的磁顆粒,加入ImLO. 2mg/mL的蛋白交聯(lián)劑4- (N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(Sulfo-SMCC)磷酸鹽緩沖液，反應(yīng)30min。利用磷酸鹽緩沖液,清洗磁顆粒三次，去除過量的Sulfo_SMCC。5)蛋白質(zhì)交聯(lián)劑修飾引入受保護(hù)的巰基在單克隆抗羊IgG蛋白溶液中加入蛋白修飾試劑N-琥珀酰亞胺-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)的二甲基亞砜溶液，SATA與蛋白的摩爾比率范圍為25:1，并反應(yīng)30min。6)蛋白質(zhì)巰基化將步驟5)得到的蛋白質(zhì)溶液，加入脫乙酰緩沖液(0. 5M羥胺，25mM乙二胺四乙酸(EDTA)，PBS緩沖體系，pH7. 2-7. 5)，脫乙酰緩沖液與蛋白溶液體積比為1:10，反應(yīng)I. 5h。隨后利用脫鹽柱脫去蛋白溶液中的鹽，得到伯胺巰基活化的蛋白質(zhì)。7)磁顆粒表面功能化修飾蛋白質(zhì)將步驟4)得到的磁顆粒,加入lmL5 u g/mL的步驟6)得到的伯胺巰基活化的蛋白質(zhì)，反應(yīng)2h。利用磷酸鹽緩沖液清洗磁顆粒三次，最后加入ImL磷酸鹽緩沖液，4攝氏度保存?zhèn)溆?。?shí)施例4I)磁顆粒表面氨基化取ImL表面羧基化的磁顆粒溶液，通過磁鐵吸引在I. 5mL離心管壁上，移液槍取走液體，加入合適體積的0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH8. 2)，超聲振動(dòng)分散磁顆粒，重復(fù)上述清洗過程兩次，隨后加入5%聚醚酰亞胺的碳酸鹽緩沖液，反應(yīng)2h。利用碳酸鹽緩沖液清洗磁顆粒三次，去除過量的聚醚酰亞胺。2)磁顆粒表面聚乙二醇化步驟I)得到的磁顆粒，加入ImL的氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇(分子量為3000) -N-羥基琥珀酰亞胺(Boc-PEG-3000-NHS)和甲氧基-聚乙 二醇(分子量為2000) -N-羥基琥珀酰亞胺(mPEG-2000-NHS)混合碳酸鹽緩沖液(總PEG濃度為30mM，Boc-PEG-3000-NHS與mPEG-2000-NHS摩爾比為1:9)中，反應(yīng)Ih。利用超純水清洗磁顆粒三次，去除過量的聚乙二醇分子。3)磁顆粒表面Boc官能團(tuán)脫保護(hù)步驟2)得到的磁顆粒，加入ImL三氟乙酸，超聲振蕩，反應(yīng)5min。利用磷酸鹽緩沖液清洗磁顆粒三次，去除過量的三氟乙酸。4)磁顆粒表面馬來酰亞胺活化步驟3)得到的磁顆粒,加入ImLO. 2mg/mL的蛋白交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-I-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)磷酸鹽緩沖液，反應(yīng)30min。利用磷酸鹽緩沖液，清洗磁顆粒三次，去除過量的SMCC。5)蛋白質(zhì)交聯(lián)劑修飾引入受保護(hù)的巰基在多克隆羊IgG蛋白溶液中加入蛋白修飾試劑N-琥珀酰亞胺-3-乙酰硫代丙酸酯(SATP)的二甲基甲酰胺溶液，SATP與蛋白的摩爾比率范圍為25:1，并反應(yīng)45min。6)蛋白質(zhì)巰基化將步驟5)得到的蛋白質(zhì)溶液，加入脫乙酰緩沖液(0. 5M羥胺，25mM乙二胺四乙酸，PBS緩沖體系，pH7. 2-7. 5)，脫乙酰緩沖液與蛋白溶液體積比為1:10，反應(yīng)lh。隨后利用脫鹽柱脫去蛋白溶液中的鹽，得到伯胺巰基活化的蛋白質(zhì)。7)磁顆粒表面功能化修飾蛋白質(zhì)將步驟4)得到的磁顆粒,加入lmL5 U g/mL的步驟6)得到的伯胺巰基活化的蛋白質(zhì)，反應(yīng)lh。利用磷酸鹽緩沖液清洗磁顆粒三次，最后加入ImL磷酸鹽緩沖液，4攝氏度保存?zhèn)溆?。?shí)施例5I)磁顆粒表面氨基化取ImL表面羧基化的磁顆粒溶液，通過磁鐵吸引在I. 5mL離心管壁上，移液槍取走液體，加入合適體積的0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH8.2)，超聲振動(dòng)分散磁顆粒，重復(fù)上述清洗過程兩次，隨后加入5%聚醚酰亞胺的碳酸鹽緩沖液，反應(yīng)I. 5h。利用碳酸鹽緩沖液清洗磁顆粒三次，去除過量的聚醚酰亞胺。