雙鏈rna或其修飾物在制備腫瘤抑制劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了雙鏈RNA或其修飾物在制備腫瘤抑制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的雙鏈RNA或其修飾物在制備腫瘤抑制劑中的應(yīng)用，所述雙鏈RNA的一條鏈序列為序列表中SEQ?ID?No.1，所述雙鏈RNA的另一條鏈序列為序列表中SEQ?ID?No.2；所述雙鏈RNA的修飾物是經(jīng)過下述A1)或A2)或A3)修飾得到的雙鏈RNA修飾物：A1)對所述雙鏈RNA的核糖的2′-OH進行修飾；A2)對所述雙鏈RNA的連接核苷酸的磷酸二酯鍵進行修飾；A3)對所述雙鏈RNA的核糖的5′端連上膽固醇的修飾。實驗證明，本申請的2′-OMe-dsRNA21或其修飾物能有效抑制腫瘤和腫瘤細(xì)胞。
【專利說明】雙鏈RNA或其修飾物在制備腫瘤抑制劑中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】中雙鏈RNA或其修飾物在制備腫瘤抑制劑中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] RNA干擾（RNA interference, RNAi)是一種分子生物學(xué)上與祀基因序列同源的短 雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)的序列特異性的特別有效的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象（Fire，1998)，其機 制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼 區(qū)同源的雙鏈RNA時，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達沉默。RNAi是真核細(xì)胞特有的一 種基因沉默機制，在決定細(xì)胞命運、細(xì)胞分化方向及存留等方面起著極為重要的作用。由 于RNAi具有鎖定任何引起疾病或疾病相關(guān)蛋白表達的能力，且RNAi技術(shù)特異性高，作用迅 速，副反應(yīng)小，在有效地沉默靶基因的同時，對細(xì)胞本身的調(diào)控系統(tǒng)沒有影響。目前RNAi已 作為一種高效的序列特異性基因剔除技術(shù)在傳染性疾病和惡性腫瘤基因治療領(lǐng)域發(fā)展極 為迅速。
[0003] 微小核酸（miRNA)是一種內(nèi)源的、在體內(nèi)廣泛表達的包含21?25個核苷酸的內(nèi) 源性非編碼小RNA，是引起RNA干擾現(xiàn)象直接原因的物質(zhì)之一。miRNA由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約 70?90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，在進化上高度保守，通過翻 譯抑制調(diào)控基因表達而不影響轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性。每個miRNA可以有多個調(diào)控（靶）基因， 而幾個miRNA也可以調(diào)節(jié)同一個基因，據(jù)推測，miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因 。miRNA 調(diào)節(jié)機體重要的生理與病理過程，在細(xì)胞分化，生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮巨大 作用，且具有很強的組織特異性，已經(jīng)引起越來越多的研究人員的關(guān)注。
[0004] 周期蛋白依賴性激酶4 (cyclin dependent kinase 4，Q)K4)作為一種重要的周 期蛋白。研究表明腫瘤細(xì)胞惡性增殖主要是由于細(xì)胞周期的失調(diào)所導(dǎo)致，Cyclin D-CDK4/ ⑶K6是調(diào)控細(xì)胞周期由G1向S期的過渡關(guān)鍵因子。⑶K4基因己被證實是一種癌基因，與 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者的預(yù)后密切相關(guān)。在多種腫瘤細(xì)胞如胃癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、 子宮內(nèi)膜癌、肝癌和癌變組織中都發(fā)現(xiàn)伴隨有CDK4的過度表達和過度活化現(xiàn)象，因此CDK4 可做為腫瘤基因治療中的一個潛在祀點。
[0005] 此外G1期是增殖細(xì)胞唯一能接受從外界傳入的增殖或抑制增殖信號的時期，作 用在G1期或G1/S交界期,啟動細(xì)胞周期和促進DNA合成的cyclin D是一個比其它cyclins 更加敏感的指標(biāo)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何抑制腫瘤細(xì)胞和/或抑制腫瘤。所述抑制腫瘤 細(xì)胞可為抑制腫瘤細(xì)胞增殖，所述抑制腫瘤可為抑制腫瘤的發(fā)生和/或抑制腫瘤的生長。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種雙鏈RNA或其修飾物在制備腫瘤抑 制劑或腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用，所述雙鏈RNA，其名稱為dsRNA21，所述dsRNA21的一條鏈 的從5'端至3'端的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 1，所述dsRNA21的另一條鏈的從 3'端至5'端的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 2。
[0008] 其中，SEQ ID No. 1由21個核糖核苷酸組成，SEQ ID No. 2由21個核糖核苷酸組 成，SEQ ID No. 1的第1-19位核糖核苷酸與SEQ ID No. 2的第3-21位核糖核苷酸反向互 補，將二者形成的雙鏈RNA命名為dsRNA21。
[0009] 上述應(yīng)用中，所述修飾物具體可為對所述dsRNA21進行修飾得到的雙鏈RNA修飾 物，其名稱為dsRNA21-mimic。所述雙鏈RNA修飾物中，各種修飾方法均可選用，包括選自核 糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種的組合等。如可對所述dsRNA21進行下 述A1)或A2)或A3)的修飾得到所述雙鏈RNA修飾物：
