專利名稱：經(jīng)修飾的瀉根素1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及尤其是用于對人施用的、特別是用于治療的多肽。所述的多肽是經(jīng)修飾的多肽，其中所述的修飾使得上述多肽在施用于人體時引起免疫應(yīng)答的傾向減弱。本發(fā)明特別涉及對瀉根素1(bryodin 1)的修飾，該修飾使得體內(nèi)使用時這些瀉根素1蛋白基本上無免疫原性，或比任一未經(jīng)修飾的相應(yīng)蛋白的免疫原性低。
背景技術(shù)：
有許多例子表明治療蛋白的效率受限于針對所述治療蛋白的干擾性免疫反應(yīng)。已有若干種小鼠單克隆抗體表現(xiàn)出治療多種人類疾病的前景，但在某些情況下由于誘導(dǎo)出相當(dāng)程度的人抗鼠抗體(HAMA)應(yīng)答而未能成功應(yīng)用[Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.1351530-1535]。對于單克隆抗體，已開發(fā)了多種技術(shù)以試圖減弱HAMA應(yīng)答[WO 89/09622；EP0239400；EP 0438310；WO 91/06667]。這些重組DNA方法通常是減少最終的抗體構(gòu)建體中小鼠的遺傳信息，同時增加最終構(gòu)建體中人的遺傳信息。盡管如此，在許多情況下，所得的“人源化”抗體仍然引起患者的免疫應(yīng)答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 681417-1420]。
抗體不是唯一一類作為治療劑施用的可引起免疫應(yīng)答的多肽分子。即使是人源的并在人與人之間具有相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)仍可在人體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。明顯的實(shí)例包括粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的治療性應(yīng)用(Wadhwa，M.等人(1999)臨床癌研究(Clin.Cancer Res.)51353-1361)和干擾素α2的治療性應(yīng)用(Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein，R.等人(1988)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New Engl.J.Med.)3181409-1413)。
誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的主要因素是在蛋白中存在可經(jīng)由MHC II類分子的呈遞作用激活T-細(xì)胞活性的肽(即所謂的T-細(xì)胞表位)。此類T-細(xì)胞表位通常定義為任何能夠與MHC II類分子結(jié)合的氨基酸殘基序列。隱含地，″T-細(xì)胞表位″是指當(dāng)其與MHC分子結(jié)合時可被T-細(xì)胞受體(TCR)識別的表位，并且至少原則上，這種表位可以通過與TCR相互作用而激活這些T-細(xì)胞以促進(jìn)T-細(xì)胞應(yīng)答。但是，通常都知道，可以將某些被發(fā)現(xiàn)可以結(jié)合MHC II類分子的肽保留在蛋白質(zhì)序列中，因?yàn)榇祟愲脑谧罱K蛋白質(zhì)所施用至的生物體內(nèi)被識別為“自己”。
已知這些T-細(xì)胞表位肽中的某些可在肽、多肽或蛋白的細(xì)胞內(nèi)降解過程中釋放出來，隨后由主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子呈遞以引發(fā)T-細(xì)胞激活作用。對于MHC II類分子呈遞的肽，然后這種T-細(xì)胞激活作用可例如通過直接刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體而引起抗體反應(yīng)。
MHC II類分子為一組在T輔助細(xì)胞的選擇和活化中起中心作用的高度多態(tài)性蛋白質(zhì)。人類白細(xì)胞抗原群DR(HLA-DR)為該組蛋白質(zhì)的主要同種型，也是本發(fā)明的主要集中點(diǎn)。但是，同種型HLA-DQ和HLA-DP行使相類似的作用，因此本發(fā)明同樣適用于它們。MHC II類DR分子由α和β鏈組成，它們的C-末端插入并穿過細(xì)胞膜。雖然結(jié)合溝可容納最多11個氨基酸，但每一異源-二聚體具有一個能結(jié)合長度在9至20個氨基酸之間的肽的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域由α鏈的1至85位氨基酸和β鏈的1至94位氨基酸組成。最近證實(shí)DQ分子具有同源結(jié)構(gòu)，預(yù)期DP家族的蛋白質(zhì)亦非常相似。人類已知存在DR同種型的約70種不同的同種異型，對于DQ已知存在30種不同的同種異型且對于DP已知存在47種不同的同種異型。每一個體具有二至四個DR等位基因，兩個DQ和兩個DP等位基因。已解析了許多DR分子的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)揭示了一個具有一些可結(jié)合肽的疏水殘基(口袋殘基)的疏水口袋的敞口肽結(jié)合溝[Brown等人，自然(Nature)(1993)36433；Stern等人(1994)自然(Nature)368215]。確定II類分子的不同同種異型的多態(tài)性促成了肽結(jié)合溝內(nèi)用于結(jié)合肽的不同表面的大量多樣性，并在群體水平上確保了在識別外源蛋白質(zhì)并引起對病原生物體的免疫反應(yīng)的能力方面有最大的靈活性。
在配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)有相當(dāng)多的多態(tài)性，其中在不同地理人群和種族群體中具有不同的″家族″。該多態(tài)性影響肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性，因此DR分子的不同″家族″將對具有不同序列特性的肽存在特異性，雖然可能存在一些重疊。該特異性決定了Th-細(xì)胞表位的識別(II類T細(xì)胞反應(yīng))，其最終負(fù)責(zé)驅(qū)動對B細(xì)胞表位的抗體反應(yīng)，其中所述B細(xì)胞表位存在于Th-細(xì)胞表位所來自的同一蛋白質(zhì)上。這樣，個體對蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)很大程度上受T細(xì)胞表位識別的影響，其隨個體的HLA-DR同種異型的肽結(jié)合特異性而改變。因此，為了在世界人群中鑒定蛋白質(zhì)或肽中的T細(xì)胞表位，就可能希望考慮到盡可能多樣的HLA-DR同種異型集合的結(jié)合特性，由此覆蓋盡可能高的世界人口百分率。
針對治療性蛋白的免疫反應(yīng)通過MHC II類肽呈遞途徑進(jìn)行。其間外來蛋白經(jīng)吞噬和加工后與DR、DQ或DP型MHC II類分子結(jié)合以進(jìn)行呈遞。MHC II類分子由專門抗原呈遞細(xì)胞(APC)如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等表達(dá)。通過MHC II類肽復(fù)合體與T細(xì)胞表面的關(guān)聯(lián)性T-細(xì)胞受體的相互作用，及與某些其他共同受體，如CD4分子的交聯(lián)結(jié)合可誘導(dǎo)T-細(xì)胞進(jìn)入激活狀態(tài)。上述激活作用可導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放，進(jìn)一步激活其他淋巴細(xì)胞如B細(xì)胞產(chǎn)生抗體或激活T殺傷細(xì)胞形成完整的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
肽與給定的MHC II類分子結(jié)合以備在APC表面呈遞的能力依賴于多種因素，最主要的是肽的一級結(jié)構(gòu)。這影響其蛋白酶剪切傾向及其在MHC II類分子的肽結(jié)合隙中的結(jié)合親和性。在APC表面的MHC II類/肽復(fù)合體向能識別決定簇的特定T-細(xì)胞受體(TCR)呈遞一個結(jié)合面，其中所述決定簇由肽和MHC II類分子的暴露殘基共同提供。
本領(lǐng)域中有鑒定能結(jié)合MHC II類分子的合成肽的方法(例如WO98/52976和WO00/34317)。這種肽不是在所有情況下都行使T細(xì)胞表位的功能，特別是在體內(nèi)會受加工途徑和其他現(xiàn)象的影響。T-細(xì)胞表位鑒定是表位去除的第一步。鑒定及從蛋白中去除潛在T-細(xì)胞表位先前已有公開。本領(lǐng)域中已有檢測T-細(xì)胞表位的方法，通常是通過計算機(jī)手段在經(jīng)試驗(yàn)確定的T-細(xì)胞表位中掃描公認(rèn)的序列基序，或利用計算機(jī)技術(shù)預(yù)測MHC II類結(jié)合肽，特別是DR-結(jié)合肽。
WO98/52976和WO00/34317中公開了鑒定具有與人MHC II類DR同種異型亞群結(jié)合的潛在能力的多肽序列的計算機(jī)穿線方法(computational threading approaches)。這些教導(dǎo)中，通過在人源或非人源治療性抗體或非抗體蛋白一級序列中進(jìn)行明智的氨基酸替換以去除預(yù)測的T-細(xì)胞表位。
本領(lǐng)域中還使用了其它技術(shù)，這些技術(shù)利用重組MHC分子與合成肽組合形成的可與來自人或?qū)嶒?yàn)動物受試者外周血樣本的T細(xì)胞克隆結(jié)合的可溶性復(fù)合體來實(shí)施[Kern，F(xiàn).等人(1998)自然醫(yī)藥(Nature Medicine)4975-978；Kwok，W.W.等人(2001)免疫學(xué)趨勢(TRENDS in Immunology)22583-588]。這些和其它方案同樣可用于表位鑒定策略，其中所述其它方案包括例如可使用完整蛋白質(zhì)或合成肽或目標(biāo)蛋白質(zhì)的變體分子來篩選結(jié)合或刺激T細(xì)胞的能力改變的分子。
如上所述及作為其結(jié)果，可能希望在給定的原則上具有治療價值但最初具有免疫原性的多肽、蛋白質(zhì)或免疫球蛋白中確定并去除或至少減少T細(xì)胞表位。
這些有治療價值的分子之一是瀉根素1。本發(fā)明提供了其中去除了一個或多個T細(xì)胞表位的瀉根素1的經(jīng)修飾形式。瀉根素1的蛋白質(zhì)序列如Gawlak等所給出的[Gawlak，S.等(1997)Biochemistry 363095-3103]，以單字母描述如下DVSFRLSGATTTSYGVFIKNLREALPYERKVYNIPLLRSSISGSGRYTLLHLTNYADETISVAVDVTNVYIMGYLAGDVSYFFNEASATEAAKFVFKDAKKKVTLPYSGNYERLQTAAGKIRENIPLGLPALDSAITTLYYYTASSAASALLVLIQSTAESARYKFIEQQIGKRVDKTFLPSLATISLENNWSALSKQIQIASTNNGQFESPVVLIDGNNQRVSITNASARVVTSNIALLLNRNNIAAIGEDISMTLIGFEHGLYGI
瀉根素1蛋白為具有267個氨基酸的單鏈多肽，分子量約為29,000Da。瀉根素1為1型核糖體失活蛋白(RIP)，最初分離自植物瀉根(Bryoniadionica)的根[US，5541110]。人們對該RIP和其他RIPs有很大的興趣，因?yàn)樗鼈儗罴?xì)胞有毒性。尤其是與細(xì)胞特異的靶結(jié)構(gòu)域(如抗體)融合的重組形式在許多治療領(lǐng)域具有潛在的價值，其中選擇性殺死特定細(xì)胞群是所希望的結(jié)果。
本發(fā)明的一個特別的目的是提供經(jīng)修飾的瀉根素1蛋白，其中免疫特性通過減少潛在的T細(xì)胞表位數(shù)目而改變。
其他人已提供了瀉根素分子且特別是提供了重組瀉根素1[US，5541110；US，5932447]，但是這些教導(dǎo)既沒有認(rèn)識到T細(xì)胞表位對該蛋白免疫原性的重要性，也沒有意識到本發(fā)明的方案以特異性或受控制的方式直接影響所述特性。相反，2000年6月15日公開的PCT專利申請WO00/34317揭示了包括在位置5，6，18，27，111，164，216，222，237和249處替代的經(jīng)修飾瀉根素1分子。替代的選擇基于硅片上(in Silico)的基序匹配工具，并且沒有寫明在生物學(xué)試驗(yàn)中檢測到的生物學(xué)上最相關(guān)的MHC II類表位，而生物學(xué)上最相關(guān)的MHC II類表位首次于此處公開。而且當(dāng)本發(fā)明公開了認(rèn)為在主題分子中是生物學(xué)上相關(guān)的表位序列時，本發(fā)明人也已認(rèn)識到在名為α-天花粉蛋白、α-苦瓜子蛋白(momorcharin)和β-苦瓜子蛋白的相關(guān)蛋白質(zhì)中通過結(jié)構(gòu)同源性而顯示的很多相同序列也是這些蛋白質(zhì)中的相關(guān)表位。
