專(zhuān)利名稱(chēng)：用于基因修飾非人類(lèi)動(dòng)物的新載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及非人類(lèi)動(dòng)物的基因修飾領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在過(guò)去的二十年間，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行有效的基因修飾，特別對(duì)較高等的哺乳動(dòng)物進(jìn)行基因修飾，已成為生物科技領(lǐng)域研究者的主要目標(biāo)。動(dòng)物的基因修飾，不僅可增進(jìn)人類(lèi)對(duì)多細(xì)胞生物之基因及基因功能的了解，也可應(yīng)用于生物農(nóng)業(yè)之中。這類(lèi)應(yīng)用的實(shí)施例包括生產(chǎn)具有所需特征的家畜，例如較快的生長(zhǎng)速率、在乳汁中生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)，或甚至由動(dòng)物生產(chǎn)用于動(dòng)物至人類(lèi)的、可用于外源性移植(xenotransplantation)的、更“人類(lèi)化”的器官。
現(xiàn)有修飾基因組的技術(shù)包括將外來(lái)DNA顯微注射至受精卵的前核(pronuclei)，經(jīng)由脂質(zhì)基底的試劑、電穿孔或病毒感染，將外來(lái)DNA在生物體外傳送至胚胎干細(xì)胞，或在生物體內(nèi)傳送至葉細(xì)胞(blastomere)中。然而除老鼠之外，目前所發(fā)表的報(bào)告在較高等或較大動(dòng)物上的成功仍屬有限，例如曾有報(bào)告指出顯微注射技術(shù)的要求非常苛刻，要求使用高靈敏度及昂貴的設(shè)備；也曾報(bào)道顯微注射的胚胎存活率極低(Wall R.J.等人(1992)，Making Transgenic Livestock，Genetic Engineering on a Large Scale，Journal of Cellular Biochemistry，Vo1.49，pp.133-120)。這使得該領(lǐng)域的研究者去尋找替代的、較容易將基因傳送入細(xì)胞的方法。
1989年，Lavitrano，M.等人報(bào)道將外來(lái)DNA在老鼠精細(xì)胞中進(jìn)行簡(jiǎn)單地培養(yǎng)，并在體外有效受精，可生產(chǎn)出基因上修飾的老鼠(Lavitrano，M.等(1989)，Sperm Cells as Vectors for IntroducingForeign DNA into Eggs-Genetic Transformation of Mice，Cell，Vol.57，pp.717-723)。其特征相當(dāng)于生物技術(shù)中之“冷融合”，該報(bào)告在此領(lǐng)域中產(chǎn)生相當(dāng)大的鼓舞(Birnstiel，M.等(1989)，Dangerous LiaisonsSpermatozoa as Natural Vectors for Foreign DNA，Cell，Vol.57，pp.701-702)。然而，據(jù)報(bào)道，本領(lǐng)域的熟練人員至今仍對(duì)Lavitrano的報(bào)告有所質(zhì)疑，因?yàn)樵S多該領(lǐng)域的研究者報(bào)道無(wú)法重復(fù)該實(shí)驗(yàn)(Brinster，R.等(1989)，No Simple Solution for Making TransgenicMice，Cell，Vol.59，pp.239-241；Smith，K.(1999)，Sperm Cell MediatedTransgenesisA Review，Animal Biotechnology，Vol.10(1&2)，PP.1-13)。