[0010] A1)對所述dsRNA21的核糖的W -0H進行修飾；
[0011] A2)對所述dsRNA21的連接核苷酸的磷酸二酯鍵進行修飾；
[0012] A3)對所述dsRNA21的核糖的Y端連上膽固醇的修飾。
[0013] 上述應(yīng)用中，所述對所述dsRNA21的連接核苷酸的磷酸二酯鍵進行修飾為將所 述磷酸二酯鍵的氧用硫取代；所述對所述dsRNA21的核糖的2' -0H進行修飾為將所述 2' -0H用甲氧基或氟取代或者對所述2' -0H進行脫氧修飾。
[0014] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述雙鏈RNA修飾物是將所述dsRNA21的SEQ ID No. 2 所示鏈中所有胞苷酸的2' -0H均取代為甲氧基且SEQ ID No. 1所示鏈未進行修飾得到的 修飾物，其名稱為2' -0Me-dsRNA21。
[0015] 上述應(yīng)用中，所述腫瘤細(xì)胞抑制劑可為抑制腫瘤細(xì)胞增殖的產(chǎn)品（如藥物）和/ 或促進腫瘤細(xì)胞凋亡的產(chǎn)品（如藥物或疫苗），所述腫瘤抑制劑可為抑制腫瘤發(fā)生的產(chǎn)品 (如藥物或疫苗）和/或抑制腫瘤生長的產(chǎn)品（如藥物或疫苗）。
[0016] 上述應(yīng)用中，所述腫瘤可為鼻咽癌、腸癌、宮頸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、非小 細(xì)胞肺癌或子宮內(nèi)膜癌。
[0017] 上述應(yīng)用中，所述抑制腫瘤細(xì)胞增殖可為抑制腫瘤細(xì)胞增殖的G1期。
[0018] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與dsRNA21相關(guān)的生物材料在制備腫瘤抑 制劑或腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明所提供的與dsRNA21相關(guān)的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細(xì)胞抑制 劑中的應(yīng)用中，所述生物材料為下述Bl)-B12)中的任一種：
[0020] B1)編碼所述dsRNA21的DNA分子；
[0021] B2)含有B1)所述DNA分子的表達盒；
[0022] B3)含有B1)所述DNA分子的重組載體；
[0023] B4)含有B2)所述表達盒的重組載體；
[0024] B5)含有B1)所述DNA分子的重組微生物；
[0025] B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物；
[0026] B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0027] B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物；
[0028] B9)含有B1)所述DNA分子的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系；
[0029] B10)含有B2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系；
[0030] B11)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系；
[0031] B12)含有M)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系。
[0032] 上述與dsRNA21相關(guān)的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用 中，所述腫瘤可為腸癌、鼻咽癌、宮頸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌或子宮內(nèi) 膜癌。
[0033] 上述與dsRNA21相關(guān)的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用 中，B2)所述的含有編碼dsRNA21的DNA分子的表達盒（dsRNA21表達盒）是指能夠在宿主 細(xì)胞中表達dsRNA21的DNA，該DNA不但可包括啟動dsRNA21轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止 dsRNA21轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。
[0034] 可用現(xiàn)有的表達載體構(gòu)建含有所述dsRNA21表達盒的重組載體。
[0035] 上述與dsRNA21相關(guān)的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用 中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。
[0036] 上述與dsRNA21相關(guān)的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用 中，B5)_B8)所述的微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌。
[0037] 上述與dsRNA21相關(guān)的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用 中，B9)_B12)所述的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系不包括繁殖材料。
[0038] 上述與dsRNA21相關(guān)的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用 中，所述腫瘤抑制劑可為抑制腫瘤發(fā)生的抑制劑和/或抑制腫瘤生長的抑制劑。
[0039] 上述與dsRNA21相關(guān)的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用 中，所述腫瘤細(xì)胞抑制劑為抑制腫瘤細(xì)胞增殖的產(chǎn)品和/或促進腫瘤細(xì)胞凋亡的產(chǎn)品。
[0040] 上述應(yīng)用中，所述抑制腫瘤細(xì)胞增殖可為抑制腫瘤細(xì)胞增殖的G1期。
[0041] 下述Ml)或M2)的用途，也屬于本發(fā)明的保護范圍：
[0042] Ml)所述dsRNA21或所述dsRNA21-mimic在制備抑制腫瘤細(xì)胞周期蛋白D表達試 劑中的應(yīng)用；