2)磁顆粒表面聚乙二醇化將步驟I)得到的磁顆粒，加入ImL的氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇(分子量為3000) -N-羥基琥珀酰亞胺(Boc-PEG-3000-NHS)和甲氧基-聚乙二醇(分子量為2000) -N-羥基琥珀酰亞胺(mPEG-2000-NHS)混合碳酸鹽緩沖液(總PEG濃度為25mM，Boc-PEG-3000-NHS與mPEG-2000-NHS摩爾比為1:7)中，反應(yīng)lh。利用超純水清洗磁顆粒三次，去除過量的聚乙二醇分子。3)磁顆粒表面Boc官能團(tuán)脫保護(hù)將步驟2)得到的磁顆粒，加入ImL三氟乙酸，超聲振蕩，反應(yīng)5min。利用磷酸鹽緩沖液清洗磁顆粒三次，去除過量的三氟乙酸。4)磁顆粒表面馬來酰亞胺活化將步驟3)得到的磁顆粒,加入ImLO. 2mg/mL的蛋白交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-I-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)磷酸鹽緩沖液，反應(yīng)30min。利用磷酸鹽緩沖液，清洗磁顆粒三次，去除過量的SMCC。5)蛋白質(zhì)交聯(lián)劑修飾引入受保護(hù)的巰基在單克隆抗羊IgG蛋白溶液中加入蛋白修飾試劑N-琥珀酰亞胺-3-乙酰硫代丙酸酯(SATP)的二甲基甲酰胺溶液，SATP與蛋白的摩爾比率范圍為25:1，并反應(yīng)30min。6)蛋白質(zhì)巰基化將步驟5)得到的蛋白質(zhì)溶液，加入脫乙酰緩沖液(0. 5M羥胺，25mM乙二胺四乙酸，PBS緩沖體系，pH7. 2-7. 5)，脫乙酰緩沖液與蛋白溶液體積比為1:10，反應(yīng)2h。隨后利用脫鹽柱脫去蛋白溶液中的鹽，得到伯胺巰基活化的蛋白質(zhì)。7)磁顆粒表面功能化修飾蛋白質(zhì)將步驟4)得到的磁顆粒,加入lmL5 U g/mL的步驟6)得到的伯胺巰基活化的蛋白質(zhì)，反應(yīng)I. 5h。利用磷酸鹽緩沖液清洗磁顆粒三次，最 后加入ImL磷酸鹽緩沖液，4攝氏度保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜鰧?shí)施例中的磁顆?？梢允潜砻骠然倌軋F(tuán)修飾的直徑為納米級(jí)或者微米級(jí)的磁顆粒，只要符合該要求，就可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。盡管本發(fā)明的內(nèi)容已經(jīng)通過上述優(yōu)選實(shí)施例作了詳細(xì)介紹，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到上述的描述不應(yīng)被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀了上述內(nèi)容后，對(duì)于本發(fā)明的多種修改和替代都將是顯而易見的。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求來限定。
權(quán)利要求
1.一種簡(jiǎn)單的磁顆粒功能化修飾方法，其特征在于首先利用聚醚酰亞胺PEI將磁納米或者微米顆粒表面的羧基官能團(tuán)氨基化；隨后將一端氨基甲酸叔丁酯Boc基團(tuán)保護(hù)而另外一端為N-羥基琥珀酰亞胺的聚乙二醇PEG高分子偶聯(lián)到氨基化的磁顆粒上；其次將蛋白的伯胺利用蛋白修飾試劑N-琥珀酰亞胺-S-乙?；虼宜狨ATA或者N-琥珀酰亞胺-3-乙酰硫代丙酸酯SATP修飾為巰基；最后將Boc保護(hù)基團(tuán)脫除，并與巰基化的蛋白反應(yīng)，從而將蛋白修飾到磁納米或者微米顆粒上。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的簡(jiǎn)單的磁顆粒功能化修飾方法，其特征在于所述方法包括以下步驟 1)磁顆粒表面氨基化取表面羧基化磁顆粒溶液，通過磁鐵吸引在反應(yīng)器壁上，移液槍取走液體，加入碳酸鹽緩沖液，超聲振動(dòng)分散磁顆粒，重復(fù)上述清洗過程兩次，隨后加入聚醚酰亞胺PEI的碳酸鹽緩沖液，反應(yīng)一段時(shí)間，利用碳酸鹽緩沖液，清洗磁顆粒； 2)磁顆粒表面聚乙二醇化將步驟I)得到的磁顆粒，加入氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇(分子量為3000) -N-羥基琥珀酰亞胺和甲氧基-聚乙二醇(分子量為2000) -N-羥基琥珀酰亞胺混合碳酸鹽緩沖液中，反應(yīng)一段時(shí)間，利用超純水溶液，清洗磁顆粒； 3)磁顆粒表面Boc官能團(tuán)脫保護(hù)將步驟2)得到的磁顆粒，加入三氟乙酸，超聲振蕩，反應(yīng)一段時(shí)間，利用磷酸鹽緩沖液，清洗磁顆粒； 4)磁顆粒表面馬來酰亞胺活化將步驟3)得到的磁顆粒，加入蛋白交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-I-羧酸琥珀酰亞胺酯SMCC或者4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽Sulfo-SMCC的二甲基甲酰胺溶液中，反應(yīng)一段時(shí)間，利用磷酸鹽緩沖液，清洗磁顆粒； 5)蛋白質(zhì)交聯(lián)劑修飾引入受保護(hù)的巰基在蛋白溶液中加入蛋白修飾試劑N-琥珀酰亞胺-S-乙?