過(guò)去十年間，對(duì)于使用精子細(xì)胞作為將基因轉(zhuǎn)移至動(dòng)物媒介載體的探索仍持續(xù)進(jìn)行。研究者已闡明精子細(xì)胞具有將外來(lái)DNA內(nèi)化(internalize)的固有能力(Francolini，M.等(1993)，Evidence forNuclear Internalization of Exogenous DNA into Mammalian Sperm Cells，Mol.Reprod.Devel.，Vol.34，PP.133-139)。但存在于精液中的某些抑制因子可抑制這種接收DNA的能力(Lavitrano，M.，等(1992)，TheInteraction Between Exogenous DNA and Sperm Cells，Mol.Reprod.Devel.，Vo131，pp.161-169)。此外，導(dǎo)入精細(xì)胞的外來(lái)DNA也可能經(jīng)歷大規(guī)模的DNA重排，因?yàn)樵诔墒斓木?xì)胞中，外來(lái)DNA的內(nèi)化可活化這些細(xì)胞內(nèi)某些內(nèi)源性核酸酶(Maione，B.等(1997)，Activation of Endogenous Nucleases in Mature Sperm Cells uponInteraction with Exogenous DNA，DNA and Cell Biology，Vol.16，pp.1087-1097)。這種重排可使利用此技術(shù)的基因上修飾的動(dòng)物變?yōu)闊o(wú)用。
其它以精細(xì)胞作為載體的工作集中在使用脂質(zhì)基底的試劑或電穿孔法將外來(lái)DNA傳送入精細(xì)胞中(Smith，同前；Rottamn R.等(1996)，Liposome-mediated Gene Transfer via Sperm Cells.HighTransfer Efficiency and Persi stence of Transgenes by Use of Liposomesand Sperm Cells and a Murine Amplification Element，Journal of AnimalBreeding and Genetics，Vol.113，pp.401-411；PCT Pubications WO99/42569、WO 99/40213及WO 97/11597)。這種方法可能也會(huì)遭遇DNA內(nèi)化以及暴露在可引起所導(dǎo)入的外來(lái)DNA重排的核酸酶中的問(wèn)題。此外，脂質(zhì)基底的試劑通常具有毒性，且電穿孔需要大量的試驗(yàn)以免精細(xì)胞的死亡或喪失活動(dòng)力。其它技術(shù)集中于利用重組病毒的感染，如PCT Publication WO 99/38991中所述，或利用具有微載體(micro-carrier)的“基因槍”，如PCT Publication WO93/24626中所述，以將外來(lái)的DNA導(dǎo)入精細(xì)胞中。這類(lèi)技術(shù)可能在技術(shù)本身上具有挑戰(zhàn)性，而且也可能影響精細(xì)胞的存活力及活動(dòng)力；其同樣也可能遭遇DNA內(nèi)化以及暴露在可引起所導(dǎo)入的外來(lái)DNA重排的核酸酶中的問(wèn)題。
自1989年以來(lái)，研究者發(fā)表報(bào)告，論述在不同動(dòng)物中使用精細(xì)胞作為載體，這些動(dòng)物包括昆蟲(chóng)、海洋動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)及哺乳類(lèi)(Smith，同前)。然而，很少有人報(bào)導(dǎo)此類(lèi)基因修飾是在活的成熟幼體中觀測(cè)到的(Smith，同前)。更有問(wèn)題的事實(shí)是一些報(bào)告僅使用PCR分析來(lái)確認(rèn)細(xì)胞中外來(lái)DNA的存在。