[0043] M2)所述dsRNA21或所述dsRNA21-mimic在制備抑制腫瘤細(xì)胞周期蛋白依賴性激 酶4表達試劑中的應(yīng)用。
[0044] 上述用途中，所述腫瘤可為腸癌、鼻咽癌、宮頸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、非小 細(xì)胞肺癌或子宮內(nèi)膜癌。
[0045] 上述用途中，所述細(xì)胞周期蛋白D可為細(xì)胞周期蛋白D3。
[0046] 下述M3)或M4)的用途，也屬于本發(fā)明的保護范圍：
[0047] M3)上述生物材料Bl)-B12)在制備抑制腫瘤細(xì)胞周期蛋白D表達試劑中的應(yīng)用；
[0048] M4)上述生物材料Bl)-B12)在制備抑制腫瘤細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4表達試劑 中的應(yīng)用。
[0049] 上述用途中，所述腫瘤可為腸癌、鼻咽癌、宮頸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、非小 細(xì)胞肺癌或子宮內(nèi)膜癌。
[0050] 上述用途中，所述細(xì)胞周期蛋白D可為細(xì)胞周期蛋白D3。
[0051] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了治療和/或預(yù)防腫瘤的產(chǎn)品（如藥物或疫 苗）。
[0052] 本發(fā)明所提供的治療和/或預(yù)防腫瘤的產(chǎn)品（如藥物或疫苗），其活性成分為所述 dsRNA21或所述dsRNA21-mimic或上述生物材料Bl)-B12)中任一種。
[0053] 上述治療和/或預(yù)防腫瘤的產(chǎn)品（如藥物或疫苗）中，所述治療和/或預(yù)防腫瘤 的產(chǎn)品可為治療和/或預(yù)防腫瘤的藥物，所述藥物的劑型可為粉針劑。
[0054] 上述治療和/或預(yù)防腫瘤的產(chǎn)品（如藥物或疫苗）中，所述腫瘤為腸癌、鼻咽癌、 宮頸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌或子宮內(nèi)膜癌。
[0055] 上述治療和/或預(yù)防腫瘤的產(chǎn)品（如藥物或疫苗）中，所述藥物還可以包含其 它藥學(xué)上可接受的載體。本文所用的"藥學(xué)上可接受的載體"應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明藥物中的雙 鏈RNA分子相容。所述"藥學(xué)上可接受的載體"是指體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑，如聚乙烯亞胺（PEI)， jetPEI (線性聚乙烯亞胺），脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)鐵蛋白，葉酸、納米乳、納米粒等?？勺鳛樗帉W(xué)上可 接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的其他例子是凍干保護劑糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀 粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬 脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如 甘油、甘露糖醇；海藻酸；乳化劑，如Tween ;磷脂，如卵磷脂，大豆磷脂，磷脂酰乙醇胺，磷脂 酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酰絲氨酸，硬脂酰胺；膽固醇；大分子高聚物，如聚乙烯亞胺，殼 聚糖，透明質(zhì)酸；潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防 腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等；生理鹽水、甘油和磷酸鹽緩沖鹽水。
[0056] 上述治療和/或預(yù)防腫瘤的產(chǎn)品（如藥物或疫苗）中，所述粉針劑可以生理鹽水 或者等滲葡萄糖水溶液為溶劑。
[0057] 上述治療和/或預(yù)防腫瘤的產(chǎn)品（如藥物或疫苗）中，所述粉針劑可以甘露醇為 凍干保護劑。
[0058] 上述粉針劑的制備方法，也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0059] 上述粉針劑的制備方法，包括樣品準(zhǔn)備、預(yù)凍、一次干燥（升華干燥）、二次干燥 (解吸干燥）和密封保存五個步驟。
[0060] 實驗結(jié)果顯示，本申請的dsRNA21或其修飾物能顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖：鼻 咽癌細(xì)胞在經(jīng)V -0Me-dsRNA21處理48h時，2' -0Me-dsRNA21抑制了 27.7%的鼻咽癌 細(xì)胞增殖；在經(jīng)W -0Me-dsRNA21處理72h時，2' -0Me-dsRNA21抑制了 33. 7%的鼻咽癌 細(xì)胞增殖；在經(jīng)，-0116-(181?隱21處理9611時，2'-016-(181?隱21抑制了30.7%的鼻咽癌 細(xì)胞增殖；在經(jīng)W -0Me-dsRNA21處理10天時，鼻咽癌細(xì)胞的克隆數(shù)為320個± 13個，經(jīng) 2' -OMe-NC處理的鼻咽癌細(xì)胞的克隆數(shù)為147個±14個。
[0061] 本申請的dsRNA21或其修飾物能抑制細(xì)胞從G1期向S期的過渡：經(jīng) 2' -0Me-dsRNA21處理的S期鼻咽癌細(xì)胞中含有Edu細(xì)胞的百分比為21.94±3. 08%， 經(jīng)2' -〇Me-NC處理的S期鼻咽癌細(xì)胞中含有Edu細(xì)胞的百分比為37. 5±4. 49%，調(diào)控細(xì) 胞周期的關(guān)鍵因子⑶K4基因在經(jīng)V -0Me-dsRNA21處理的鼻咽癌細(xì)胞中的表達為在經(jīng) 2' -〇Me-NC處理的鼻咽癌細(xì)胞中的表達的74. 3%，CCND3基因在經(jīng)W -0Me-dsRNA21處 理的鼻咽癌細(xì)胞中的表達為在經(jīng)2' -OMe-NC處理的鼻咽癌細(xì)胞中的表達的60. 8%。