仍繼續(xù)需要具有增強(qiáng)特性的瀉根素1類似物。所需的增強(qiáng)包括所述治療劑的表達(dá)和純化的備選方案和形式，以及特別是對該蛋白質(zhì)生物特性的改善。尤其需要的是當(dāng)施用于人受試者時具增強(qiáng)的體內(nèi)特征。鑒于此，極為希望提供在人受試者體內(nèi)具有降低的或無誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力的瀉根素1。
發(fā)明概述和描述本發(fā)明提供了修飾形式的瀉根素1，其中，通過減少或去除大量潛在的T-細(xì)胞表位的方式對其免疫學(xué)特性進(jìn)行修飾。
本發(fā)明公開了在瀉根素1一級序列內(nèi)鑒定到的由于具有與MHC II類分子結(jié)合的可能性而是潛在T-細(xì)胞表位的序列。該公開尤其涉及本文上面所給的含有267個氨基酸殘基的瀉根素1蛋白序列，其包括N-端前肽。
本發(fā)明公開了在人中具免疫原性的瀉根素1一級序列的主要區(qū)域，因此，本發(fā)明提供了對這些序列進(jìn)行修飾以消除或者降低這些位點(diǎn)的免疫原性效力所需的關(guān)鍵信息。
在一個實(shí)施方案中，含有所述免疫原性區(qū)的合成肽可以在藥物組合物中提供以促進(jìn)對整個分子的耐受原應(yīng)答。
在另一個實(shí)施方案中，本文公開的在表位區(qū)內(nèi)經(jīng)修飾的瀉根素1分子可以用于藥物組合物。
總之，本發(fā)明涉及下述內(nèi)容●在幼稚T細(xì)胞試驗(yàn)中使用一組合成肽來繪制瀉根素1的免疫原性區(qū)；●瀉根素1衍生肽序列，在幼稚T細(xì)胞試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其引起的刺激指數(shù)大于約2；●一種這樣的分子，其包含瀉根素1氨基酸序列的經(jīng)修飾形式并且在T細(xì)胞增殖試驗(yàn)中使用來自對瀉根素1起反應(yīng)的供體的細(xì)胞時該分子引起的刺激指數(shù)值小于野生型瀉根素1氨基酸序列的刺激指數(shù)值；●一種經(jīng)修飾的分子，其具有瀉根素1的生物學(xué)活性，且當(dāng)其在體內(nèi)應(yīng)用時基本上無免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物學(xué)活性但未經(jīng)修飾的分子；●如上所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過從原始的未經(jīng)修飾的分子中去除一個或多個T-細(xì)胞表位而實(shí)現(xiàn)的；●如上所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過減少能與來自所述分子的肽相結(jié)合的MHC同種異型的數(shù)量來實(shí)現(xiàn)的；●如上所述的分子，其中，所述原本存在的T-細(xì)胞表位是MHC II類配體或通過呈遞在II類分子上后有刺激或結(jié)合T-細(xì)胞的能力的肽序列；●如上所述的分子，其中該肽序列選自如表1中所示的肽序列；●如上所述的分子，其中在任何原本存在的T細(xì)胞表位中1-9個氨基酸殘基發(fā)生了改變，優(yōu)選地1個氨基酸殘基發(fā)生了改變；●如上所述的分子，其中，氨基酸殘基的改變?yōu)樵谔囟ㄎ稽c(diǎn)處用另外的氨基酸殘基替代原本存在的氨基酸殘基、向原本存在的氨基酸殘基添加另外的氨基酸殘基或?qū)⒃敬嬖诘陌被釟埢笔В弧袢缟纤龅姆肿?，其中，根?jù)需要，通常額外地進(jìn)一步進(jìn)行特定氨基酸的替換、添加或刪除以恢復(fù)所述分子的生物學(xué)活性；●如上所述的肽分子，其與

圖1的任一肽序列具有大于90％的氨基酸同一性；●如上所述的肽分子，其與圖1的任一肽序列具有大于80％的氨基酸同一性；●如上所述的肽序列，其可結(jié)合MHC II類；●如上所述的瀉根素1分子，其中在圖1中指定的任一氨基酸對應(yīng)的位置處進(jìn)行一個或多個氨基酸替代；●如上所述的分子，其中改變是在來自任一或所有下述序列(a)，(b)，(c)，(d)或(e)的連續(xù)殘基串的一個或多個殘基處進(jìn)行，其中所述序列來自瀉根素1野生型的單字母代碼序列(a)＝RYTLLHLTNYADETISVAVDV(R1)，(b)＝ATEAAKFVFKDAKKK(R2)，(c)＝ERLQTAAGKIRENIPLGLPALDSA(R3)，(d)＝ITTLYYYTASSAASALLVLIQSTAESA(R4)，(e)＝ATISLENNWSALSKQIQIAST(R5)，●肽分子，其包含來自上述(a)，(b)，(c)，(d)或(e)任一序列中的13-15個連續(xù)殘基；●肽分子，其包含來自上述(a)，(b)，(c)，(d)或(e)任一序列中的至少9個連續(xù)殘基；●上述肽分子，其與來自上述(a)，(b)，(c)，(d)或(e)的任一肽序列具有的氨基酸同一性大于90％；●上述肽分子，其與來自上述(a)，(b)，(c)，(d)或(e)的任一肽序列具有的氨基酸同一性大于80％；●如上所述的肽序列，其可結(jié)合MHC II類；●如上所述的瀉根素1分子，其中在任一上述序列(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中任一特定的氨基酸對應(yīng)位置處進(jìn)行一個或多個氨基酸替換●如上所述的瀉根素1分子，其中在對應(yīng)于上述序列(a)和或(e)中任一特定的氨基酸位置處進(jìn)行一個或多個氨基酸替換●如上所述的瀉根素1分子，其中在對應(yīng)于上述序列(a)和或(e)中任一特定的氨基酸位置處進(jìn)行一個或多個氨基酸替換，并且在上述序列(c)和或(d)中進(jìn)行額外的替換●由上述(a)，(b)，(c)，(d)或(e)任一序列中的至少9個連續(xù)的氨基酸殘基組成的肽序列，以及其用于制備體內(nèi)使用時基本上無免疫原性或免疫原性低于任一未經(jīng)修飾分子并具有1型RIP生物學(xué)活性的瀉根素1、α-天花粉蛋白、α-苦瓜子蛋白和β-苦瓜子蛋白的用途；●藥物組合物，其包含具有結(jié)合MHC II類活性的上面的肽或修飾肽的任何一種；●DNA序列或分子，其編碼如上或如下所定義的任何一種所述特異修飾的分子；●藥物組合物，其包含具有瀉根素1生物學(xué)活性的經(jīng)修飾分子；●上述和/或權(quán)利要求中定義的藥物組合物，其任選地還包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑；●用于制備在權(quán)利要求的任一項(xiàng)中所定義的具有瀉根素1生物學(xué)活性的經(jīng)修飾分子的方法，所述方法包括以下步驟(i)確定所述多肽或其中一部分的氨基酸序列；(ii)通過任意方法，包括利用體外或硅片上(insilico)的技術(shù)或生物學(xué)試驗(yàn)確定所述肽與MHC分子的結(jié)合，由此鑒定所述蛋白的氨基酸序列中潛在的一個或多個T-細(xì)胞表位；(iii)設(shè)計新的序列變體，其中，經(jīng)鑒定的潛在T-細(xì)胞表位內(nèi)有一個或多個氨基酸經(jīng)過修飾，由此基本上減弱或去除了所述T-細(xì)胞表位的活性，這一效果可由體外或硅片上(in silico)的技術(shù)或生物學(xué)試驗(yàn)通過所述肽與MHC分子的結(jié)合來確定；(iv)通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建所述序列變體，并檢測所述的變體以便鑒定一個或多個具有所需性質(zhì)的變體；和(v)任選地重復(fù)步驟(ii)-(iv)；●如上所述的方法，其中步驟(iii)是通過在任何原本存在的T-細(xì)胞表位中替代、添加或缺失1-9個氨基酸殘基來進(jìn)行的；●如上所述的方法，其中，所述的改變是參照同源蛋白質(zhì)序列和/或硅片上(in silico)建模技術(shù)進(jìn)行的；●如上所述的方法，其中以上步驟(ii)是通過下述步驟進(jìn)行的(a)選擇具有已知氨基酸殘基序列的肽的一個區(qū)域；(b)然后由所選擇的區(qū)域中順序抽取預(yù)定統(tǒng)一大小且至少由3個氨基酸殘基組成的重疊氨基酸殘基片段；(c)通過對存在于抽樣氨基酸殘基片段中的每個疏水氨基酸殘基側(cè)鏈賦值求和，計算每一抽樣片段的MHC II類分子結(jié)合分值；和(d)根據(jù)計算出的該片段的MHC II類分子結(jié)合分值鑒定至少一個適于修飾的片段，以在基本上不減弱所述肽的治療功效的前提下改變肽的整體MHCII類結(jié)合分值；步驟(c)優(yōu)選地通過下述步驟利用經(jīng)改進(jìn)而包含了12-6范德華配體-蛋白能量排斥項(xiàng)和配體構(gòu)象能量項(xiàng)的Bhm評分函數(shù)(scoringfunction)進(jìn)行，所述步驟為(1)提供MHC II類分子模型第一數(shù)據(jù)庫；(2)提供所述MHC II類分子模型的容許肽主鏈(allowed peptide backbone)的第二數(shù)據(jù)庫；(3)從第一數(shù)據(jù)庫中篩選模型；(4)從第二數(shù)據(jù)庫中篩選容許肽主鏈；(5)鑒定在每個抽樣片段中存在的氨基酸殘基側(cè)鏈；(6)確定存在于每個抽樣片段中的所有側(cè)鏈的結(jié)合親和性值；以及對每一所述模型和每一所述主鏈重復(fù)步驟(1)到(5)；●選自圖1的具有潛在MHC II類結(jié)合活性且由未經(jīng)修飾的瀉根素1產(chǎn)生的13聚體(mer)T-細(xì)胞表位肽，及其在制備體內(nèi)使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低于具有相同生物學(xué)活性的任何未修飾分子的瀉根素1中的用途；●由來自圖1任一序列的13聚體T-細(xì)胞表位肽中的由至少9個連續(xù)的氨基酸殘基組成的肽序列，及其在制備體內(nèi)使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低于任何未修飾分子并且具有瀉根素分子生物學(xué)活性的瀉根素1中的用途；●式I結(jié)構(gòu)的瀉根素1分子X0DVSFRLSGATTTSYGVFIKNLREALPYERKVYNIPLLRSSISGSGRYX1X2LX3LTX4X5ADETX6SVAX7DX8TNVYIMGYLAGDVSYFFNEASATEAAKX9X10FKDAKKKX11TLPYSGNYERX12QTX13AX14X15X16X17ENX18PLGX19PAX20DSAX21TTX22YX23X24TASSAASAX25X26X27X28IQSTAESARYKFIEQQIGKRVDKTFLPSLATX29SX30ENNWSAX31SX32QX33QX34ASTNNGQFESPVVLIDGNNQRVSITNASARVVTSNIALLLNRNNIAAIGEDISMTLIGFEHGLYGI其中X0為氫或靶向部分，如抗體結(jié)構(gòu)域；X1最優(yōu)選A，但也考慮G和P；X2最優(yōu)選M，但也考慮A，G，P和I；X3最優(yōu)選A，但也考慮G和P；X4最優(yōu)選P，但也考慮Y；X5最優(yōu)選T，但也考慮S；X6為P；X7最優(yōu)選A，但也考慮P和G；X8最優(yōu)選A，但也考慮P和G；X9最優(yōu)選A，但也考慮P，G，H，D，E，N，Q，K，R，S和T；X10最優(yōu)選A，但也考慮P和G；X11最優(yōu)選A，但也考慮P和G；X12最優(yōu)選A，但也考慮P，S，T，H和K；X13為T；X14為H；X15為S；X16最優(yōu)選A，但也考慮S，T，P，N，D，E，G，H，K和Q；
X17為T；X18最優(yōu)選A，但也考慮P；X19最優(yōu)選A，但也考慮I，F(xiàn)，G，M，P，V，W和Y；X20最優(yōu)選F，但也考慮P和W；X21最優(yōu)選A，但也考慮P和G；X22最優(yōu)選G，但也考慮A和P；X23最優(yōu)選G，但也考慮A和P；X24最優(yōu)選A，但也考慮P和G；X25最優(yōu)選A，但也考慮P，G，S和T；X26最優(yōu)選A，但也考慮I，M，S，T，P和G；X27最優(yōu)選A，但也考慮G和P；X28最優(yōu)選S，但也考慮A，G，P，T，H，D，N，Q，K和R；X29最優(yōu)選T，但也考慮A，G，S，P，H，K，R，D，E，N和Q；X30最優(yōu)選A，但也考慮G，S，T，P，K，R，H，D，E，N和Q；X31為Q；X32最優(yōu)選H，但也考慮D，E，F(xiàn)，L，N，P，S，W和Y；X33最優(yōu)選T，但也考慮A，G，P，D，E，H，K，R，N，Q，S和T；X34最優(yōu)選D，且同時排除X1＝T，X2＝L，X3＝H，X4＝N，X5＝Y(jié)，X6＝I，X7＝V，X8＝V，X9＝F，X10＝V，X11＝V，X12＝L，X13＝A，X14＝G，X15＝K，X16＝I，X17＝R，X18＝I，X19＝L，X20＝L，X21＝I，X22＝L，X23＝Y(jié)，X24＝Y(jié)，X25＝L，X26＝L，X27＝V，X28＝L，X29＝I，X30＝L，X31＝L，X32＝K，X33＝I和X34＝I。