這些報(bào)告整理于Gandolfi，F(xiàn).的表一中((1998)，Spermatozoa，DNA Binding and TransgenicAnimals，Transgenic Research，Vol.7，PP.147-155)。因?yàn)镻CR不能區(qū)分外來(lái)基因的傳送是通過(guò)附加體(episome)還是通過(guò)染色體DNA，Gandolfi質(zhì)疑這些報(bào)告的價(jià)值，聲稱(chēng)其“展開(kāi)了一場(chǎng)關(guān)于合理評(píng)價(jià)某些報(bào)告所描述的結(jié)果的重要辯論”(Gandolfi，同前)。附加體的傳送不如染色體傳送受歡迎，因附加體可能于隨后的細(xì)胞分裂中喪失，且所需要的基因修飾的效果可能無(wú)法在成年動(dòng)物中得以表達(dá)。
由于基因修飾動(dòng)物特別是高等哺乳動(dòng)物的簡(jiǎn)易、無(wú)毒及有效的方式，可大幅度改善該領(lǐng)域，因而需要一種使用精細(xì)胞傳送基因至動(dòng)物的新方式。
發(fā)明的概述本發(fā)明是關(guān)于一種載體及其在生產(chǎn)基因上修飾的動(dòng)物及細(xì)胞的用途。一方面，本發(fā)明涉及一種載體，其含有一個(gè)精細(xì)胞及一個(gè)或多個(gè)通過(guò)一個(gè)或多個(gè)非脂質(zhì)體基底的連接子結(jié)合于精細(xì)胞的聚核苷酸分子。精細(xì)胞可以是任何動(dòng)物的精細(xì)胞，優(yōu)選非人類(lèi)動(dòng)物的精細(xì)胞。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，該一個(gè)或多個(gè)聚核苷酸分子可以對(duì)能將預(yù)期特征賦予細(xì)胞或動(dòng)物的基因產(chǎn)物進(jìn)行編碼(encode)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的連接子是一種蛋白質(zhì)或多肽，優(yōu)選為具有精子專(zhuān)一性、如可與精細(xì)胞之外表面結(jié)合的抗體。連接子優(yōu)選借助離子作用力與一個(gè)或多個(gè)聚核苷酸分子發(fā)生相互作用。此類(lèi)相互作用亦可借助不同的分子間相互作用來(lái)進(jìn)行，包括使用另一或第二連接子。精子、連接子和一個(gè)或多個(gè)聚核苷酸的結(jié)合(association)亦可發(fā)生在生物體外或生物體內(nèi)。
另一方面，在本發(fā)明中，可以由具有上述載體的動(dòng)物卵細(xì)胞受精而衍生出基因上修飾的細(xì)胞或動(dòng)物。受精可發(fā)生在生物體外或生物體內(nèi)。在一優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，基因修飾的發(fā)生是因聚核苷酸分子全部或部分地整合(integrating)至細(xì)胞或動(dòng)物的基因組中。本發(fā)明的又一方面涉及衍生(derive)自此類(lèi)基因上修飾的動(dòng)物或其后代的細(xì)胞如精細(xì)胞或卵細(xì)胞以及細(xì)胞系。
再一方面，在本發(fā)明中，通過(guò)利用上述精子載體得到的基因上修飾的動(dòng)物擁有某些所需特征。這些特征實(shí)施例包括較快的生長(zhǎng)速率、抗疾病或抗病原體能力、在乳汁中某些蛋白質(zhì)的高產(chǎn)率以及適合動(dòng)物至人類(lèi)外源性移植的器官。
圖示的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是本發(fā)明一具體實(shí)施方案的基本步驟的圖形表示。
圖2所示為本發(fā)明一具體實(shí)施方案中，將精子專(zhuān)一性的(sperm-specific)抗體結(jié)合至老鼠精細(xì)胞的流動(dòng)細(xì)胞計(jì)結(jié)果。