[0062] 本申請的dsRNA21或其修飾物能抑制腫瘤重量、腫瘤體積的增加：NC組裸鼠腫瘤 的平均重量為0. 043g±0. 015g，dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均重量為0. 023g±0. 0084g ;注 射針劑兩天時，NC組裸鼠腫瘤的平均體積為30. 74mm3, dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均體積為 20. 53mm3 ;注射針劑四天時，NC組裸鼠腫瘤的平均體積為37. 74mm3, dsRNA21組裸鼠腫瘤的 平均體積為30. 41mm3 ;注射針劑六天時，NC組裸鼠腫瘤的平均體積為65. 20mm3, dsRNA21組 裸鼠腫瘤的平均體積為45. 27mm3 ;注射針劑八天時，NC組裸鼠腫瘤的平均體積為75. 21mm3， dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均體積為51. 94mm3 ;注射針劑十天時，NC組裸鼠腫瘤的平均體積 為93. 97mm3, dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均體積為73. 05mm3。
[0063] 實驗表明，本申請的2' -0Me-dsRNA21或其修飾物能夠有效抑制腫瘤和腫瘤細(xì) 胞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0064] 圖1為分別經(jīng)W -0Me_dsRNA21和W -〇Me-NC處理的鼻咽癌細(xì)胞個數(shù)。其中， dsRNA21表示V -0Me-dsRNA21，miR-NC表示V -〇Me-NC，圖A為鼻咽癌細(xì)胞在分別經(jīng) 2 ^ -0Me-dsRNA21和W -〇Me-NC處理96小時細(xì)胞個數(shù)變化情況；圖B為鼻咽癌細(xì)胞在經(jīng) 2' -0Me-dsRNA21和2' -〇Me-NC處理96h內(nèi)細(xì)胞個數(shù)的變化曲線；圖C為鼻咽癌細(xì)胞在 分別經(jīng)W -0Me-dsRNA21和V -〇Me-NC處理72小時的外觀圖；圖D為鼻咽癌細(xì)胞在經(jīng) 2' -0Me-dsRNA21和2' -〇Me-NC處理10天后的細(xì)胞個數(shù)。
[0065] 圖2為經(jīng)W -0Me-dsRNA21和2' -〇Me_NC處理的S期鼻咽癌細(xì)胞中含有Edu的 細(xì)胞。其中，NC表示W(wǎng) -0Me-NC，dsRNA21表示W(wǎng) -0Me-dsRNA21。左圖為共聚焦顯微鏡 下W -0Me-dsRNA21或W -〇Me-NC處理的鼻咽癌細(xì)胞中Edu陽性的細(xì)胞；右圖為統(tǒng)計計 算W -0Me-dsRNA21或W -〇Me-NC處理的鼻咽癌細(xì)胞中含有Edu的細(xì)胞占總細(xì)胞的百分 比。
[0066] 圖3為經(jīng)2' -0Me-dsRNA21和2' -〇Me-NC處理的鼻咽癌細(xì)胞中CCND3和CDK4的 表達情況。其中，圖A為CCND3和⑶K4的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，圖B為CCND3和⑶K4 的實時熒光定量檢測結(jié)果，Cyclin D3表示CCND3，dsRNA21表示W(wǎng) -0Me-dsRNA21，miR-NC 表示 W -〇Me-NC。
[0067] 圖4為分別經(jīng)W -0Me_dsRNA21和W -〇Me-NC處理的裸鼠腫瘤重量、體積及外 觀。其中，圖A為裸鼠的腫瘤體積，圖A中的"D"表示"天"，"MM3"表示"立方毫米";圖B為 第5次注射針劑的兩天后（即實驗的第10天）裸鼠的腫瘤重量；圖C為第5次注射針劑的 兩天后（即實驗的第10天）裸鼠的腫瘤外觀。dsRNA21表示V -0Me-dsRNA21，NC表示 2， -〇Me-NC。

【具體實施方式】
[0068] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0069] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0070] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0071] 下述實施例中的BALB/C裸鼠為廣東省實驗動物中心產(chǎn)品。
[0072] 下述實施例中的鼻咽癌細(xì)胞均為鼻咽癌細(xì)胞系（CNE細(xì)胞系），CNE細(xì)胞系為昆明 細(xì)胞庫產(chǎn)品，保藏編號為KCB 86019YJ。
[0073] 實施例 1、2' -0Me_dsRNA21 的制備
[0074] dsRNA21的一條鏈的從5'端至3'端的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 1，所述 dsRNA21的另一條鏈的從3'端至5'端的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 2。其中，SEQ ID No. 1由21個核糖核苷酸組成，SEQ ID No. 2由21個核糖核苷酸組成，SEQ ID No. 1的 第1-19位核糖核苷酸與SEQ ID No. 2的第3-21位核糖核苷酸反向互補，將二者形成的雙 鏈RNA命名為dsRNA21。本發(fā)明選擇隨機雙鏈RNA作為陰性對照，該隨機雙鏈RNA的名稱為 NC，NC的一條鏈的從5'端至3'端的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 3，NC的一條鏈的從 3'端至5'端的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 4。將dsRNA21的SEQ ID No. 2所示鏈中 所有胞苷酸的2' -OH均取代為甲氧基且SEQ ID No. 1所示鏈未進行修飾得到的dsRNA21 的修飾物命名為2' -0Me-dsRNA21。將NC的SEQ ID No. 4所示鏈中所有胞苷酸的2' -OH 均取代為甲氧基且SEQ ID No. 3所示鏈未進行修飾得到的NC的修飾物命名為W -OMe-NC。
[0075] 2 ^ -0Me_dsRNA21 和 Y -〇Me-NC 委托上海吉瑪（GenePharma)制藥技術(shù)有限 公司合成(ffincott F, DiRenzo A, Shaffer C, GrimmS, Tracz D, Workman C, Sweedler D, Gonzalez C,Scaringe S and Usman N.Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes. Nucleic Acids Res. 1995, 23:2677-84) 〇