術(shù)語″T細(xì)胞表位″根據(jù)本發(fā)明的理解是指這樣的氨基酸序列，其可以結(jié)合MHC II類分子、可刺激T細(xì)胞和/或也可在與MHC II類的復(fù)合體中結(jié)合(不必可測得地活化)T細(xì)胞。
此處及后附權(quán)利要求中所用的術(shù)語“肽”是指包含兩個或多個氨基酸的化合物。氨基酸之間通過肽鍵(定義見下)相連。肽的生物生產(chǎn)中涉及20種不同的天然氨基酸，任意數(shù)量的所述氨基酸可按任意的順序連接形成肽鏈或環(huán)。用于生物生產(chǎn)肽中的天然氨基酸全部具有L-構(gòu)型?？蓱?yīng)用常規(guī)的合成方法利用L-氨基酸、D-氨基酸或兩種不同構(gòu)型的氨基酸的各種組合制備合成肽。一些肽僅包含少量的氨基酸單元。例如含有不到10個氨基酸單元的短肽有時被稱作“寡肽”。其他的包含大量氨基酸殘基，例如達(dá)100個或更多個氨基酸殘基的肽稱作“多肽”。習(xí)慣上將含有3個或3個以上氨基酸的任何肽鏈看作“多肽”，而通常將“寡肽”視為特定類型的短“多肽”。因而本文所提到的“多肽”應(yīng)理解為也包括“寡肽”。而且，所提到的“肽”包括多肽、寡肽和蛋白。不同的氨基酸排列形式形成不同的多肽或蛋白。因此，多肽的數(shù)量以及可形成的不同蛋白的數(shù)量實(shí)際上是無限的?！唉撂?Cα)”是肽鏈的碳-氫(CH)組分中的碳原子。“側(cè)鏈”是Cα的側(cè)基，其可包含簡單的或復(fù)雜的基團(tuán)或部分，且具有與所述肽的大小相比可顯著變化的外形大小。
本發(fā)明可應(yīng)用于與此處公開的瀉根素1具有基本上相同的一級氨基酸序列的任何瀉根素1分子，因此包括利用基因工程手段或其他方法獲得的、可能包含多于或少于267個氨基酸殘基的瀉根素1分子。
本發(fā)明是為了克服實(shí)際應(yīng)用中存在的下述問題，即將可溶性蛋白以治療方式導(dǎo)入自體生物中可引發(fā)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生可與所述可溶性蛋白相結(jié)合的宿主抗體。本發(fā)明通過提供施用于人宿主時引起免疫應(yīng)答的傾向發(fā)生改變的瀉根素1蛋白以試圖解決這個問題。根據(jù)本文描述的方法，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了含有驅(qū)動對該蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答的關(guān)鍵性T細(xì)胞表位的瀉根素1分子區(qū)域。
本發(fā)明中形成經(jīng)修飾的瀉根素1的總的方法包括下述步驟(a)確定多肽或其中一部分的氨基酸序列；(b)通過任意方法，包括利用體外或硅片上(in silico)的技術(shù)或生物學(xué)試驗(yàn)確定所述肽與MHC分子的結(jié)合，由此鑒定所述蛋白的氨基酸序列中潛在的一個或多個T-細(xì)胞表位；(c)設(shè)計新的序列變體，其中，經(jīng)鑒定的潛在T-細(xì)胞表位內(nèi)有一個或多個氨基酸經(jīng)過修飾，由此基本上減弱或去除了所述T-細(xì)胞表位的活性，這一效果可由體外或硅片上(in silico)的技術(shù)或生物學(xué)試驗(yàn)通過所述肽與MHC分子的結(jié)合來確定。構(gòu)建此序列變體以避免由所述的序列變體產(chǎn)生新的潛在T-細(xì)胞表位，否則所述的新的潛在T細(xì)胞表位又通過此種方式進(jìn)行修飾以基本上減弱或消除T-細(xì)胞表位活性；和(d)根據(jù)已知的重組技術(shù)通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建所述序列變體，并檢測所述的變體以便鑒定一個或多個具有所需性質(zhì)的變體。
對于步驟(b)中對潛在T-細(xì)胞表位的鑒定可依照本領(lǐng)域已公知的方法進(jìn)行。在WO 98/59244；WO 98/52976；WO 00/34317；WO 02/069232中也公開了適當(dāng)?shù)姆椒ǎ⒖捎糜阼b定從瀉根素1衍生的肽對MHC II類分子的結(jié)合傾向。實(shí)踐中，本發(fā)明的組合物通過一致應(yīng)用生物學(xué)的體外人T細(xì)胞增殖試驗(yàn)和在WO 02/069232中列出的方案開發(fā)的軟件工具而得到，這是本發(fā)明的實(shí)施方案。
所述軟件在肽MHC II類結(jié)合相互作用的水平模擬抗原呈遞過程以提供任一給定肽序列的結(jié)合分值。對人群中存在的許多主要MHC II類同種異型測定此分值。由于該方案可測試任意肽序列，可在肽與MHC II類結(jié)合溝相互作用的能力方面預(yù)測氨基酸替換、添加或刪除的結(jié)果。由此可設(shè)計含有與MHC II類相互作用并作為免疫原性T細(xì)胞表位發(fā)揮作用的肽的數(shù)量減少的新序列組合物。如果使用任一供體樣本進(jìn)行生物學(xué)測試可評估與最多4種DR同種異型的結(jié)合，那么硅片上的方法可使用大于40種同種異型同時測試相同的肽序列。實(shí)踐中，該方法可指導(dǎo)新序列變體的設(shè)計，其中所述新序列變體在與多種MHC同種異型相互作用的能力方面有所降低。
通過該硅片上方法的例子，對全長瀉根素1序列的分析結(jié)果示于圖1。列出了來自瀉根素1的檢測出與一種或多種MHC II類同種異型具有明顯結(jié)合分值的13聚體肽序列。從整體上講，認(rèn)為該13聚體肽的數(shù)據(jù)組提供了瀉根素1蛋白質(zhì)的可容許性MHC類配體的高度明確性、范圍。對于如需要蛋白水解酶加工全長瀉根素1多肽和導(dǎo)致瀉根素1肽體內(nèi)呈遞的其他生理步驟，下面這一點(diǎn)是清楚的，即整個肽庫的相對小的子集具有最終的生物學(xué)相關(guān)。為了進(jìn)一步確定此類生物學(xué)相關(guān)肽，本發(fā)明人研發(fā)了一種利用體外人T細(xì)胞增殖試驗(yàn)的方法。
該方法證明為一種特別有效的方法，于此處公開作為本發(fā)明的實(shí)施方案。該方法可用于測試序列的一部分，例如用于測試瀉根素1肽(如全部或部分在圖1中所列出的肽)的子集；或該方法可用于測試全長序列。在本研究中，該方法在一個方案中用于測試重疊的瀉根素1衍生肽序列，以掃描并測試全長的瀉根素1序列(包括表現(xiàn)為N末端前肽的肽)。檢測了合成肽對體外培養(yǎng)的人T細(xì)胞引起增殖反應(yīng)的能力。如果使用來自健康供體的幼稚人T細(xì)胞進(jìn)行該方法，本發(fā)明人建立了在使用該方法時刺激指數(shù)等于或大于2.0為一個有用的測定誘導(dǎo)增殖的參數(shù)。該刺激指數(shù)一般如下獲得所測定的針對受試肽的增殖分值(使用3H-胸苷摻入時每分鐘放射性的計數(shù))除以未與受試肽接觸的細(xì)胞增殖分值。
本發(fā)明研究揭示32種肽序列在來自至少一個供體的T細(xì)胞中可引起明顯的增殖反應(yīng)(即SI＞2.0)。在這組肽中，進(jìn)一步鑒定了這樣的肽子集，其在2個或多個分別的供體樣本中引起明顯的增殖反應(yīng)，并且這些反應(yīng)中的一部分顯示出反應(yīng)幅度確實(shí)顯著高于SI＝2.0。
最優(yōu)選的是提供這樣的瀉根素1分子，其中氨基酸的修飾(如替換)是在親本分子最具免疫原性的區(qū)域進(jìn)行。本發(fā)明人于此公開了人瀉根素1分子中最具免疫原性的區(qū)域位于至少5個區(qū)域，為包含分別含有以下氨基酸序列的殘基46-66；88-102；112-135；136-162和178-204的R1-R5區(qū)域R1)RYTLLHLTNYADETISVAVDV；R2)ATEAAKFVFKDAKKK；R3)ERLQTAAGKIRENIPLGLPALDSA；R4)ITTLYYYTAS SAASALLVLIQSTAESA和R5)ATISLENNWSALSKQIQIAST.
這些區(qū)域的鑒定是基于一個或多個供體PBMC樣本所顯示的SI＞2。例如表位區(qū)域R1在代表所供篩選的供體樣本中大于28％的6個不同供體樣本具有反應(yīng)性。同樣地，R2和R3表位與所測試的3個(14％)供體樣本具有反應(yīng)性，R4與所測試的5個(24％)供體樣本具有反應(yīng)性，R5與所測試的4個(19％)供體樣本具有反應(yīng)性?？傊?，區(qū)域R1-R5與21個供體PBMC樣本中的10個(48％)具有反應(yīng)性，覆蓋了大范圍的同種異型特異性。
本發(fā)明主要優(yōu)選的實(shí)施方案包含這樣的瀉根素1分子，其中改變了在任一表位R1-R5中所鑒定的MHC II類配體，以消除結(jié)合或減少與肽結(jié)合的MHC同種異型數(shù)量。
當(dāng)鑒定了多個潛在的表位并且特別是當(dāng)發(fā)現(xiàn)了許多在生物學(xué)測試中可刺激T細(xì)胞的肽序列，可對該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征與通過MHC II類呈遞途徑引起免疫反應(yīng)的傾向之間的關(guān)系進(jìn)行認(rèn)知。例如當(dāng)已知目標(biāo)蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)，則可分析結(jié)晶的B因子分值，作為蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)無序的證據(jù)，認(rèn)為該參數(shù)與生物學(xué)相關(guān)的優(yōu)勢免疫肽表位相關(guān)[Dai G.等，(2001)J.Biological Chem.27641913-41920]。對瀉根素1晶體結(jié)構(gòu)模型[PDBID1BRY，Gawlak，S.L.等，(1997)Biochemistry 363095]進(jìn)行的此種分析表明多個免疫優(yōu)勢表位很可能具有至少4個繪制于區(qū)域中間位置的高于平均B因子分值的分別區(qū)帶。在這4個區(qū)域中，繪制于肽N端邊界的3個區(qū)域在實(shí)施例2的幼稚T細(xì)胞試驗(yàn)中顯示引起增殖反應(yīng)。
這些數(shù)據(jù)與未接觸抗原的供體針對特定肽產(chǎn)生反應(yīng)的數(shù)目結(jié)合在一起可預(yù)測所述分子最具優(yōu)勢免疫區(qū)域的等級。但是認(rèn)識到在實(shí)踐中，認(rèn)為這些區(qū)域中的每一區(qū)域?qū)θ耸怯忻庖咴缘?，并因此需要用本發(fā)明的方案修飾。因此，參照上面定義的序列串R1-R5，序列的等級為{R1，R5}、{R3，R4}、R2，其中認(rèn)為{R1，R5}為最具免疫原性的序列，而R2具有相對較弱的免疫原性。在括號中的表示這些序列具有相同的等級。在此基礎(chǔ)上，在本發(fā)明方案中最優(yōu)選的瀉根素1組合物涉及在表位區(qū)域R1和R5中進(jìn)行修飾。也希望含有在表位區(qū)域R3和R4中進(jìn)行額外修飾的組合物，并任選地在表位區(qū)域R2中也有額外的替換。
文中公開的肽序列顯示了構(gòu)建其中一個或多個這些表位改變的經(jīng)修飾瀉根素1分子所需的關(guān)鍵信息。在本發(fā)明的方案下，表位通過突變而改變，導(dǎo)致在序列中不再能作為T細(xì)胞表位起作用。也可使用重組DNA方法實(shí)現(xiàn)靶序列的定點(diǎn)誘變，許多此類技術(shù)是可獲得的，并且為本領(lǐng)域熟知。實(shí)際上，可產(chǎn)生許多變體瀉根素蛋白并測試它們的目標(biāo)免疫和功能特性。
本發(fā)明的目的是修飾來自圖1的至少一個或多個上述肽的氨基酸序列，最優(yōu)選地是修飾上面確定的表位區(qū)域R1-R5中一個或多個區(qū)域的序列。文中公開了達(dá)到以下目的的合適修飾，所述目的為降低或消除目標(biāo)肽序列作為T細(xì)胞表位的能力，并且其可導(dǎo)致瀉根素1分子當(dāng)作為治療劑施與人類宿主時具有降低的免疫原性潛力。