圖3所示為本發(fā)明一具體實(shí)施方案中，將精子專(zhuān)一性的抗體結(jié)合至豬的精細(xì)胞的流動(dòng)細(xì)胞計(jì)結(jié)果。
圖4所示為本發(fā)明一具體實(shí)施方案中，將精子專(zhuān)一性的抗體結(jié)合至牛的精細(xì)胞的流動(dòng)細(xì)胞計(jì)結(jié)果。
圖5所示為本發(fā)明一具體實(shí)施方案中，將精子專(zhuān)一性的抗體結(jié)合至雞的精細(xì)胞的流動(dòng)細(xì)胞計(jì)結(jié)果。
圖6所示為本發(fā)明一具體實(shí)施方案中，將精子專(zhuān)一性的抗體結(jié)合至山羊的精細(xì)胞的流動(dòng)細(xì)胞計(jì)結(jié)果。
圖7所示為本發(fā)明一具體實(shí)施方案中，將精子專(zhuān)一性的抗體結(jié)合至綿羊的精細(xì)胞的流動(dòng)細(xì)胞計(jì)結(jié)果。
圖8所示為pCMV-β的質(zhì)粒圖譜。
圖9所示為結(jié)合至pCMV-β質(zhì)粒的、精子專(zhuān)一性抗體的瓊脂糖膠體分析。
圖10所示為用于檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明一具體實(shí)施方案進(jìn)行基因修飾的老鼠胚胎所分離出的基因組DNA中pCMV-β序列的PCR分析結(jié)果。
圖11所示為用于檢測(cè)在老鼠尾巴基因組DNA中的B型肝炎表面抗原基因序列并根據(jù)本發(fā)明一具體實(shí)施方案將此基因序列整合入老鼠染色體的DNA印跡法(southern-blot)分析結(jié)果。
圖12所示為pSEAP-2對(duì)照組的質(zhì)粒圖譜。
圖13所示為用于檢測(cè)由根據(jù)本發(fā)明一具體實(shí)施方案的基因上修飾的豬的尾巴組織所分離的基因組DNA中的pSEAP-2對(duì)照組質(zhì)粒序列的DNA印跡分析結(jié)果。
圖14所示為由四只基因上修飾的豬、根據(jù)圖13色帶的密度測(cè)定強(qiáng)度所得的pSEAP2對(duì)照組質(zhì)粒的復(fù)制數(shù)。
圖15及16所示為根據(jù)本發(fā)明一具體實(shí)施方案的基因上修飾的豬的血清中所分泌的堿性磷酸酶的酶分析結(jié)果。
發(fā)明的一般性說(shuō)明一般而言，圖1是顯示涉及利用本發(fā)明一具體實(shí)施方案，使用一種精子載體對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物進(jìn)行基因上修飾的基本步驟。簡(jiǎn)言之，以本領(lǐng)域已知的方法收集動(dòng)物精子細(xì)胞10，或由商業(yè)來(lái)源例如于Ohio，West Manchester的Birchwood Genetics購(gòu)得動(dòng)物精子細(xì)胞10，并與連接子20結(jié)合在一起。此類(lèi)連接子優(yōu)選為抗體或IgG、IgA或IgM型的免疫球蛋白，但其亦可為其它化合物，例如肽類(lèi)、醣蛋白、碳水化合物或其它化合物連接子。此類(lèi)連接子通過(guò)不同的分子相互作用結(jié)合或連接至精細(xì)胞的外表面，這些分子間相互作用可以是離子相互作用、共價(jià)鍵、范德瓦力或配體-受體相互作用等。之后，環(huán)形或線(xiàn)形DNA分子30也是通過(guò)不同的分子相互作用結(jié)合或連接到精子-連接子復(fù)合物的連接子上，如通過(guò)離子相互作用、共價(jià)鍵、范德瓦力或配體-受體相互作用等。這些DNA分子可能能為某些基因產(chǎn)物進(jìn)行編碼，但其亦可能為斷裂的基因，其與內(nèi)源性(endogenous)基因同源，可再結(jié)合至染色體而淘汰一種基因。所生成的精子-連接子-DNA復(fù)合物40可再用于進(jìn)行生物體外或生物體內(nèi)的受精。隨著受精，該DNA可導(dǎo)入受精卵50及胚胎60中并可整合插入染色體內(nèi)，成為動(dòng)物或細(xì)胞的基因物質(zhì)的一部份。