[0076] 實施例2』-0Me_dsRNA21對腫瘤細(xì)胞增殖的影響
[0077] 實驗重復(fù)三次，每次實驗的方法如下：
[0078] 將實施例1得到的2 ' -0Me-dsRNA21粉末溶解于無 RNA酶的無菌水中，使其 終濃度為 20pmol/L，得到 2 ' -0Me-dsRNA21 溶液。分別取 5 μ L 該 2 ' -0Me-dsRNA21 溶液和5μ L的lipofectamine 2000(Invitrogen)，將其分別稀釋于245μ L的無血清 培養(yǎng)基（Opti-ΜΕΜ)中，分別得到V -0Me-dsRNA21無血清培養(yǎng)液和lipofectamine 2000無血清培養(yǎng)液，將lipofectamine 2000無血清培養(yǎng)液在室溫下孵育5分鐘，然后 將2 ' -0Me-dsRNA21無血清培養(yǎng)液與lipofectamine 2000無血清培養(yǎng)液混合，得到 2 ^ -0Me-dsRNA21-脂質(zhì)體復(fù)合物培養(yǎng)液500 μ L，并將該W -0Me-dsRNA21-脂質(zhì)體復(fù)合物 培養(yǎng)液于室溫靜置20分鐘。
[0079] 用含10%胎牛血清的DMEM液體培養(yǎng)基（10% FBS-DMEM液體培養(yǎng)基，GIBC0產(chǎn)品） 培養(yǎng)鼻咽癌細(xì)胞（CNE，昆明細(xì)胞庫，保藏編號為KCB 86019YJ)，收集處于對數(shù)生長期的鼻 咽癌細(xì)胞培養(yǎng)液，用上述含10%胎牛血清的DMEM液體培養(yǎng)基調(diào)整處于對數(shù)生長期的鼻咽 癌細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度，使細(xì)胞終濃度為30000個/mL，得到稀釋鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)液，向6 孔板中分別加入100 μ L該稀釋鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)液，使每孔中細(xì)胞含量為3000個，并用上述 含10%胎牛血清的DMEM液體培養(yǎng)基將每孔中培養(yǎng)液的體積補至2mL，得到含有鼻咽癌細(xì)胞 液的6孔板。將該含有鼻咽癌細(xì)胞液的6孔板置于含5% C02的37°C的孵箱中培養(yǎng)12小 時，使細(xì)胞貼壁。
[0080] 分別向上述細(xì)胞貼壁后的6孔板的每孔中加入500μ L上述W -0Me-dsRNA21-脂 質(zhì)體復(fù)合物培養(yǎng)液及1500 μ L無血清DMEM培養(yǎng)基（Opti-MEM)進行轉(zhuǎn)染，得到 2' -0Me-dsRNA21細(xì)胞培養(yǎng)液。將2' -0Me-dsRNA21細(xì)胞培養(yǎng)液置于含5%0)2的37°〇的 孵箱中培養(yǎng)6小時后，將培養(yǎng)基更換為10% FBS-DMEM液體培養(yǎng)基，正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)，在 培養(yǎng)過程中每3天按照上述方法轉(zhuǎn)染一次，培養(yǎng)10天后，得到經(jīng)W -0Me-dsRNA21處理的 鼻咽癌細(xì)胞。
[0081] 按照上述方法，2' -0Me_dsRNA21替換為Y -〇Me-NC，其余步驟不變，得到經(jīng) 2' -〇Me-NC處理的鼻咽癌細(xì)胞。
[0082] 將經(jīng)2' -0Me_dsRNA21處理的鼻咽癌細(xì)胞和經(jīng)2' -〇Me-NC處理的鼻咽癌細(xì)胞分 別用冷甲醇固定，并分別用結(jié)晶紫染色，而后用Gel-Pro計數(shù)器分別對經(jīng)2' -0Me-dsRNA21 處理的鼻咽癌細(xì)胞克隆數(shù)和經(jīng)2 ' -OMe-NC處理的鼻咽癌細(xì)胞克隆數(shù)進行計數(shù)，計算鼻 咽癌細(xì)胞增殖抑制率（鼻咽癌細(xì)胞增殖抑制率=C -OMe-NC處理的鼻咽癌細(xì)胞克隆 數(shù)-2' -0Me-dsRNA21處理的鼻咽癌細(xì)胞克隆數(shù)）/2^ -OMe-NC處理的鼻咽癌細(xì)胞克隆 數(shù)），結(jié)果如圖1所示。
[0083] 結(jié)果顯示，鼻咽癌細(xì)胞在經(jīng)V -0Me-dsRNA21處理48h時，2，-0Me-dsRNA21抑 制了27.7%的鼻咽癌細(xì)胞增殖；在經(jīng)2 /-0116-(181?隱21處理7211時，2/-016-(181?隱21抑 制了33.7%的鼻咽癌細(xì)胞增殖 ；在經(jīng)2^-016-(181?隱21處理9611時，2/-016-(181?隱21 抑制了 30. 7%的鼻咽癌細(xì)胞增殖；在經(jīng)Y -0Me-dsRNA21處理10天時，鼻咽癌細(xì)胞 的克隆數(shù)為147個±14個，經(jīng)Y -〇Me-NC處理的鼻咽癌細(xì)胞的克隆數(shù)為320個±13 個，2 ' -0Me-dsRNA21抑制了 54. 1 %的鼻咽癌細(xì)胞增殖。表明和經(jīng)2 ' -〇Me-NC處理 的鼻咽癌細(xì)胞相比，經(jīng)2' -0Me-dsRNA21處理的鼻咽癌細(xì)胞的克隆數(shù)明顯減少，說明 2' -0Me-dsRNA21能顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖。
[0084] 實施例3、2' -0Me_dsRNA21對細(xì)胞周期的影響
[0085] 實驗重復(fù)三次，每次實驗的方法如下：
[0086] 用含10%胎牛血清的DMEM液體培養(yǎng)基（10% FBS-DMEM液體培養(yǎng)基，GIBC0產(chǎn)品） 培養(yǎng)鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)18小時，得到DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。將DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液在4°C 5000轉(zhuǎn)/ 分鐘下離心，得到鼻咽癌細(xì)胞。用不加青霉素和鏈霉素的含10%胎牛血清的DMEM液體培養(yǎng) 基重懸鼻咽癌細(xì)胞，用移液槍吹打均勻，得到鼻咽癌細(xì)胞FBS-DMEM培養(yǎng)液。用不加青霉素 和鏈霉素的含10%胎牛血清的DMEM液體培養(yǎng)基調(diào)整鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度，得到 細(xì)胞濃度為2,000,000個細(xì)胞/mL的鼻咽癌細(xì)胞細(xì)胞液，將該細(xì)胞液分種于6孔板中，每孔 100 μ L，即每孔中含200,000個鼻咽癌細(xì)胞，得到含有鼻咽癌細(xì)胞液的6孔板。