對于去除T細(xì)胞表位，優(yōu)選在肽序列合適的位點(diǎn)處進(jìn)行氨基酸替代，所述位點(diǎn)的替代預(yù)計可實(shí)現(xiàn)相當(dāng)程度降低或去除T細(xì)胞表位的活性。實(shí)踐中，合適的位點(diǎn)優(yōu)選等同于在MHC II類結(jié)合溝所提供的口袋之一中結(jié)合的氨基酸殘基。最優(yōu)選的是在所述肽的稱作P1或P1錨的位置改變在裂縫的第一口袋內(nèi)的結(jié)合。公認(rèn)地，肽的P1錨殘基和MHC II類結(jié)合溝的第一口袋之間的結(jié)合相互作用的質(zhì)量是整個肽的總結(jié)合親和性的主要決定因素。在所述肽的這一位置的適當(dāng)替代是替代為不易容納到所述口袋中的殘基，例如替代為更親水的殘基。可考慮在單一表位內(nèi)進(jìn)行替代的組合，并且當(dāng)單個定義的表位互相重疊時這是尤其合適的。此外，在給定的表位內(nèi)的單氨基酸替代或在一個表位內(nèi)的組合氨基酸替代也可以在非對應(yīng)于MHC II類結(jié)合溝的″口袋殘基″的位置，而是在所述肽序列內(nèi)的任意位點(diǎn)上進(jìn)行。替代可參照同源結(jié)構(gòu)或由本領(lǐng)域已知的硅片上(in silico)技術(shù)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)方法進(jìn)行，也可以根據(jù)本發(fā)明分子的已知結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行。所有此類替代均落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
也可以考慮在上面所鑒定的肽之外進(jìn)行氨基酸替代，特別是與在所列肽內(nèi)進(jìn)行的替代相結(jié)合的情況下。例如可以考慮利用某種改變恢復(fù)變體分子的結(jié)構(gòu)或生物學(xué)活性。這種補(bǔ)償性的改變和在瀉根素1多肽中缺失或添加特定的氨基酸殘基以得到具有所需活性的變體的改變，以及在任何本發(fā)明公開的肽中進(jìn)行的改變均落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
此類優(yōu)選的修飾的一個例子是通過破壞R1表位區(qū)而提供。完全消除該區(qū)域內(nèi)所有可能的MHC配體通過以下一組替代而實(shí)現(xiàn)，包含的改變?yōu)門49A、L50M、H52A、N55P、Y56T、I61P、V65A和V67A。單獨(dú)或組合的此類優(yōu)選的變化為本發(fā)明的一個實(shí)施方案。
同樣地，通過破壞R2表位而進(jìn)行的一組優(yōu)選修飾通過以下一組替代而提供F99A、V100A和V108A。單獨(dú)或組合的此類優(yōu)選的變化為本發(fā)明的一個實(shí)施方案。
對于表位區(qū)R3，基于對所述分子關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征的了解而定義了另外一組替代。非常希望構(gòu)建含有在亮氨酸殘基115(L115)替代的經(jīng)修飾瀉根素1分子，因?yàn)樵摎埢勺鳛樵赗3表位中鑒定的一個MHC II類配體的P1錨起作用。優(yōu)選的一組替代因此包含L115A、I122A、I126A、L130A、L133F和I137A。但是由于L115位于結(jié)合裂隙的底部，對RIP活性而言該替代可減弱所述分子的功能活性?？啥x破壞R3表位中相當(dāng)量的MHC配體而保留L115的另一組替代。因此這些替代包含A118T、G120H、K121S和R123T，并且可替代雙重改變L115A和I122A。所有改變均為本發(fā)明的實(shí)施方案。
對于表位區(qū)R4，一組優(yōu)選的替代包含的改變?yōu)長140G、Y142G、Y143A與L152A、L153A、V154A和L155S的組合。單獨(dú)或組合的所有變化為本發(fā)明的一個實(shí)施方案。
一組優(yōu)選修飾的進(jìn)一步的例子是通過破壞R5表位區(qū)而提供，所發(fā)生的變化包含I187T、L189A、L196Q、K197H、I200T和I202D。單獨(dú)或組合的所有變化為本發(fā)明的實(shí)施方案。
對于幾乎所有上述優(yōu)選的替代，可在任一給定的位點(diǎn)考慮其他的氨基酸。但是對其他殘基的選擇不是無限的，所述殘基需滿足廣義的目的，即減小或消除潛在的MHC肽相互作用，并且適應(yīng)于所述分子的結(jié)構(gòu)；即對大多數(shù)的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體避免了明顯的側(cè)鏈沖突和或靜電沖突，或者接觸為保守的或人工設(shè)計的?？煽紤]的其他殘基選擇的例子在式1中描述的瀉根素1結(jié)構(gòu)中提供。
由前述可見，根據(jù)本發(fā)明，可產(chǎn)生許多的變體瀉根素1蛋白，并測試其目標(biāo)免疫和功能特性，所有這些功能蛋白質(zhì)均為本發(fā)明的實(shí)施方案。而且所進(jìn)行的修飾顯示出產(chǎn)生的肽序列不具有親本或“野生型”肽序列與MHC II類結(jié)合相同的親和性，其中所述親和性使用WO 02/069232的預(yù)測性硅片上MHC II類結(jié)合工具進(jìn)行。
本發(fā)明的優(yōu)選分子可以幾種方式中的任一種制備，但優(yōu)選采用常規(guī)的重組方法。這是一種相對容易使用蛋白質(zhì)序列的方法，并且此處提供的信息可推導(dǎo)編碼任一優(yōu)選蛋白質(zhì)序列的多核苷酸(DNA)。這可通過例如使用計算機(jī)軟件工具如DNSstar軟件包[DNAstar Inc，Madison，WI，USA]等。認(rèn)為任一能編碼本發(fā)明優(yōu)選的多肽或其重要同系物的此類DNA序列為本發(fā)明的實(shí)施方案。
作為一般性方案，可通過基因合成制備編碼任一優(yōu)選瀉根素1蛋白序列的基因，并將所述基因克隆入合適的表達(dá)載體。接下來將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并選擇和培養(yǎng)細(xì)胞。從培養(yǎng)基純化所述優(yōu)選分子并制劑為用于治療性施用的制劑。另外，野生型瀉根素1基因序列可例如使用從植物瀉根的根組織制備的RNA按照cDNA克隆策略而獲得。所述野生型基因可用作誘變和構(gòu)建優(yōu)選變體序列的模板。因此，使用如Higuchi等[Higuchi等(1988)Nucleic Acids Res.167351]所述的″重疊延伸PCR″策略是尤其簡便的，雖然也可方便地使用其他方法和體系。
可通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建優(yōu)選的瀉根素1分子，所述技術(shù)包括將瀉根素1分子與目標(biāo)抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)域或其他靶向部分融合。用于純化和操作重組蛋白(包括融合蛋白)的方法為本領(lǐng)域熟知。必要的技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的描述，如″分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Molecular CloningA LaboratoryManual)″，第二版(Sambrook等人，1989)；″寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)″(M.J.Gait編輯，1984)；″動物細(xì)胞培養(yǎng)(Animal Cell Culture)″(R.1.Freshney編輯，1987)；″酶學(xué)方法(Methodsin Enzymology)″(Academic Press，Inc.)；″實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(Handbook ofExperimental Immunology)″(D.M.Weir & C.C.Blackwell編輯)；″哺乳動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)″(J.M.Miller & M.P.Calos編輯，1987)；″分子生物學(xué)最新方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)″(F.M.Ausubel等編輯，1987)；″PCR聚合酶鏈反應(yīng)(PCRThe Polymerase Chain Reaction)″，(Mullis等編輯，1994)；″免疫學(xué)最新方法(Current Protocols in Immunology)″(J.E.Coligan等編輯，1991)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚多個備選的替代組可達(dá)到去除不需要表位的目的。但是認(rèn)為所得的序列與本文公開的具體組合物高度同源，并因此在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
雖然本發(fā)明涉經(jīng)修飾的瀉根素1，但認(rèn)為包含此類經(jīng)修飾瀉根素蛋白或經(jīng)修飾瀉根素蛋白片段的組合物以及相關(guān)組合物落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另一方面，本發(fā)明涉及編碼經(jīng)修飾瀉根素的核酸。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及使用經(jīng)修飾的瀉根素1蛋白治療性治療人的方法。在此方面，可將經(jīng)修飾的瀉根素1蛋白與抗體分子或抗體分子片段連接。所述連接可通過化學(xué)交聯(lián)劑，或可將瀉根素1-抗體作為重組的融合蛋白產(chǎn)生。所述融合分子可含有經(jīng)修飾的瀉根素1結(jié)構(gòu)域和位于融合分子N末端的抗體結(jié)構(gòu)域，但也可考慮位于相反方向的抗體結(jié)構(gòu)域。
用于特異性連接至本發(fā)明經(jīng)修飾瀉根素1分子的目標(biāo)抗體包括那些引導(dǎo)抗原決定簇內(nèi)化的抗體。這類抗原的例子稀少但包括A33抗原[Heath，J.K.等(1997)Proc.Natl，Acad.Sci U.S.A.94469-474]和GA733-1抗原[US，5,840,854]?？煽紤]使用癌胚抗原，并可用許多抗體靶向，所述抗體包括MFE23[Chester，K.A.等(1994)Lancet 343455]、A5B7[WO92/010159]、T84.66[US，5,081,235]、MN-14[Hansen，H.J.等(1993)Cancer 713478-3485]、COL-1[US，5,472,693]等。其他目標(biāo)特異性抗體包括引導(dǎo)抗原不內(nèi)化的抗體，抗原包括如被抗體KS 1/4[Spearman等(1987)J.Pharmacol.Exp.Therapeutics 241695-703]和其他抗體識別的40kDa糖蛋白抗原?？捎冒笹D2抗體如抗體14.18[US，4,675,287；EP 0 192 657]選擇其他抗原如表皮生長因子受體(HER1)或相關(guān)受體如HER2，或?yàn)榍傲邢偬禺惖哪た乖目贵w[US，6,107,090]，也可考慮IL-2受體[US，6,013,256]、Lewis Y決定簇、粘糖蛋白等的抗體。
在經(jīng)修飾瀉根素1蛋白與抗體序列融合的所有情況下，最希望使用這樣的抗體序列，其中可結(jié)合MHC II類分子或刺激T細(xì)胞或結(jié)合至具有MHC II類分子的T細(xì)胞的T細(xì)胞表位或序列已去除。
在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾瀉根素1蛋白可連接至非抗體蛋白，但所述非抗體蛋白仍可引導(dǎo)與特異靶細(xì)胞的特異結(jié)合作用。此類蛋白分子包括多種針對特異細(xì)胞表面受體的多肽配體并因此包括多種細(xì)胞因子、肽、多肽激素及其他生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。主要的例子包括如血管內(nèi)皮生長因子、內(nèi)皮生長因子、heregulin、白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子以及其他蛋白和糖蛋白分子?？煽紤]這些分子和其他分子與本發(fā)明的瀉根素1形成的融合蛋白，并且可包含相對于蛋白配體結(jié)構(gòu)域而言所述經(jīng)修飾瀉根素1部分位于N末端或C末端。同樣可考慮純化配體與經(jīng)修飾瀉根素1蛋白的化學(xué)交聯(lián)并落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾瀉根素1蛋白可以包含水溶性聚合物如羥丙基甲基丙烯酰胺或其他聚合物的復(fù)合體，其中所述經(jīng)修飾瀉根素1蛋白與聚合物共價或非共價結(jié)合。此實(shí)施方案另外可包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域如抗體或抗體片段與聚合瀉根素1復(fù)合體的組合。
又在一個進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及使用下述藥物制品進(jìn)行治療性治療的方法，所述藥物制品包含與此處公開序列具有序列同一性或部分同一性的肽或衍生物分子。