或者，該精子-連接子-DNA復(fù)合物的結(jié)合、偶合、連結(jié)、連接或相連亦可在生物體內(nèi)完成。首先，可在生物體外將連接子與DNA偶合或結(jié)合在一起。之后，將此連接子-DNA復(fù)合物直接或間接注入雄性動(dòng)物的睪丸中。PCT Publications WO 99/40213及WO 97/11597公開(kāi)了將DNA注入睪丸的步驟，此處將之列為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)。
連接子-DNA復(fù)合物的一個(gè)實(shí)例是連接于DNA分子的抗體，該抗體可專(zhuān)一性地辨識(shí)精細(xì)胞表面上某些抗原決定部位(epitope)。因?yàn)槁鉊NA的酸性特征，故其可與具有堿性或帶正電性的抗體進(jìn)行離子連接、結(jié)合或偶合。然而，DNA-連接子的相互作用不限于離子作用力。該復(fù)合物亦可借助本領(lǐng)域中熟知的方法，用UV光進(jìn)行交聯(lián)而形成共價(jià)鍵。DNA及連接子亦可借助本領(lǐng)域中熟知的方法加以修飾。例如，所述的DNA可借助于PCR反應(yīng)中添加生物素化的去氧核苷酸而予以生物素化；所述的抗體可經(jīng)修飾或購(gòu)買(mǎi)與鏈霉抗生物素蛋白相連者，其與DNA上的生物素緊密結(jié)合；或經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白修飾且可辨識(shí)第一個(gè)抗體的第二抗體，亦可作為經(jīng)修飾的DNA與第一連接子之間的第二連接子。
若將DNA-連接子復(fù)合物注入動(dòng)物的睪丸中，則此復(fù)合物可尋得精子細(xì)胞并與之結(jié)合。接著可經(jīng)由雄性或雌性的自然交配或借助收集到的精細(xì)胞對(duì)雌體進(jìn)行人工受精而在生物體內(nèi)發(fā)生受精。收集到的精細(xì)胞也可使用生物體外的受精技術(shù)，其本領(lǐng)域中已經(jīng)熟知。另一方面，若在生物體外將精子-連接子-DNA復(fù)合物結(jié)合成一體，則可借助生物體外的受精技術(shù)完成受精。受精卵及所產(chǎn)生的胚胎可再移植至代理動(dòng)物孕母使之發(fā)育。或者，以已熟知的人工授精法或?qū)⒕?連接子-DNA復(fù)合物直接注入雌性動(dòng)物的輸卵管中，亦可在生物體內(nèi)完成受精。
一般而言，經(jīng)修飾的動(dòng)物可提供許多用途。家畜、家禽或魚(yú)類(lèi)可嵌入可編碼成長(zhǎng)激素的基因，以使之較正常者生長(zhǎng)更快；或其亦可嵌入促生長(zhǎng)素基因，以增加肌肉生長(zhǎng)并減少脂肪組織(Pursel，V.G等人(1089)Genetic Engineering of Livestock，Science，Vol.224，PP.1281-1288；Etherton，T.D.等(1993)Mechanism by which SomatotropinDecreases Adipose Tissue Growth，American Journal of ClinicalNutrition，VOL.58(Supp.)，pp.287S-295S)。插入的基因如可促進(jìn)免疫系統(tǒng)的干擾素，或其它基因如可對(duì)病毒、朊病毒(prion)或細(xì)菌性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因，亦可使此類(lèi)家畜、家禽或魚(yú)類(lèi)具有疾病抗性或病原體抗性。感染性病原體的實(shí)例包括沙門(mén)氏菌、流行性感冒病毒、瘋牛病的朊病毒蛋白等。或者，導(dǎo)入可對(duì)反義RNA分子進(jìn)行編碼的DNA，而這些反義RNA分子可互補(bǔ)于此類(lèi)病毒、朊病毒或細(xì)菌的RNAs，從而亦可抑制來(lái)自這些RNA的蛋白質(zhì)翻譯和生產(chǎn)，由此可限制感染性病原體的生長(zhǎng)和散播。