[0087] 分別取 lipofectamine 2000 (Invitrogen) 5 μ L、實施例 2 中的 2' -〇Me_dsRNA21 溶液10 μ L，分別稀釋于250 μ L無血清培養(yǎng)基（Opti-MEM)中，分別得到2' -0Me-dsRNA21 無血清培養(yǎng)液和lipofectamine 2000無血清培養(yǎng)液，將lipofectamine 2000無血清培養(yǎng) 液在室溫下孵育5分鐘，然后將2' -0Me-dsRNA21無血清培養(yǎng)液與lipofectamine 2000無 血清培養(yǎng)液混合，得到2' -0Me-dsRNA21-脂質(zhì)體復(fù)合物培養(yǎng)液。將2' -0Me-dsRNA21-脂 質(zhì)體復(fù)合物培養(yǎng)液于室溫靜置20分鐘。將上述W -0Me-dsRNA21-脂質(zhì)體復(fù)合物培養(yǎng)液 與無血清的DMEM培養(yǎng)液按照體積比為1:3的比例混合后取2mL，加到上述鼻咽癌細(xì)胞液 的6孔板中，得到V -0Me-dsRNA21細(xì)胞培養(yǎng)液。將V -0Me-dsRNA21細(xì)胞培養(yǎng)液在細(xì) 胞培養(yǎng)板上在5% C0237°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時，得到2' -0Me-dsRNA21轉(zhuǎn)染細(xì)胞液，將 2' -0Me-dsRNA21轉(zhuǎn)染細(xì)胞液在4°C 5000轉(zhuǎn)/分鐘下離心，得到W -0Me-dsRNA21轉(zhuǎn)染后 的細(xì)胞，將2' -0Me-dsRNA21轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸鼻咽癌 細(xì)胞，用移液槍吹打均勻，得到W -0Me-dsRNA21轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)液，將W -0Me-dsRNA21 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)液于含5% C02的37°C的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時，得到W -0Me-dsRNA21 鼻咽癌細(xì)胞FBS-DMEM培養(yǎng)液。
[0088] 按照上述方法，將W -0Me_dsRNA21替換為W -〇Me-NC，其他操作步驟不變，得到 2 ^ -〇Me-NC鼻咽癌細(xì)胞FBS-DMEM培養(yǎng)液。
[0089] 48小時后，分別用羥基脲同步處理V -0Me-dsRNA21鼻咽癌細(xì)胞FBS-DMEM培 養(yǎng)液中的鼻咽癌細(xì)胞和2' -OMe-NC鼻咽癌細(xì)胞FBS-DMEM培養(yǎng)液中的鼻咽癌細(xì)胞，使鼻 咽癌細(xì)胞處于G1期，其他操作均按照Click-iT EdU Alexa Fluor 488熒光試劑盒（Life Technologies，C10337)說明書進行。
[0090] 激光共聚焦顯微鏡下觀察2' -0Me-dSRNA21鼻咽癌細(xì)胞FBS-DMEM培養(yǎng)液中的鼻 咽癌細(xì)胞和2' -OMe-NC鼻咽癌細(xì)胞FBS-DMEM培養(yǎng)液中的鼻咽癌細(xì)胞，并用成像軟件定量 計算，結(jié)果如圖2所示。
[0091] 結(jié)果顯示，經(jīng)V -0Me_dsRNA21處理的S期鼻咽癌細(xì)胞中含有Edu細(xì)胞的百分 比為21.94±3. 08%，經(jīng)2' -〇Me-NC處理的S期鼻咽癌細(xì)胞中含有Edu細(xì)胞的百分比為 37. 5±4. 49%，表明與轉(zhuǎn)染2' -〇Me-NC的鼻咽癌細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染2' -0Me-dsRNA21的鼻咽 癌細(xì)胞S期含有Edu的細(xì)胞顯著減少。
[0092] 實施例4、2< -0Me_dsRNA21對靶基因表達的抑制作用
[0093] 取實施例3中的V -0Me_dsRNA21鼻咽癌細(xì)胞FBS-DMEM培養(yǎng)液和W -〇Me-NC 鼻咽癌細(xì)胞FBS-DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)42小時后，分別收集2' -0Me-dsRNA21轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì) 胞和W -〇Me-NC轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞，分別進行周期蛋白依賴性激酶4(cyclin dependent kinase 4, CDK4)基因和細(xì)胞周期蛋白D3(cyclin D3, CCND3)基因的表達檢測。
[0094] 實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)實驗的步驟如下：
[0095] 按照TRIzol提取RNA的方法提取2' -0Me-dsRNA21轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞的總RNA， 得到含有 DNA 的 2' -0Me-dsRNA21 總 RNA。用 DNase I(RNase-free) (TaKaRa)于 37°C 下消化 處理含有DNA的W -0Me-dsRNA21總RNA 30分鐘，降解含有DNA的W -0Me-dsRNA21總RNA 中的DNA，得到DNA降解后的含有DNA的2' -0Me-dsRNA21總RNA。按照DNase I產(chǎn)品說明重 新提取DNA降解后的含有DNA的W -0Me-dsRNA21總RNA中的RNA，得到W -0Me-dsRNA21 總 RNA。將 1 μ g 的 2，-0Me-dsRNA21 總 RNA 與 0· 5 μ g 的 50 μ M Oligo dT (16-18) (Takara 公司產(chǎn)品）混合，加熱5分鐘，迅速冷卻至0°C得到。按TaKaRa公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系 分別加入緩沖液，并于42°C孵育1小時，得到W -0Me-dsRNA21 cDNA。