在另一個方面，此處公開的并與瀉根素1分子相關(guān)的主要免疫原性表位也在文中顯示為存在于許多其他1型RIP蛋白的一級序列中，在所述1型RIP蛋白中瀉根素1是其中的一個例子。因此蛋白質(zhì)α-天花粉蛋白(1TCS)、α-苦瓜子蛋白(1MOM)和β-苦瓜子蛋白(1CF5)及其他蛋白質(zhì)可通過蛋白質(zhì)分析顯示為包含與瀉根素1分子的免疫原性區(qū)具有同一性或同一性接近的序列元件。圖3描述了瀉根素1主要表位與來自1TCS、1MOM和1CF5蛋白的序列元件之間的序列比較。盡管本發(fā)明涉及衍生自瀉根素1蛋白的肽和經(jīng)修飾序列，但如果在其他蛋白質(zhì)中鑒定到了相同或基本上類似的序列，也認(rèn)為它們同樣落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。對一些文中確定的優(yōu)選突變組尤其適用。例如對瀉根素1序列進(jìn)行的R2和R3中的改變可用于從1TCS序列中的等同區(qū)域去除MHC II類配體。同樣瀉根素1中包含T49A、L50M、H52A、N55P、Y56T、I61P、V65A和V67A的一個或多個替代的R1改變可應(yīng)用于蛋白質(zhì)1TCS和1CFS中的等同區(qū)域。前面所用編號是根據(jù)瀉根素1序列的編號。優(yōu)選的R4和R5改變也可在RIP蛋白1TCS、1CF5和1MOM中進(jìn)行，并且同樣落入本發(fā)明的范圍中。
盡管本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的瀉根素1，但認(rèn)為包含此類經(jīng)修飾瀉根素1蛋白或經(jīng)修飾瀉根素1蛋白的片段的組合物和相關(guān)組合物均位于本發(fā)明的范圍內(nèi)。在這方面的一個相關(guān)例子可能是對肽介導(dǎo)的耐受誘導(dǎo)策略的研發(fā)，其中將一種或多種文中公開的肽施與作為免疫治療意向的患者。因此合成肽分子(如一種或多種在圖1中列出的合成肽分子)或更優(yōu)選地包含如上所定義的任一表位區(qū)R1-R5的所有或部分的序列。認(rèn)為此類肽為本發(fā)明的實(shí)施方案。
在另一方面，本發(fā)明涉及編碼經(jīng)修飾瀉根素1的核酸。
本發(fā)明現(xiàn)在通過以下的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例闡述。本發(fā)明還通過下述圖闡述圖1提供了瀉根素1中具有人MHC II類結(jié)合活性的潛在肽序列列表。肽為13聚體，氨基酸用單字母代碼表示；圖2提供了對瀉根素1使用實(shí)施例2的體外人幼稚T細(xì)胞試驗(yàn)分析的15聚體肽序列列表。指出了瀉根素1序列中的肽ID#和N末端肽殘基的位置；圖3指出的是在實(shí)施例2的體外人幼稚T細(xì)胞試驗(yàn)中，對由2個或更多供體的PBMC制備的PBMC制備物顯示出刺激指數(shù)為2.0或更大的瀉根素1(1BRY)序列中的序列元件R1、R2、R3、R4和R5。來自相關(guān)蛋白α-天花粉蛋白(1TCS)、α-苦瓜子蛋白(1MOM)和β-苦瓜子蛋白(1CF5)的相應(yīng)序列顯示于每一瀉根素1序列下。在所示序列之外的序列與瀉根素1相同。氨基酸以單字母代碼描述。
圖4顯示了供體對單個的瀉根素1肽的反應(yīng)百分率。使用來自21個供體樣本的PBMC制備物測試了總共85個肽。認(rèn)為SI＞2為陽性反應(yīng)，如果在2個或更多供體觀察到了陽性反應(yīng)，則確定為表位區(qū)。
圖5顯示的是來自人幼稚T細(xì)胞增殖試驗(yàn)中的代表性刺激指數(shù)(SI)圖。反應(yīng)顯示的是1μM和5μM的肽濃度。每一峰值是三次試驗(yàn)的平均值。圖5A顯示的是對位于瀉根素1表位區(qū)R1中的肽，來自3個供體樣本的PBMC反應(yīng)。圖5B顯示的是對位于瀉根素1表位區(qū)R2中的肽，來自2個供體樣本的PBMC反應(yīng)。圖5C顯示的是對位于瀉根素1表位區(qū)R3中的肽，來自2個供體樣本的PBMC反應(yīng)。圖5D顯示的是對位于瀉根素1表位區(qū)R5中的肽，來自3個供體樣本的PBMC反應(yīng)。
圖6描述了在表位區(qū)R1中鑒定的MHC II類配體。配體使用實(shí)施例1的硅片上系統(tǒng)鑒定。在這種情況下，人18種DR同種異型的結(jié)合特性表示為多欄。所檢測的配體為13聚體，并且每一13聚體的殘基編號1以彩色框表示。每一肽與18種同種異型中的每一種結(jié)合相互作用的強(qiáng)度(高、中或低)根據(jù)所顯示的關(guān)鍵示出。
圖7描述了在表位區(qū)R2中鑒定的MHC II類配體。配體使用實(shí)施例1的硅片上系統(tǒng)鑒定。在這種情況下，人18種DR同種異型的結(jié)合特性表示為多欄。所檢測的配體為13聚體，并且每一13聚體的殘基編號1以彩色框表示。每一肽與18種同種異型中的每一種結(jié)合相互作用的強(qiáng)度(高、中或低)根據(jù)所顯示的關(guān)鍵示出。
圖8描述了在表位區(qū)R3中鑒定的MHC II類配體。配體使用實(shí)施例1的硅片上系統(tǒng)鑒定。在這種情況下，人18種DR同種異型的結(jié)合特性表示為多欄。所檢測的配體為13聚體，并且每一13聚體的殘基編號1以彩色框表示。每一肽與18種同種異型中的每一種結(jié)合相互作用的強(qiáng)度(高、中或低)根據(jù)所顯示的關(guān)鍵示出。
圖9描述了在表位區(qū)R4中鑒定的MHC II類配體。配體使用實(shí)施例1的硅片上系統(tǒng)鑒定。在這種情況下，人18種DR同種異型的結(jié)合特性表示為多欄。所檢測的配體為13聚體，并且每一13聚體的殘基編號1以彩色框表示。每一肽與18種同種異型中的每一種結(jié)合相互作用的強(qiáng)度(高、中或低)根據(jù)所顯示的關(guān)鍵示出。
圖10描述了在表位區(qū)R5中鑒定的MHC II類配體。配體使用實(shí)施例1的硅片上系統(tǒng)鑒定。在這種情況下，人18種DR同種異型的結(jié)合特性表示為多欄。所檢測的配體為13聚體，并且每一13聚體的殘基編號1以彩色框表示。每一肽與18種同種異型中的每一種結(jié)合相互作用的強(qiáng)度(高、中或低)根據(jù)所顯示的關(guān)鍵示出。
式1描述的是最優(yōu)選的瀉根素1結(jié)構(gòu)，給出了可考慮摻入瀉根素1分子中的具有降低免疫原性潛力的備選替代。
實(shí)施例1使用硅片上系統(tǒng)進(jìn)行肽MHC結(jié)合分析來鑒定瀉根素1中表位的方法有多種因素對決定蛋白或多肽的總體結(jié)構(gòu)起重要作用。首先是肽鍵，即將氨基酸連接在一起形成鏈的鍵，它是一種共價鍵。這種鍵是平面結(jié)構(gòu)的，實(shí)質(zhì)上是一種取代的酰胺?！磅０贰敝负?CONH-基團(tuán)的一組有機(jī)化合物中的任何一個化合物。
連接相鄰氨基酸的Cα的平面肽鍵如下所示 由于O＝C和C-N原子位于一個相對剛性的平面中，所以不會發(fā)生沿這些軸的自由旋轉(zhuǎn)。因此，圖中虛線所示的平面有時被稱作“酰胺”平面或“肽平面”，肽主鏈中的氧(O)、碳(C)、氮(N)和氫(H)原子位于其中。Cα原子位于酰胺平面中相對的角上。由于肽或酰胺平面中的O＝C和C-N原子基本上不發(fā)生旋轉(zhuǎn)，所以多肽鏈包含一系列連接Cα原子的平面肽鍵。
第二個對決定多肽或蛋白的整體結(jié)構(gòu)或構(gòu)象起重要作用的因素是每一酰胺平面繞共有Cα鍵的轉(zhuǎn)角。此后術(shù)語″轉(zhuǎn)角″和″扭轉(zhuǎn)角″是等同的術(shù)語。假定O、C、N和H原子保留在酰胺平面中(這通常是一種正確的假設(shè)，盡管在一些構(gòu)象中這些原子會輕微的偏移平面)，這些轉(zhuǎn)角確定了N和R多肽主鏈構(gòu)象，即相鄰殘基之間的結(jié)構(gòu)。這兩個轉(zhuǎn)角稱為φ和Ψ。因此，一套φi和Ψi角(其中，腳標(biāo)i代表多肽鏈中的特定殘基)有效地規(guī)定了多肽鏈的二級結(jié)構(gòu)。在文獻(xiàn)中定義了用于確定φ和Ψ角的慣例，即在給定的多肽中酰胺平面形成0度角的參考點(diǎn)，以及哪個角是φ角，哪個角是Ψ角的定義。參見Ramachandran等，Adv.Prot.Chem.23283-437(1968)，285-94頁，這些頁中的內(nèi)容在此引入作為參考。
本發(fā)明的方法可應(yīng)用于任何蛋白，并部分基于下述發(fā)現(xiàn)，即人MHCII類分子結(jié)合溝的主要口袋1錨定位點(diǎn)對特定氨基酸側(cè)鏈具有設(shè)計好的特異性。這一口袋的特異性由MHC II類分子β鏈第86位的氨基酸的身份來確定。這一位點(diǎn)位于口袋1的底部并決定可容納于這一口袋中的氨基酸側(cè)鏈的大小。Marshall，K.W.，J.Immunol.，1524946-4956(1994)。如果這一殘基是甘氨酸，則所有的疏水性脂肪族和芳香族氨基酸(疏水性脂肪族氨基酸是纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸，芳香族氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)均可容納于所述的口袋中，優(yōu)選芳香族側(cè)鏈。如果這一口袋殘基是纈氨酸，則該氨基酸的側(cè)鏈伸到口袋中并限制了可容納的肽側(cè)鏈的大小，所以只有疏水性脂肪族側(cè)鏈可容納進(jìn)去。因此在氨基酸殘基序列中，無論哪里發(fā)現(xiàn)了帶有疏水性脂肪族或芳香族側(cè)鏈的氨基酸，即有存在MHC II類限制性T-細(xì)胞表位的可能性。但是，如果所述的側(cè)鏈?zhǔn)鞘杷灾咀鍌?cè)鏈，其與T-細(xì)胞表位相關(guān)的可能性約是芳香族側(cè)鏈的兩倍(假定1型口袋近似平均地分布于全球種群中)。
將本發(fā)明具體化的計算機(jī)方法描繪出肽區(qū)域包含T-細(xì)胞表位的可能性，該方法如下(1)掃描預(yù)定長度肽片段的一級序列，并鑒定存在的所有疏水性脂肪族和芳香族側(cè)鏈。(2)對疏水性脂肪族側(cè)鏈賦予比芳香族側(cè)鏈高的值；優(yōu)選約兩倍于賦予芳香族側(cè)鏈的值，例如，給疏水性脂肪族側(cè)鏈賦值為2，給芳香族側(cè)鏈賦值為1。(3)將所述肽中的預(yù)定統(tǒng)一長度的每一重疊氨基酸殘基片段(窗口)中確定存在的值總和起來，再將某一特定片段(窗口)的總值賦予該片段(窗口)中間位置的某個單個氨基酸殘基，優(yōu)選賦予大約處于抽樣片段(窗口)中間點(diǎn)的氨基酸。將這一過程對每一抽樣的重疊氨基酸殘基片段(窗口)重復(fù)進(jìn)行。因此，所述肽的每一氨基酸殘基均被賦予了一個值，該值與T-細(xì)胞表位存在于此特定片段(窗口)中的可能性相關(guān)。(4)用按照上述步驟3中的描述計算、賦予的值對被評估的整個氨基酸殘基序列的氨基酸坐標(biāo)作圖。(5)序列中具有預(yù)定值(例如該值為1)的所有部分均被認(rèn)為可能包含T細(xì)胞表位，并且在需要時可進(jìn)行修飾。在這一特定方面本發(fā)明提供了通用的方法，由此可描述可能包含T-細(xì)胞表位的肽區(qū)域。在這些區(qū)域中對所述的肽進(jìn)行修飾有可能改變MHC II類的結(jié)合特性。
依照本發(fā)明的另一方面，可利用考慮了肽與MHC II等位基因模型之間的相互作用的更復(fù)雜計算方法來更精確地預(yù)測T-細(xì)胞表位。根據(jù)這一方面，對肽中存在的T細(xì)胞表位的計算預(yù)測考慮到基于所有已知MHCII類分子的結(jié)構(gòu)構(gòu)建至少42個MHC II類等位基因模型；使用這些模型計算鑒定T細(xì)胞表位的方法；對每一模型構(gòu)建肽主鏈文庫以允許在相關(guān)肽主鏈α碳(Cα)位置具有已知的變異性；在肽和MHC II類分子間相互作用關(guān)鍵的位置處，對與每一模型對接(dock)的每一主鏈，相對于20種氨基酸選項(xiàng)中每一種構(gòu)建氨基酸側(cè)鏈構(gòu)象文庫；以及將這些主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象文庫與評分函數(shù)結(jié)合用于選擇與特定MHC II類分子對接的特定肽的最佳主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象并得出該相互作用的結(jié)合分值。
MHC II類分子模型可從Brookhaven蛋白數(shù)據(jù)庫(″PDB″)中的許多類似的結(jié)構(gòu)出發(fā)通過同源建模推導(dǎo)得出。它們可通過使用引入了模擬退火算法的半自動同源建模軟件(Modeller，Sali A.& Blundell TL.，1993.J.Mol Biol 234779-815)并結(jié)合用于能量最小化的CHARMm力場(購自Molecular Simulations Inc.，San Diego，Ca.)來制備。也可以應(yīng)用其他的建模方法。