此外，在生產(chǎn)制衣原料如毛及絲的動(dòng)物中，包括昆蟲(chóng)例如蠶，若插入能產(chǎn)生限制速率的氨基酸的生化酶的基因，則可增加此類(lèi)原料的產(chǎn)率。例如，對(duì)于綿羊，半胱氨酸會(huì)限制羊毛的產(chǎn)率。插入可為絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶及O-乙酰絲氨酸巰基酶進(jìn)行編碼的細(xì)菌性基因，可增加絲氨酸及乙酰-CoA轉(zhuǎn)換成半胱氨酸的轉(zhuǎn)換率，從而增加羊毛的產(chǎn)量(Ward，K.(1991)，The Application of Transgenic Techniques for theImprovement of Domestic Animal Productivity，Current Opinion inBiotechnology，Vol.2，pp.834-839)。
而且，此類(lèi)基因修飾的動(dòng)物亦可在其乳汁中生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)，例如胰島素、生長(zhǎng)激素、干擾素、紅血球生成素、菌落刺激因子(GM-CSF)、t-PA或因子VIII，其通過(guò)將此類(lèi)蛋白質(zhì)的基因，與來(lái)自乳腺專(zhuān)一性基因的啟動(dòng)子如綿羊的β-乳球蛋白質(zhì)、老鼠的乳清酸蛋白或牛的α-S1酪蛋白質(zhì)相連接而實(shí)現(xiàn)(同上)。另一方面，動(dòng)物的乳汁亦可以通過(guò)添加人類(lèi)化的蛋白質(zhì)而得以強(qiáng)化，例如人類(lèi)乳鐵素，其可增強(qiáng)嬰兒的腸內(nèi)鐵質(zhì)吸收(Lonnerdal，B.(1996)，RecombinantHuman Milk Proteins-An Opportunity and a Challenge，AmericanJournal of Clinical Nutrition，Vol.63，pp.622-626)。在動(dòng)物至人類(lèi)的外源性移植中，通過(guò)利用如人類(lèi)蛻變加速因子，基因修飾的豬可成為更“人類(lèi)化”的器官的來(lái)源(Cozzi，E.等(1994)，Expression of HumanDecay Accelerating Factor in Transgenics Pigs，TransplantationProceedings，Vol.26，pp.1402-1403)。
上述引用的文件均作為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)。
下列實(shí)施例表明本發(fā)明者已利用上述的精子載體生產(chǎn)許多基因上修飾的動(dòng)物。所使用的分子遺傳、流動(dòng)細(xì)胞計(jì)、抗體生產(chǎn)、雜交瘤技術(shù)、生物體外受精、胚胎操作及人工授精的方法，雖未在本公開(kāi)明確說(shuō)明，但已在科技文獻(xiàn)中有充分的報(bào)道。此類(lèi)方法是本領(lǐng)域者人員所熟知的。實(shí)施例1本實(shí)施例是說(shuō)明對(duì)精細(xì)胞具有專(zhuān)一性的抗體的制備。
將收集自雄鼠的精細(xì)胞注射回老鼠作為抗原，以免疫并產(chǎn)生對(duì)精子表面抗原有反應(yīng)的抗體。利用流動(dòng)細(xì)胞計(jì)來(lái)篩選采用普通雜交瘤技術(shù)發(fā)展出的單株抗體，以鑒別可結(jié)合至一系列不同動(dòng)物(老鼠，豬，牛，綿羊，山羊及雞)的候選抗體。簡(jiǎn)言之，將精細(xì)胞與不同的初級(jí)單株抗體一起培養(yǎng)、洗滌，并進(jìn)一步與可專(zhuān)一性辨識(shí)老鼠免疫球蛋白的次級(jí)抗體一起培養(yǎng)。此類(lèi)次級(jí)抗體為商業(yè)上可得并于本領(lǐng)域中被熟知，其具有熒光分子，例如熒光素或若丹明結(jié)合于其上。一旦此次級(jí)抗體經(jīng)結(jié)合并洗滌，則流動(dòng)細(xì)胞計(jì)儀器或FACS分類(lèi)機(jī)可于裸精細(xì)胞中，計(jì)算出與初級(jí)及次級(jí)抗體結(jié)合的熒光精細(xì)胞數(shù)目。