[0096] 按照上述方法，將W -0Me_dsRNA21轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞替換為W -〇Me-NC轉(zhuǎn)染 的鼻咽癌細(xì)胞，其他步驟不變，得到W -〇Me-NC cDNA。
[0097] 以2 ' -0Me-dsRNA21cDNA為PCR反應(yīng)的模板對靶基因 CCND3 (CCND3的引物 為：CCND3F:TACCCGCCATCCATGATCG，CCND3R:AGGCAGTCCACTTCAGTGC)和 CDK4(CDK4 的 引物為：⑶K4F :CCTACCTTTATATTTGGGGTCCT，CDK4R :GGCCCTGTAATTTAACCAGT)進行半定 量 PCR 檢測，內(nèi)參為 GAPDH(GAPDH 的引物為：GAPDHF :GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，GAPDHR : GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG)，PCR反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3 中A所示。結(jié)果表明，經(jīng)W -0Me-dsRNA21和經(jīng)W -〇Me-NC處理的鼻咽癌細(xì)胞中的⑶K4 基因和CCND3基因均有表達，經(jīng)W -0Me-dsRNA21處理后的鼻咽癌細(xì)胞中的⑶K4基因和 CCND3基因的表達均有所降低。與轉(zhuǎn)染小核酸的陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染W(wǎng) -0Me-dsRNA21 明顯抑制腫瘤細(xì)胞的CCND3和⑶K4的表達。
[0098] 分別以上述 W -0Me-dsRNA21cDNA 和上述 W -〇Me_NC cDNA 為模板，以 GAPDH 為 內(nèi)參（GAPDH 的引物為：GAPDHF :GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，GAPDHR :
[0099] GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG)，按照 Syb 試劑盒使用說明進行 CDK4 基因和 CCND3 基因表達的實時熒光定量檢測，CDK4基因的引物為：CDK4F:CCTACCTTTATATTTGGGGTCCT， CDK4R :GGCCCTGTAAITTAACCAGT，CCND3 基因的引物對為：CCND3F :
[0100] TACCCGCCATCCATGATCG，CCND3R :AGGCAGTCCACTTCAGTGC，結(jié)果如圖 3 中 B 所示。結(jié)果 顯示，經(jīng)2' -0Me-dsRNA21處理的鼻咽癌細(xì)胞中⑶K4基因的表達量為經(jīng)2' -〇Me-NC處理 的鼻咽癌細(xì)胞中⑶K4基因的表達量的74. 3%，經(jīng)W -0Me-dsRNA21處理的鼻咽癌細(xì)胞中 CCND3基因的表達量為經(jīng)W -〇Me-NC處理的鼻咽癌細(xì)胞中CCND3基因的表達量的60. 8 %， 表明經(jīng)W -0Me-dsRNA21處理后的鼻咽癌細(xì)胞中的⑶K4基因和CCND3基因的表達量均有 所降低。
[0101] 實施例5、2' -0Me-dsRNA21凍干粉針劑的制備
[0102] 1、配液
[0103] 將實施例1中的2 ' -0Me-dsRNA21用無 RNA酶的注射用水溶解，得到無 RNA酶 的 2 ' -0Me-dsRNA21 溶液，該無 RNA 酶的 2 ' -0Me-dsRNA21 溶液中 2 ' -0Me-dsRNA21 的 含量為2. 29 μ g/ μ L ;將凍干保護劑甘露醇4. 4g用無 RNA酶的注射用水溶解，并用氫氧化 鈉溶液和鹽酸溶液調(diào)節(jié)其pH為6-7,補加注射用水至100mL，得到凍干保護劑溶液；按照 lmL無 RNA酶的2 ' -0Me-dsRNA21溶液與50mL凍干保護劑溶液的體積比進行混合，得到 2 ^ -0Me-dsRNA21保護劑混合液。
[0104] 2、凍干
[0105] 預(yù)凍：將上述2' -0Me-dsRNA21保護劑混合液分裝好于西林瓶中，于-80°C冰箱中 預(yù)冷凍過夜。冷凍干燥：將預(yù)冷凍的2' -0Me-dsRNA21保護劑混合液抽真空，然后在避光 條件下冷凍干燥，得到W -0Me-dsRNA21凍干粉針劑。
[0106] 按照上述方法，將W -0Me_dsRNA21替換為實施例1中的W -〇Me-NC，其他均不 變，得到W -〇Me-NC凍干粉針劑。
[0107] 將W -0Me_dsRNA21凍干粉針劑與W -〇Me-NC凍干粉針劑密封，低溫保存。
[0108] 實施例6、2< -0Me_dsRNA21對腫瘤生長的抑制作用
[0109] 取4周齡的雄性BALB/C裸鼠10只，分別在每只裸鼠的背側(cè)翼部皮下注射0. lmL 鼻咽癌細(xì)胞懸液（鼻咽癌細(xì)胞懸液中鼻咽癌細(xì)胞含量為3 X 105個細(xì)胞/mL)，10天后成瘤， 共得到10只背側(cè)翼部皮下形成移植瘤的BALB/C裸鼠。將上述10只背側(cè)翼部皮下形成移 植瘤的BALB/C裸鼠隨機分為兩組，每組5只，分別為NC組裸鼠和dsRNA21組裸鼠。
[0110] 用無 RNA酶的無菌水11. 3μ L溶解20μ g實施例5中的2' -0Me-dsRNA21凍干 粉針劑，并加入轉(zhuǎn)染試劑jetPEI (Polyplus公司產(chǎn)品）L 2 μ L，得到V -0Me-dsRNA21和 jetPEI的混合溶液，向2' -0Me-dsRNA21和jetPEI的混合溶液中加入是該溶液等體積的 10%葡萄糖溶液，混合均勻，得到總體積為25μ 1的2' -0Me-dsRNA21針劑。按照上述方 法，將實施例5中的2' -0Me-dsRNA21凍干粉針劑替換為實施例5中的2' -OMe-NC凍干 粉針劑，其他均不變，得到總體積為25 μ 1的W -〇Me-NC針劑。