本發(fā)明的方法與下述的其他計算方法有著顯著的不同，這些方法在于利用從實(shí)驗(yàn)中得來的關(guān)于一小組MHC II類分子結(jié)合溝中每一位點(diǎn)的每一種氨基酸選項(xiàng)的結(jié)合數(shù)據(jù)文庫(Marshall，K.W.等，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids，1(3)157-162)(1995)；或利用類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)合數(shù)據(jù)以定義所述的溝中特定結(jié)合口袋類型的結(jié)合特性(同樣利用相對小的MHC II類分子亞組)然后將這一口袋文庫中的口袋類型進(jìn)行‘混合和匹配’以人工構(gòu)建更“實(shí)際的”MHC II類分子(Sturniolo T.等，Nat.Biotech，17(6)555-561(1999)。這兩種現(xiàn)有方法的主要缺陷在于實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和需要合成大量的肽變體造成僅有少量的MHC II類分子可通過實(shí)驗(yàn)掃描。因此第一種已知的方法僅能預(yù)測少量的MHC II類分子。第二種已知的方法還假設(shè)在不同II類等位基因的背景下在一個分子中襯有類似氨基酸的口袋將具有相同的結(jié)合特性，故其另外的缺陷在于，僅僅可“實(shí)際地”地構(gòu)建出那些包含口袋文庫中所包含的口袋的MHC II類分子。利用本發(fā)明的建模方法可推導(dǎo)出任意數(shù)量和類型的MHC II類分子的結(jié)構(gòu)，因此可特異性地選擇等位基因以代表全球種群的特征。此外，掃描的MHC II類分子的數(shù)量可通過構(gòu)建更多的模型而增加而無需通過復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)獲得額外的數(shù)據(jù)。
利用主鏈文庫使得被掃描的各種肽在與特定的MHC II類分子結(jié)合時其Cα原子位置處可進(jìn)行變化。這也與上述現(xiàn)有技術(shù)中的計算機(jī)方法不同，在那些方法中依賴于利用簡化的肽主鏈來掃描結(jié)合在特定口袋中的氨基酸。這些簡化的主鏈不可能代表在“真正的”肽中存在的主鏈構(gòu)象，從而導(dǎo)致對肽結(jié)合的預(yù)測不準(zhǔn)確。本發(fā)明的主鏈文庫是通過疊加蛋白數(shù)據(jù)庫中所有與MHC II類分子結(jié)合的肽的主鏈，并考慮到位于結(jié)合溝內(nèi)的11個氨基酸的每個氨基酸的Cα原子之間的均方根(RMS)差而構(gòu)建的。盡管該文庫可來自少量合適的可獲得的小鼠和人的結(jié)構(gòu)(當(dāng)前為13種)，但為了允許存在甚至更大變異的可能性，將每一C″-α位點(diǎn)的RMS數(shù)提高50％。然后確定每一氨基酸的平均Cα位置，圍繞這一點(diǎn)劃一個球，其半徑等于在該位置的RMS差加50％。該球體代表所有可允許的Cα位置。
自具有最小RMS差的Cα(上述口袋1中氨基酸殘基的Cα，等同于結(jié)合溝中11個殘基的位置2)起運(yùn)作，將所述的球三維網(wǎng)格化，網(wǎng)格內(nèi)的每個頂點(diǎn)作為該氨基酸的Cα的可能位置。將后續(xù)的酰胺平面(相應(yīng)于與后續(xù)氨基酸的肽鍵)移動到這些Cα的每一個上面，將φ和Ψ角以設(shè)定的間隔逐步地轉(zhuǎn)動以便于安置后續(xù)的Cα。如果后續(xù)的Cα落入對這一Cα而言‘可被允許的位置球’中，則此二肽的方向即可被接受，如果其落入所述球之外則所得的二肽不能被接受。對每一后續(xù)Cα位置均重復(fù)這一過程，使肽從所述的口袋1Cα‘種子’開始生長，直到全部9個后續(xù)的Cα的位置均根據(jù)之前Cα的所有可能排列確定下來。然后對口袋1前的單個Cα重復(fù)上述步驟1次以上以構(gòu)建定位于結(jié)合溝內(nèi)的主鏈Cα位置文庫。
生成的主鏈數(shù)目取決于幾種因素‘可被允許的位置球’的大??；對口袋1位點(diǎn)處′最初的球′網(wǎng)格化的細(xì)度；用于定位后續(xù)Cα的φ和Ψ角逐步旋轉(zhuǎn)的細(xì)度。利用這一程序可以構(gòu)建大的主鏈文庫。主鏈文庫越大越可能發(fā)現(xiàn)對MHC II類分子結(jié)合溝內(nèi)的特定肽而言的最適主鏈。鑒于和結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸可能存在沖突，所以不是所有的主鏈均適合于與所有MHC II類分子模型‘對接’(docking)，故對每個等位基因建立亞文庫以包含適合被該等位基因容納的主鏈。利用所述的主鏈文庫并結(jié)合MHC II類分子模型可以構(gòu)建出由與每一容許主鏈對接的每一MHC II類分子結(jié)合溝的每一位點(diǎn)中的每一氨基酸的容許側(cè)鏈構(gòu)象所組成的詳盡數(shù)據(jù)庫?？梢岳煤唵蔚牧Ⅲw重疊函數(shù)構(gòu)建這一數(shù)據(jù)組，其中，主鏈與MHC II類分子對接，氨基酸側(cè)鏈在所需位置被嫁接到主鏈上。將側(cè)鏈上可旋轉(zhuǎn)的鍵以設(shè)定的間隔逐步旋轉(zhuǎn)，記錄下依賴于該鍵的原子的最終定位。將所述原子與結(jié)合溝側(cè)鏈原子間的相互作用記錄下來，根據(jù)下述的標(biāo)準(zhǔn)確定是否接受這些位置如此定位的所有原子的重疊總量不能超過預(yù)定值。因此，構(gòu)象搜索的嚴(yán)謹(jǐn)度是在鍵的逐步旋轉(zhuǎn)中所用的間隔及對總重疊的預(yù)定限度的函數(shù)。如果已知特定的口袋是剛性的，則后一值可較小，但若已知口袋側(cè)鏈的位置相對靈活則嚴(yán)謹(jǐn)度可放松。這樣便可以模擬結(jié)合溝口袋內(nèi)靈活性的變化。針對與每一MHC II類分子對接后每一主鏈的所有位點(diǎn)上的所有氨基酸重復(fù)這種構(gòu)象搜索以建立詳盡的側(cè)鏈構(gòu)象數(shù)據(jù)庫。
用適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)表達(dá)式評價MHC II類分子模型與肽配體構(gòu)象的結(jié)合能量，所述的肽配體構(gòu)象需通過掃描上述的主鏈/側(cè)鏈構(gòu)象大數(shù)據(jù)庫根據(jù)經(jīng)驗(yàn)獲得。這樣，通過對每一長度在9-20個氨基酸范圍內(nèi)變化(盡管對于每一次掃描長度是一定的)的可能肽進(jìn)行下述計算，可以掃描蛋白以搜索潛在的T-細(xì)胞表位選擇MHC II類分子及適合于該分子的肽主鏈，將相應(yīng)于所需肽序列的側(cè)鏈移植到其上。對于氨基酸的每一容許構(gòu)象(由上述數(shù)據(jù)庫獲得)，收集與主鏈上特定位點(diǎn)的特定側(cè)鏈相關(guān)的原子身份和原子間距數(shù)據(jù)。沿主鏈對每一側(cè)鏈重復(fù)此過程，利用評分函數(shù)推導(dǎo)肽得分。保留該主鏈的最佳得分，對所選模型的每一容許主鏈重復(fù)該過程。比較所有容許主鏈的得分，最高的得分被認(rèn)為是該MHC II類模型中所需肽的得分。對每一模型用從掃描的蛋白得到的所有可能肽重復(fù)上述過程，列出肽相對于模型的得分。
在本發(fā)明中，用于結(jié)合親和力計算的每種配體都是選自上述肽或蛋白的氨基酸片段。因此所述配體為來自已知序列的肽、多肽或蛋白的長度為約9到20個氨基酸的選定氨基酸鏈。此后術(shù)語“氨基酸”和“殘基”視為等同的術(shù)語。將移植到選自上述主鏈文庫的主鏈上的待檢測肽中的連續(xù)氨基酸形式的配體，通過肽主鏈上C″-α原子坐標(biāo)定位到來自MHC II類分子模型庫的MHC II類分子的結(jié)合裂縫中，并從容許構(gòu)象的數(shù)據(jù)庫中選擇每一側(cè)鏈的容許構(gòu)象。相關(guān)的原子身份和原子間距也可以從這一數(shù)據(jù)庫獲得并用于計算肽結(jié)合分?jǐn)?shù)。將對MHC II類結(jié)合口袋具有高親和力的配體作為侯選者標(biāo)記出來用于定點(diǎn)誘變。在標(biāo)記的配體中(也由此在目的蛋白中)進(jìn)行氨基酸替代，然后用評分函數(shù)重新測定以確定使結(jié)合親和力降低到預(yù)定的閾值以下的變化。這些變化即可引入到目的蛋白中以去除T-細(xì)胞表位。
肽配體與MHC II類分子結(jié)合溝的結(jié)合涉及非共價鍵相互作用，其包括但不限于氫鍵、靜電相互作用、疏水(親脂)相互作用和范德華相互作用。它們被包括在下面將詳細(xì)描述的肽評分函數(shù)中。應(yīng)當(dāng)理解，氫鍵是非共價鍵，其可在極性或帶電的基團(tuán)之間形成，由被兩個其他原子共享的氫原子構(gòu)成。氫供體中的氫帶正電荷，而氫受體帶有部分負(fù)電荷。為肽/蛋白相互作用的目的，氫鍵供體可以是連接氫的氮，或連接在氧或氮上的氫。氫鍵受體原子可以是沒有連接氫的氧、沒有連接氫并具有一或兩個連接的氮或僅有一個連接的硫。某些原子，如連接了氫的氧或亞胺氮(如C＝NH)，既可以是氫受體也可以是氫供體。氫鍵的能量在3-7Kcal/mol，大大強(qiáng)于范德化鍵，但弱于共價鍵。氫鍵具有高度的方向性，且當(dāng)供體原子、氫原子和受體原子共線時最強(qiáng)。靜電鍵是在帶有相反電荷的離子對間形成的，根據(jù)庫侖定律這種相互作用的強(qiáng)度與原子間距離的平方成反比。離子對間的最佳距離是約2.8。在肽/蛋白相互作用中，可在精氨酸、組氨酸或賴氨酸和天冬氨酸或谷氨酸之間形成靜電鍵。該鍵的強(qiáng)度依賴于電離基團(tuán)的pKa和介質(zhì)的介電常數(shù)，盡管其與氫鍵的強(qiáng)度類似。
親脂相互作用是蛋白和肽配體之間發(fā)生的有利疏水-疏水相互作用。這種相互作用通常出現(xiàn)在埋于結(jié)合溝口袋中的肽的疏水性氨基酸側(cè)鏈間，以使它們不暴露在溶劑中。將疏水殘基暴露于溶劑中是非常不利的，因?yàn)橹車娜軇┓肿訉⒈黄仍诒舜碎g形成氫鍵而形成籠狀結(jié)構(gòu)。所致的熵值降低是非常不利的。親脂性原子可以是既非極性又不是氫受體的硫和非極性的碳原子。
范德華鍵是相距3-4的原子間的非特異性的力。它比氫鍵和靜電鍵弱、特異性低。原子周圍的電荷分布隨時間變化，并且在任何瞬間電荷分布均是不對稱的。這種瞬間的電荷不對稱性誘導(dǎo)臨近原子中的類似不對稱性。在范德華接觸距離中所導(dǎo)致的原子之間的吸引力達(dá)到最大，而在約1到2處迅速消失。相反，當(dāng)原子間隔的距離小于此接觸距離時，由于原子外部的電子云重疊使不斷增強(qiáng)的斥力成為主導(dǎo)。盡管與靜電和氫鍵相比，此吸引力相對較弱(約0.6Kcal/mol)，但所述斥力對于決定肽配體是否能與蛋白成功結(jié)合可能非常重要。
在一個實(shí)施方案中，利用Bhm評分函數(shù)(SCORE1方法)評估結(jié)合常數(shù)(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8(3)243-256(1994)，該文獻(xiàn)在此全文引入作為參考)。在另一個實(shí)施方案中，用評分函數(shù)(SCORE2方法)評估結(jié)合親和力作為配體含有T-細(xì)胞表位的指示物(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，12(4)309-323(1998)，該文獻(xiàn)在此全文引入作為參考)。但是上述文獻(xiàn)中描述的Bhm評分函數(shù)是用于評估下述情況中配體對蛋白的結(jié)合親和力的，即已知所述的配體可成功地與所述蛋白結(jié)合，且蛋白/配體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)已解析，這一結(jié)構(gòu)已列于蛋白數(shù)據(jù)庫(″PDB″)中。因此，利用已知的陽性結(jié)合數(shù)據(jù)對評分函數(shù)作了發(fā)展。為了區(qū)分陽性和陰性的結(jié)合體，需向方程中加入排斥項(xiàng)。此外，可通過以成對的方式計算親脂相互作用，而非利用上述Bhm函數(shù)中基于面積的能量項(xiàng)來進(jìn)行更理想的結(jié)合能量評估。因此，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，用經(jīng)修飾的Bhm評分函數(shù)評估結(jié)合能。在經(jīng)修飾的Bhm評分函數(shù)中，在評估蛋白和配體之間的結(jié)合能(ΔGbind)時考慮了下述參數(shù)由于配體的平移和轉(zhuǎn)動熵的整體損失造成的結(jié)合能減低(ΔG0)；理想氫鍵的貢獻(xiàn)(ΔGhb)，其中至少一個配對物是中性的；無擾離子相互作用的貢獻(xiàn)(ΔGionic)；親脂配體原子和親脂受體原子之間的親脂相互作用(ΔGlipo)；由于配體中內(nèi)在自由度的凍結(jié)，即繞每一C-C鍵的旋轉(zhuǎn)自由度降低而造成的結(jié)合能損失(ΔGrot)；蛋白和配體之間相互作用的能量(EvdW)?？紤]到這些項(xiàng)給出等式1(ΔGbind)＝(ΔG0)+(ΔGhb×Nhb)+(ΔGionic×Nionic)+(ΔGlipo×Nlipo)+(ΔGrot+Nrot)+(EvdW)其中N是對于特定項(xiàng)符合的相互作用的數(shù)目，在一個實(shí)施方案中，ΔG0、ΔGhb、ΔGionic、ΔGlipo和ΔGrot是常數(shù)，其值分別為5.4、-4.7、-4.7、-0.17和1.4。