圖2-7顯示出此類(lèi)分別結(jié)合至老鼠、豬、牛、雞、山羊及綿羊的mAbc的流動(dòng)細(xì)胞計(jì)分析結(jié)果。Y-軸相當(dāng)于所檢測(cè)的精細(xì)胞數(shù)，而X-軸為結(jié)合至細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度。斜線(xiàn)的波峰代表對(duì)照反應(yīng)，其中精細(xì)胞僅與熒光性抗-老鼠免疫球蛋白抗體一起培養(yǎng)。另一方面，陰影的波峰代表的反應(yīng)是將mAbc抗體與次級(jí)抗體分別與相應(yīng)的老鼠、豬、牛、雞、山羊及綿羊的精細(xì)胞一起培養(yǎng)。波峰往右移動(dòng)代表mAbc抗體的正結(jié)合。
如圖2中所示，與僅與熒光性次級(jí)抗體一起培養(yǎng)的細(xì)胞相比，與mAbc抗體及熒光性次級(jí)抗體一起培養(yǎng)的老鼠精細(xì)胞可測(cè)得較大的熒光信號(hào)。類(lèi)似地，在圖3及4中，較大的熒光信號(hào)可分別由與mAbc抗體及熒光性次級(jí)抗體一起培養(yǎng)的豬和牛精細(xì)胞測(cè)得，其可由右側(cè)的陰影波峰證明。
在圖5中，將熒光性抗體單獨(dú)與雞精細(xì)胞一起培養(yǎng)，并不在此類(lèi)精細(xì)胞中產(chǎn)生任何可測(cè)得的熒光性。反之，右邊波峰代表已連接mAbc抗體的雞精細(xì)胞內(nèi)的熒光度。圖5亦顯示雞精細(xì)胞的一些族群無(wú)法表現(xiàn)出可被mAbc辨識(shí)的抗原，其可由左邊的陰影波峰證明。
在圖6中，可由與mAbc抗體及熒光性次級(jí)抗體一起培養(yǎng)的山羊精細(xì)胞測(cè)得熒光度，其可由右邊兩個(gè)陰影波峰證明。左邊的陰影波峰可代表山羊精細(xì)胞的族群，其比右邊波峰的族群表現(xiàn)較低量的可被mAbc辨識(shí)的抗原。對(duì)比在圖5中的僅與熒光性次級(jí)抗體一起培養(yǎng)的雞精細(xì)胞，抗-老鼠免疫球蛋白熒光性抗體似乎亦結(jié)合于山羊精細(xì)胞，但比作為連接子的mAbc之量低許多。
類(lèi)似地，在圖7中，可由與mAbc抗體及熒光性次級(jí)抗體一起培養(yǎng)的綿羊精細(xì)胞測(cè)得熒光度，其可由右邊的陰影波峰證明。波峰的分布再次代表不同的精細(xì)胞具有不同量的、可由mAbc辨識(shí)的抗原。
如圖2、3、4、6及7中所示，哺乳類(lèi)精細(xì)胞可以較低的濃度結(jié)合于熒光次級(jí)抗體上。因?yàn)榇渭?jí)抗體是針對(duì)不存在于雞精細(xì)胞的老鼠免疫球蛋白，其亦可對(duì)位于精細(xì)胞表面的其它哺乳類(lèi)蛋白質(zhì)具有交叉作用性(圖5)。然而，因mAbc的添加而造成熒光波峰的移動(dòng)，明白地證實(shí)mAbc抗體對(duì)不同動(dòng)物的精細(xì)胞有較高的親和力。實(shí)施例II本案例是說(shuō)明單株抗體mAbc通過(guò)離子作用力結(jié)合至DNA分子的能力。
將濃度為0.5毫克/毫升的純化mAbc溶液以不同體積加至含有300毫微克之經(jīng)SalI切割的pCMV-β質(zhì)粒的DNA溶液中(圖8，Clontech Laboratories，Inc.，Cat.#6177-1)。將該混合物于室溫下培養(yǎng)40分鐘后，將該混合物加載到常規(guī)的百分之一的瓊脂糖膠體上，并于20毫安培下分離1小時(shí)。隨后，將DNA以Ethidium Bromide染色并于UV燈下觀察。