[0111] 向NC組裸鼠中每只裸鼠的移植瘤內(nèi)注射上述2' -OMe-NC針劑25μ 1，注射 當(dāng)天記為實驗的第0天，每只裸鼠每隔1天注射一次上述含有20yg2' -OMe-NC的 2' -OMe-NC針劑25 μ 1，共注射5次；向dsRNA21組裸鼠中每只裸鼠的移植瘤內(nèi)注射上述 2' -0Me-dsRNA21針劑25μ 1，注射當(dāng)天記為實驗的第0天，每只裸鼠每隔1天注射一次上 述含有20 μ g2' -0Me-dsRNA21的W -0Me-dsRNA21針劑25 μ 1，共注射5次。每次注射針 劑前（即實驗的第0天、第2天、第4天、第6天、第8天）和第5次注射針劑的兩天后（即 實驗的第10天）用游標(biāo)卡尺測量分別測量NC組裸鼠和dsRNA21組裸鼠的腫瘤最長徑（L) 和橫徑（S)，并計算腫瘤的近似體積。計算公式為：V(mm3) =0.5XLXS2。在每組的裸鼠第 5次注射針劑的兩天后（即實驗的第10天），取出每組中每只裸鼠的腫瘤，并測量腫瘤體 積、稱量腫瘤重量、拍照記錄，結(jié)果如圖4所示。
[0112] 實驗結(jié)果顯示，NC組裸鼠腫瘤的平均重量為0. 043g±0. 015g，dsRNA21組裸鼠 腫瘤的平均重量為〇. 〇23g±0. 0084g。注射針劑兩天時，NC組裸鼠腫瘤的平均體積為 30. 74mm3, dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均體積為20. 53mm3 ;注射針劑四天時，NC組裸鼠腫瘤的 平均體積為37. 74mm3, dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均體積為30. 41mm3 ;注射針劑六天時，NC組 裸鼠腫瘤的平均體積為65. 20mm3, dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均體積為45. 27mm3 ;注射針劑八 天時，NC組裸鼠腫瘤的平均體積為75. 21mm3, dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均體積為51. 94mm3 ; 注射針劑十天時，NC組裸鼠腫瘤的平均體積為93. 97mm3, dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均體積 為73. 05mm3。結(jié)果表明，與NC組裸鼠相比，dsRNA21組裸鼠腫瘤重量、腫瘤體積的增加明顯 小，2' -0Me-dsRNA21針劑明顯抑制了裸鼠腫瘤的生長。
【權(quán)利要求】
1. 雙鏈RNA或其修飾物在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用，所述雙鏈RNA 的一條鏈序列為序列表中SEQ ID No. 1，所述雙鏈RNA的另一條鏈序列為序列表中SEQ ID No. 2。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述雙鏈RNA的修飾物是經(jīng)過下述A1)或 A2)或A3)修飾得到的雙鏈RNA修飾物： A1)對所述雙鏈RNA的核糖的2' -0H進行修飾； A2)對所述雙鏈RNA的連接核苷酸的磷酸二酯鍵進行修飾； A3)對所述雙鏈RNA的核糖的5'端連上膽固醇的修飾。
3. 與權(quán)利要求1或2中所述雙鏈RNA相關(guān)的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細(xì)胞抑 制劑中的應(yīng)用，所述生物材料為下述Bl)-B12)中的任一種： B1)編碼權(quán)利要求1或2中所述雙鏈RNA的DNA分子； B2)含有B1)所述DNA分子的表達盒； B3)含有B1)所述DNA分子的重組載體； B4)含有B2)所述表達盒的重組載體； B5)含有B1)所述DNA分子的重組微生物； B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物； B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物； B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物； B9)含有B1)所述DNA分子的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系； B10)含有B2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系； B11)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系； B12)含有M)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系； B13)含有B1)所述DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述腫瘤抑制劑為抑制腫瘤發(fā) 生的抑制劑和/或抑制腫瘤生長的抑制劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述腫瘤細(xì)胞抑制劑為抑制腫 瘤細(xì)胞增殖的產(chǎn)品和/或促進腫瘤細(xì)胞凋亡的產(chǎn)品。
6. 下述Ml)或M2)的用途： Ml)權(quán)利要求1或2中所述的雙鏈RNA或所述雙鏈RNA的修飾物在制備抑制腫瘤細(xì)胞 周期蛋白D表達試劑中的應(yīng)用； M2)權(quán)利要求1或2中所述的雙鏈RNA或所述雙鏈RNA的修飾物在制備抑制腫瘤細(xì)胞 周期蛋白依賴性激酶4表達試劑中的應(yīng)用。
7. 下述M3)或M4)的用途： M3)權(quán)利要求3中所述的生物材料在制備抑制腫瘤細(xì)胞周期蛋白D表達試劑中的應(yīng) 用； M4)權(quán)利要求3中所述的生物材料在制備抑制腫瘤細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4表達試 劑中的應(yīng)用。
8. 治療和/或預(yù)防腫瘤的產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求1或2中所述的雙鏈RNA或所 述雙鏈RNA的修飾物。
9. 治療和/或預(yù)防腫瘤的產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求3中所述的生物材料。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述治療和/或預(yù)防腫瘤的產(chǎn)品為 治療和/或預(yù)防腫瘤的藥物，所述藥物的劑型為粉針劑。
【文檔編號】A61K39/00GK104147616SQ201410383877
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】王糾, 張雅鷗, 吳江斌, 何杰, 許乃寒, 謝偉東 申請人:清華大學(xué)深圳研究生院