Nhb項(xiàng)依照等式2計算Nhb＝∑h-bondf(ΔR，Δα)×f(Nneighb)×fpcsf(ΔR，Δα)是罰函數(shù)，其解決氫鍵自理想情況的巨大偏離，其依照等式3計算f(ΔR，Δ-α)＝f1(ΔR)×f2(Δα)其中如果ΔR＜＝TOL則f1(ΔR)＝1，或者如果ΔR＜＝0.4+TOL則f1(ΔR)＝1-(ΔR-TOL)/0.4，或者如果ΔR＞0.4+TOL 則f1(ΔR)＝0并且如果Δα＜30°則f2(Δα)＝1，或者如果Δα＜＝80° 則f2(Δα)＝1-(Δα-30)/50，或者如果Δα＞80°則f2(Δα)＝0TOL是氫鍵鍵長中所能允許的偏差＝0.25ΔR是H-O/N氫鍵鍵長與理想值＝1.9的偏差Δα是氫鍵鍵角∠N/O-H..O/N與180°理想值的偏差f(Nneighb)區(qū)分蛋白表面的凹凸部分，并因此賦予口袋中的極性相互作用比蛋白表面的極性相互作用更高的權(quán)重。這一函數(shù)根據(jù)下述等式4計算f(Nneighb)＝(Nneighb/Nneighb，0)α，其中α＝0.5Nneighb為蛋白中與任意給定蛋白原子之間的距離小于5的非氫原子的數(shù)量。
Nneighb，0是常數(shù)＝25fpcs是考慮到每氫鍵的極性接觸表面面積的函數(shù)，由此可以區(qū)分強(qiáng)和弱的氫鍵，其值由下述的標(biāo)準(zhǔn)確定當(dāng)Apolar/NHB＜102時fpcs＝β或當(dāng)Apolar/NHB＞102時fpcs＝1
Apolar是極性蛋白-配體接觸面的大小NHB是氫鍵的數(shù)目β是常數(shù)＝1.2由于假定了相同的幾何相關(guān)性，在實(shí)施經(jīng)修飾的Bhm評分函數(shù)時，離子相互作用的貢獻(xiàn)ΔGionic用與上述有關(guān)氫鍵的類似方式計算。
Nlipo項(xiàng)按下述的等式5計算Nlipo＝∑lLf(rlL)根據(jù)下述標(biāo)準(zhǔn)，對于所有親脂配體原子l和所有親脂蛋白原子L，計算f(rlL)當(dāng)rlL＜＝R1時 f(rlL)＝1當(dāng)R2＜rlL＞R1時 f(rlL)＝(rlL-R1)/(R2-R1)當(dāng)rlL＞＝R2時 f(rlL)＝0其中R1＝rlvdw+rLvdw+0.5R2＝R1+3.0rlvdw是原子l的范德華半徑rLvdw是原子L的范德華半徑Nrot項(xiàng)是氨基酸側(cè)鏈中可旋轉(zhuǎn)的鍵的數(shù)目，其被視為無環(huán)的sp3-sp3及sp3-sp2鍵的數(shù)目。末端-CH3或-NH3的旋轉(zhuǎn)未考慮進(jìn)去。
最終，項(xiàng)Evdw依照如下等式6計算Evdw＝ε1ε2((r1vdw+r2vdw)12/r12-(r1vdw+r2vdw)6/r6)，其中ε1和ε2是取決于原子身份的常數(shù)r1vdw+r2vdw是范德華原子半徑r是原子對間的距離。
關(guān)于式6，在一個實(shí)施方案中，ε1和ε2常數(shù)被賦予如下原子值，分別為C0.245，N0.283，O0.316，S0.316(即分別對于碳、氮、氧和硫原子)。對于式5和6，給予范德華半徑如下原子值，分別為C1.85，N1.75，O1.60，S2.00。
應(yīng)當(dāng)理解上述等式中所有預(yù)定的值和給定的常數(shù)都是在現(xiàn)有的對蛋白配體相互作用的理解局限內(nèi)具體相對于此處所用的計算類型確定的。因此，隨著這種評分函數(shù)的進(jìn)一步精練，這些值和常數(shù)也會因此而改變，任何能在蛋白和配體結(jié)合能的評估方面給出所需結(jié)果的適宜數(shù)值均可使用，而且，其也落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
如上所述，所述的評分函數(shù)應(yīng)用于由上述側(cè)鏈構(gòu)象、原子身份和原子間距數(shù)據(jù)庫中提取的數(shù)據(jù)。為本說明書的目的，該數(shù)據(jù)庫中包含的MHC II類分子數(shù)是42個模型加上4個已解析的結(jié)構(gòu)。從上述描述中可清楚地了解到，本發(fā)明的計算構(gòu)建方法的模塊性質(zhì)意味著，可簡單地添加新的模型，并利用肽主鏈文庫和側(cè)鏈構(gòu)象搜索功能進(jìn)行掃描以創(chuàng)建其它的可通過上述的肽評分函數(shù)處理的數(shù)據(jù)集。這使得被掃描的MHC II類分子庫可以很容易地增加，或者如果可以獲得相關(guān)數(shù)據(jù)，則可以替換結(jié)構(gòu)和相關(guān)數(shù)據(jù)以創(chuàng)建現(xiàn)有等位基因的更精確的模型。
本發(fā)明的預(yù)測方法可以相對于包含大量已通過實(shí)驗(yàn)確定了其對不同MHC II類分子的親和力的肽的數(shù)據(jù)集進(jìn)行校準(zhǔn)。將計算值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相比較，可確定一截斷值，已知該值之上所有經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定的T-細(xì)胞表位都得以正確的預(yù)測。
應(yīng)當(dāng)理解，盡管上述評分函數(shù)與現(xiàn)有的一些復(fù)雜方法相比相對簡單，但計算進(jìn)行得非常迅速。還應(yīng)當(dāng)理解的是，其目的并不在于計算出對接到所選擇的MHC II類蛋白結(jié)合溝內(nèi)的每種肽的真正結(jié)合能本身。根本的目的在于獲得相對的結(jié)合能數(shù)據(jù)以助于根據(jù)所選蛋白的一級結(jié)構(gòu)(即氨基酸序列)預(yù)測T-細(xì)胞表位的定位。相對高的結(jié)合能或結(jié)合能高于選定的閾值意味著在配體中存在T-細(xì)胞表位。然后可以將所述配體進(jìn)行至少一輪氨基酸替代，并再次計算結(jié)合能。由于計算可迅速進(jìn)行，對肽序列的這些操作可在現(xiàn)有成本劃算的計算機(jī)硬件上于程序用戶界面中互動進(jìn)行。由此不需要對計算機(jī)硬件進(jìn)行大量投資。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，也可使用其他軟件達(dá)到相同的目的。特別是可以使用能將配體對接入蛋白結(jié)合位點(diǎn)的更復(fù)雜的軟件，并與能量最小化相結(jié)合。對接軟件的例子包括DOCK(Kuntz等，J.Mol.Biol.，161269-288(1982))，LUDI(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8623-632(1994))和FLEXX(Rarey M.等，ISMB，3300-308(1995))。分子建模和操作軟件的例子包括AMBER(Tripos)和CHARMm(Molecular Simulations Inc.)。使用這些計算方法將嚴(yán)重限制本發(fā)明方法的信息吞吐量，這是由于進(jìn)行必要的計算所需的處理時間導(dǎo)致的。但是可行的方式為，將這些方法作為‘二級篩選’以獲得關(guān)于通過本發(fā)明的方法發(fā)現(xiàn)為‘陽性結(jié)合體’的肽的更精確的肽結(jié)合能計算值。
用于復(fù)雜的分子機(jī)械或分子動力學(xué)計算的處理時間的限制性是由進(jìn)行所述計算的軟件設(shè)計和目前計算機(jī)硬件技術(shù)的限制共同確定的?？梢灶A(yù)期在將來，隨著編寫更高效的代碼和計算機(jī)處理器速度的不斷提高，在更易控制的時間框架內(nèi)進(jìn)行上述計算是可行的。有關(guān)用于大分子的能量函數(shù)的其他信息和有關(guān)在折疊蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)發(fā)生的多種相互作用的考慮可參考下述文獻(xiàn)Brooks，B.R.，等.，J.Comput.Chem.，4187-217(1983)，有關(guān)蛋白-配體一般相互作用的信息參見Dauber-Osguthorpe等，Proteins 4(1)31-47(1988)，這些文獻(xiàn)均全文引入作為參考。其他有用的背景資料也可參見Fasman，G.D.編，Prediction of Protein Structure and the Principles of ProteinConformation，Plenum Press，New York，ISBN0-306 4313-9。
實(shí)施例2使用人幼稚T細(xì)胞增殖試驗(yàn)繪制瀉根素1中表位的方法MHC、肽和T細(xì)胞受體(TCR)的相互作用提供了T細(xì)胞識別的抗原特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。T細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定肽與MHC的結(jié)合和TCR對MHC/肽復(fù)合體的識別。本實(shí)施例的體外T細(xì)胞增殖試驗(yàn)包括刺激含有抗原呈遞細(xì)胞(APC)和T細(xì)胞的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。用合成肽抗原進(jìn)行體外刺激，在某些實(shí)驗(yàn)中使用完整蛋白抗原。用3H-胸苷(3H-Thy)測量刺激的T細(xì)胞增殖并對經(jīng)洗滌的固定細(xì)胞進(jìn)行閃爍計數(shù)估計摻入的3H-Thy的存在。
從國家血液部門(National Blood Service，Addenbrooks Hospital，Cambridge，UK)得到保存時間小于12小時的人血血沉棕黃層。從Amersh-am Pharmacia Biotech(Amersham，UK)得到菲可帕克(Ficoll-paque)。含有L-谷氨酰胺、50μg/ml鏈霉素、10μg/ml慶大霉素和0.1％人血清白蛋白的用于培養(yǎng)原代人淋巴細(xì)胞的無血清AIM V培養(yǎng)基得自Gibco-BRL(Paisley，UK)。合成肽得自Eurosequence(Groningen，荷蘭)和BabrahamTechnix(Cambridge，UK)。
對血沉棕黃層輕微離心從血漿和血小板中分離出紅血球和白血球。除去并扔掉頂層部分(含有血漿和血小板)。在磷酸鹽緩沖液(PBS)中1∶1稀釋紅血球和白血球并鋪在15ml菲可帕克(Amersham Pharmacia，AmershamUK)上。根據(jù)生產(chǎn)商推薦的條件進(jìn)行離心并從血清+PBS/菲可帕克界面收獲PBMC。用PBS(1∶1)混合PBMC并通過離心收集。除去并扔掉上清液，將PBMC沉淀重新懸浮在50ml PBS中。通過離心再次沉淀細(xì)胞并拋棄PBS上清液。用50ml AIM V培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞并在此時計數(shù)并用錐蟲藍(lán)染料排除估計存活率。再次離心收集細(xì)胞并拋棄上清液。細(xì)胞重新懸浮以低溫保藏，密度為3×107/ml。保藏培養(yǎng)基為90％(v/v)熱失活的AB人血清(Sigma，Poole，UK)和10％(v/v)DMSO(Sigma，Poole，UK)。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受調(diào)節(jié)的冰凍容器(Sigma)并且在轉(zhuǎn)移到液氮以長期保存前將其置于-70℃過夜。當(dāng)需要使用時，在37℃水浴中快速解凍然后轉(zhuǎn)移到10ml預(yù)熱的AIMV培養(yǎng)基。
在96孔平底板(PBMC密度為2×105PBMC每孔)中用蛋白和肽抗原刺激PBMC。在37℃下將PBMC孵育7天后用3H-Thy(Amersham-Pharmacia，Amersham，UK)脈沖。對于本研究，可以產(chǎn)生并使用以12個氨基酸重疊并覆蓋瀉根素1全序列的合成肽(15聚體)。肽標(biāo)識編號(ID#)和序列如圖2。每種肽都單獨(dú)地針對從21個未接觸抗原供體中分離的PBMC進(jìn)行篩選。在每個供體測定中使用先前已經(jīng)顯示具有免疫原性的兩種對照肽和一種強(qiáng)的非記憶抗原KLH。
對照抗原如下