；虼宜狨ATA或者N-琥珀酰亞胺-3-乙酰硫代丙酸酯SATP，并反應(yīng)一段時(shí)間； 6)蛋白質(zhì)巰基化步驟5)得到的蛋白質(zhì)溶液，加入脫乙酰緩沖液，反應(yīng)一段時(shí)間，隨后利用脫鹽柱脫去蛋白溶液中的鹽； 7)磁顆粒表面功能化修飾蛋白質(zhì)將步驟4)得到的磁顆粒，加入步驟6)中處理得到的蛋白溶液，反應(yīng)一段時(shí)間，利用磷酸鹽緩沖液，清洗磁顆粒，4攝氏度保存?zhèn)溆谩?br>
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟I)中所用碳酸鹽緩沖液為pH條件為8. 2的0. 05mol/L碳酸鈉水溶液，所用聚醚酰亞胺的碳酸鹽緩沖液濃度為2_10%，反應(yīng)時(shí)間為l_3h。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)中所用的聚乙二醇混合液中Boc-PEG-3000-NHS摩爾百分比率為5%_20%，總PEG濃度為l_40mM，反應(yīng)時(shí)間為l_3h。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟3)中與三氟乙酸反應(yīng)時(shí)間為5_10mino
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟4)中所用的交聯(lián)劑SMCC先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亞砜，或者Sulfo-SMCC首先溶解于超純水中，隨后再將SMCC或者Sulfo-SMCC溶液加入到PBS緩沖體系中，濃度為0. l-2mg/mL，反應(yīng)時(shí)間為15_45min。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟5)中蛋白修飾試劑SATA、SATP先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亞砜，隨后再加入到蛋白溶液中，其與蛋白的摩爾比率范圍為10:1到250:1，反應(yīng)時(shí)間為0. 5-3h。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟6)中脫乙酰緩沖液為含有0.5M羥胺、25mM乙二胺四乙酸EDTA的PBS緩沖混合溶液，pH7. 2-7. 5。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟7)中蛋白濃度為1-40Ug/mL，反應(yīng)時(shí)間為0. 5-3h。
全文摘要
本發(fā)明公開一種簡(jiǎn)單的磁顆粒功能化修飾方法，首先利用聚醚酰亞胺將磁納米或者微米顆粒表面的羧基官能團(tuán)氨基化，隨后將一端氨基甲酸叔丁酯(Boc)基團(tuán)保護(hù)而另外一端為N-羥基琥珀酰亞胺的PEG高分子偶聯(lián)到氨基化的磁顆粒上，其次將蛋白的伯胺利用蛋白修飾試劑N-琥珀酰亞胺-S-乙?；虼宜狨セ騈-琥珀酰亞胺-3-乙酰硫代丙酸酯修飾為巰基，最后將Boc保護(hù)基團(tuán)脫除，并與巰基化的蛋白反應(yīng)，從而將蛋白修飾到磁納米或者微米顆粒上。本發(fā)明步驟簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，價(jià)格相對(duì)便宜，可以實(shí)現(xiàn)蛋白等的分離純化，臨床分子診斷，單分子磁鑷技術(shù)研究蛋白分子間相互作用等的目標(biāo)。
文檔編號(hào)B82Y5/00GK102766191SQ20121026992
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月31日
發(fā)明者何丹農(nóng), 余震, 李文英, 鐘建, 閆志強(qiáng), 馬夢(mèng)佳, 魏岱旭 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué), 上海納米技術(shù)及應(yīng)用國(guó)家工程研究中心有限公司