將肽溶解于DMSO中使其終濃度為10mM，然后將這些貯存液在AIM V培養(yǎng)基中稀釋到原來的1/500(終濃度20μM)。向平底96孔板中加入肽使其終濃度為2和20μM(體積為100μl)。通過錐蟲藍(lán)染料排除估計解凍的PBMC的存活率。然后將細(xì)胞重新懸浮(密度為2×106個細(xì)胞/ml)，向每個含有肽的孔中移入100μl(2×105個PBMC/孔)。在每個肽濃度下測定一式三份的孔培養(yǎng)物。在5％CO2、37℃的潮濕空氣中孵育平板7天。用1μCi3H-Thy/孔脈沖細(xì)胞18-21小時后收獲到過濾墊上。用Wallac微量培養(yǎng)板β頂層平板計數(shù)器(Perkin Elmer)或類似儀器測定CPM值。結(jié)果表達(dá)為刺激指數(shù)，用受試肽的增殖值(如放射性的每分鐘計數(shù))除以未接觸受試肽的細(xì)胞所測定的值進(jìn)行確定。
本研究已揭示了對來自至少一個供體的T細(xì)胞可引起明顯增殖反應(yīng)(即SI＞2.0)的32個肽序列。在這組肽中，確定了進(jìn)一步的亞組肽，所述亞組肽可在2個或更多分別的供體樣本中引起顯著的增殖反應(yīng)，并且這些反應(yīng)中的一些反應(yīng)幅度確實(shí)顯著高于SI＝2.0。使用T細(xì)胞增殖試驗(yàn)對瀉根素1序列中的T細(xì)胞表位進(jìn)行繪制，結(jié)果確定了5個主要的免疫原性區(qū)，包括肽ID#16-18，30，38-41，46-50和60-64。這些肽中的每一肽對制備自2個或更多供體樣本的PBMC均顯示出刺激指數(shù)＞2.0。圖5的A-E顯示了在所選擇的PBMC供體樣本中單獨(dú)的肽引起SI反應(yīng)的代表性直方圖?？傊畬@些圖中所示的組進(jìn)行選擇以顯示對來自每一表位區(qū)R1-R5的肽產(chǎn)生陽性反應(yīng)的實(shí)例。使用市售的試劑體系(Dynal，Wirral，UK)對所有PBMC樣本的組織型別進(jìn)行了測試。測試按照供應(yīng)商推薦的方法和標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充試劑以及瓊脂糖電泳體系進(jìn)行。在20個受試供體中DRB1等位基因的同種異型覆蓋率為70％。在21個不同的PBMC供體制品中，10個對包括在表位區(qū)R1-R5的肽具反應(yīng)性。每一反應(yīng)性供體樣本的同種異型特異性示于表1。
表1反應(yīng)性供體樣本的MHC同種異型
實(shí)施例3設(shè)計具有改進(jìn)的免疫原性特性的經(jīng)修飾序列使用實(shí)施例1的方法分析表位區(qū)R1、R2、R3、R4和R5。該體系使得可預(yù)測包含在通過生物學(xué)方法所檢測的表位區(qū)中的特定MHC配體并提供給定MHC II類配體與特定MHC同種異型相互作用能力的″分值″。MHC配體的同種異型限制性模式可使用同種異型限制性圖描述，后附的圖6-10顯示了每一表位區(qū)R1-R5。
該分析延及在每一表位R1-R5中考慮序列修飾。測試序列變體結(jié)合MHC II類的持續(xù)能力，并且如果有的話測試它們的結(jié)合分值。定義了多個可實(shí)現(xiàn)去除與受試的大多數(shù)MHC同種異型結(jié)合的MHC II類的氨基酸替代。對所確定的特定替代進(jìn)一步測試它們與瀉根素分子結(jié)構(gòu)模式的相容性。對野生型序列所選擇的殘基處設(shè)計的突變檢測其立體沖突、氫鍵形成、疏水相互作用及其在結(jié)構(gòu)中的總體相容性。排除產(chǎn)生立體沖突的替代。當(dāng)其側(cè)鏈采用與原始?xì)埢嗨频臉?gòu)型(旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)時，則考慮該替代為可接受的。如果有一個以上的替代滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，則優(yōu)選的殘基為與相鄰的側(cè)鏈或骨架原子可潛在地形成氫鍵和/或形成有利的疏水接觸或其他聯(lián)系的殘基。上述步驟使用Swiss Prot Deep View v3.7交互進(jìn)行[Guex，N.和Peitsch，M.C.(1997)Electrophoresis 182714-2723]。對每一表位區(qū)R1-R5該方法產(chǎn)生優(yōu)選的替代集合。對所述替代集合進(jìn)行匯編產(chǎn)生在式1中描述的結(jié)構(gòu)。所有的替代被證實(shí)為導(dǎo)致每一表位區(qū)R1-R5中MHC II類配體的去除。對式1中除了給出最優(yōu)選的替代外，還給出了備選氨基酸殘基的替代。
對于表位區(qū)R3，設(shè)計了可任選將在野生型構(gòu)型中亮氨酸115保留的備選替代集合。認(rèn)為亮氨酸115殘基對于形成瀉根素1酶的部分底物結(jié)合裂具有結(jié)構(gòu)重要性。涉及L115改變的優(yōu)選替代集合包含L115A、I122A、I126A、L130A、L133F和I137A。保留L115的備選替代集合包含A118T、G120H、K121S和R123T。這些改變是L115A和I122A雙位點(diǎn)改變的備選。
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)修飾的分子，其具有瀉根素1的生物學(xué)活性，且當(dāng)其在個體體內(nèi)應(yīng)用時基本上無免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物學(xué)活性但未經(jīng)修飾的分子，其中所述免疫原性喪失是通過從原始的未經(jīng)修飾的分子中去除一個或多個T-細(xì)胞表位而實(shí)現(xiàn)的，并且所述T-細(xì)胞表位是MHC II類配體或經(jīng)呈遞在II類分子上后顯示出刺激或結(jié)合T-細(xì)胞的能力的肽序列。
2.權(quán)利要求1的瀉根素1分子，其中通過替換1-9個氨基酸殘基實(shí)現(xiàn)所述T細(xì)胞表位的去除。
3.權(quán)利要求1或2的瀉根素1分子，其中所述T細(xì)胞表位為選自如圖1所示的肽序列。
4.權(quán)利要求1或2的瀉根素1分子，其中所述T細(xì)胞表位位于野生型瀉根素1序列的稱為R1-R5的連續(xù)氨基酸殘基串中，所述野生型瀉根素1序列的R1-R5包含殘基46-66；88-102；112-135；136-162和178-204。
5.權(quán)利要求4的瀉根素1分子，其中所述殘基串具有下列序列(a)ITTLYYYTASSAASALLVLIQSTAESA(R1)，(b)ATEAAKFVFKDAKKK(R2)，(c)ERLQTAAGKIRENIPLGLPALDSA(R3)，(d)ITTLYYYTASSAASALLVLIQSTAESA(R4)，(e)ATISLENNWSALSKQIQIAST(R5)
6.權(quán)利要求5的瀉根素1分子，其中氨基酸殘基的替換是在任一R1-R5殘基串中至少9個連續(xù)殘基的亞串中實(shí)施的。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6的瀉根素1分子，其與任一R1-R5肽序列串的氨基酸同一性大于80％。
8.權(quán)利要求7的瀉根素1分子，其與任一R1-R5肽序列串的氨基酸同一性大于90％。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的瀉根素1分子，其包含以下序列DVSFRLSGATTTSYGVFIKNLREALPYERKVYNIPLLRSSISGSGRYX1X2LX3LTX4X5ADETX6SVAX7DX8TNVYIMGYLAGDVSYFFNEASATEAAKX9X10FKDAKKKX11TLPYSGNYERX12QTX13AX14X15X16X17ENX18PLGX19PAX20DSAX21TTX22YX23X24TASSAASAX25X26X27X28IQSTAESARYKFIEQQIGKRVDKTFLPSLATX29SX30ENNWSAX31SX32QX33QX34ASTNNGQFESPVVLIDGNNQRVSITNASARVVTSNIALLLNRNNIAAIGEDISMTLIGFEHGLYGI其中X1為A，G或P；X2為M，A，G，P或I；X3為A，G或P；X4為P或Y；X5為T或S；X6為P；X7為A，P或G；X8為A，P或G；X9為A，P，G，H，D，E，N，Q，K，R，S或T；X10為A，P或G；X11為A，P或G；X12為A，P，S，T，H或K；X13為T；X14為H；X15為S；X16為A，S，T，P，N，D，E，G，H，K或Q；X17為T；或P；X19為A，I，F(xiàn)，G，M，P，V，W或Y；X20為F，P或W；X21為A，P或G；X22為G，A或P；X23為G，A或P；X24為A，P或G；X25為A，P，G，S或T；X26為A，I，M，S，T，P或G；X27為A，G或P；X28為S，A，G，P，T，H，D，N，Q，K或R；X29為T，A，G，S，P，H，K，R，D，E，N或Q；X30為A，G，S，T，P，K，R，H，D，E，N或Q；X31為Q；X32為H，D，E，F(xiàn)，L，N，P，S，W或Y；X33為T，A，G，P，D，E，H，K，R，N，Q，S或T；且X34為D，且同時排除X1＝T，X2＝L，X3＝H，X4＝N，X5＝Y(jié)，X6＝I，X7＝V，X8＝V，X9＝F，X10＝V，X11＝V，X12＝L，X13＝A，X14＝G，X15＝K，X16＝I，X17＝R，X18＝I，X19＝L，X20＝L，X21＝I，X22＝L，X23＝Y(jié)，X24＝Y(jié)，X25＝L，X26＝L，X27＝V，X28＝L，X29＝I，X30＝L，X31＝L，X32＝K，X33＝I和X34＝I。
10.權(quán)利要求9的瀉根素1分子，其中X1為A，X2為M，X3為A，X4為P，X5為T，X6為P，X7為A，X8為A，X9為A，X10為A，X11為A，X12為A，X13為T，X14為H，X15為S，X16為A，X17為T，X18為A，X19為A，X20為F，X21為A，X22為G，X23為G，X24為A，X25為A，X26為A，X27為A，X28為S，X29is T，X30為A，X31為Q，X32為H，X33為T且X34為D。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)修飾瀉根素1分子，其中所述分子當(dāng)在生物學(xué)試驗(yàn)中以完整蛋白測試誘導(dǎo)人T細(xì)胞的細(xì)胞增殖時，平行地使用來自同一供體的細(xì)胞進(jìn)行測試，所顯示的刺激指數(shù)(SI)小于親本的未經(jīng)修飾分子，并小于2，其中所述刺激指數(shù)視為用所述蛋白刺激后的細(xì)胞增殖值并除以不接受所述蛋白的對照細(xì)胞的細(xì)胞增殖值，且其中細(xì)胞增殖是使用任一合適的方法測定的。
12.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)修飾瀉根素1分子，并任選地包含可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
13.DNA分子，其編碼權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的任一經(jīng)修飾瀉根素1分子。
14.為野生型瀉根素1的一部分并包含一個或多個T細(xì)胞表位的肽，其中所述T-細(xì)胞表位是MHC II類配體或經(jīng)呈遞在II類分子上后顯示出刺激或結(jié)合T-細(xì)胞的能力的肽序列；所述肽選自(a)＝RYTLLHLTNYADETISVAVDV(R1)，(b)＝ATEAAKFVFKDAKKK(R2)，(c)＝ERLQTAAGKIRENIPLGLPALDSA(R3)，(d)＝ITTLYYYTASSAASALLVLIQSTAESA(R4)，(e)＝ATISLENNWSALSKQIQIAST(R5)。
15.權(quán)利要求14的肽，其在人T細(xì)胞的細(xì)胞增殖的生物學(xué)試驗(yàn)中具有的刺激指數(shù)(SI)＞1.8，其中所述刺激指數(shù)視為用肽刺激后的細(xì)胞增殖值并除以不接受肽的對照細(xì)胞的細(xì)胞增殖值，且其中細(xì)胞增殖是使用任一合適的方法測定的。
16.圖1所述肽序列或權(quán)利要求14或15的至少9個連續(xù)氨基酸殘基的肽序列的用途，用于制備當(dāng)在體內(nèi)應(yīng)用時基本上無免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物學(xué)活性但未經(jīng)修飾分子的瀉根素1分子或其變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及瀉根素1的修飾，以產(chǎn)生在體內(nèi)使用時基本無免疫原性或者比任一未經(jīng)修飾的相應(yīng)蛋白的免疫原性要低的瀉根素1蛋白。本發(fā)明還涉及源自所述未經(jīng)修飾蛋白的T細(xì)胞表位肽，由其可產(chǎn)生免疫原性降低的經(jīng)修飾瀉根素1變體。
文檔編號A61P43/00GK1658905SQ03813443
公開日2005年8月24日 申請日期2003年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月11日
發(fā)明者M·貝克, F·J·卡爾 申請人:默克專利有限公司