在圖9中，第1、2及8道為對(duì)照組，其中，第1道為經(jīng)SalI切割的純pCMV-β質(zhì)粒，第2及8道為在經(jīng)修飾的Tyrode’s培養(yǎng)基中經(jīng)SalI切割的pCMV-β質(zhì)粒。第3、4、5、6及7道分別為將經(jīng)SalI切割的pCMV-β與相應(yīng)的濃度為0.5毫安/毫升的mAbc溶液0.2微升、1微升、2.5微升、6微升及10微升一起培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)性反應(yīng)。在第5、6及7道中，保留在膠體的孔槽中的DNA量增加，顯示帶正電荷的抗體與帶負(fù)電荷的質(zhì)粒DNA相結(jié)合，使其凈電荷為零，使得該復(fù)合物不再對(duì)膠體內(nèi)的電場(chǎng)有所反應(yīng)。實(shí)施例III本實(shí)施例說(shuō)明DNA通過(guò)連接子或抗體結(jié)合或偶合至精子上。
利用標(biāo)準(zhǔn)未端標(biāo)示技術(shù)，將DNA分子以T4 DNA聚合酶標(biāo)示P32，將其與老鼠、豬、雞、綿羊、山羊及牛精細(xì)胞，與mAbc、mAbD或?qū)φ盏膶?duì)果蠅(Drosophila)蛋白具有專(zhuān)一性的抗體一起培養(yǎng)。借助閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量DNA結(jié)合量。精細(xì)胞與抗體的比例如下老鼠----400,000個(gè)精細(xì)胞對(duì)600毫微克的經(jīng)標(biāo)示的DNA；豬------600,000個(gè)精細(xì)胞對(duì)800毫微克的經(jīng)標(biāo)示的DNA；雞------300,000個(gè)精細(xì)胞對(duì)500毫微克的經(jīng)標(biāo)示的DNA；綿羊----1,000,000個(gè)精細(xì)胞對(duì)500毫微克的經(jīng)標(biāo)示的DNA；山羊----1,000,000個(gè)精細(xì)胞對(duì)500毫微克的經(jīng)標(biāo)示的DNA；牛------1,000,000個(gè)精細(xì)胞對(duì)500毫微克的經(jīng)標(biāo)示的DNA。
表1顯示出在mAbc和mAbD的存在下，與無(wú)抗體或加入對(duì)果蠅(Drosophia)蛋白具有專(zhuān)一性的抗體者相比，精細(xì)胞對(duì)經(jīng)標(biāo)示的DNA的結(jié)合顯著地較多。反應(yīng)1及2僅含精細(xì)胞及經(jīng)標(biāo)示的DNA，而反應(yīng)3及4含有對(duì)果蠅(Drosophila)蛋白具有專(zhuān)一性的抗體及精細(xì)胞及經(jīng)標(biāo)示的DNA。反應(yīng)5含mAbD，而反應(yīng)6及7含mAbC與精細(xì)胞及經(jīng)標(biāo)示的DNA。
表1

N/D＝未測(cè)出實(shí)施例IV本實(shí)施例說(shuō)明生產(chǎn)基因上修飾的老鼠的過(guò)程。
從9至20周大小的FVB雄鼠的切開(kāi)副睪中采集精細(xì)胞。將此類(lèi)副睪組織切成小片，在300微升的pH7-8的經(jīng)修飾的Tyrode’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時(shí)，以使精子進(jìn)入培養(yǎng)基中。一旦在300微升培養(yǎng)基中收集到精子后，隨即于37C下對(duì)100萬(wàn)個(gè)精細(xì)胞加入5毫克的連接子抗體1小時(shí)。用300微升經(jīng)修飾的Tyrode’s培養(yǎng)基洗滌3次上述精子-連接子復(fù)合物，利用標(biāo)準(zhǔn)微量離心法于3000rpm下離心一分半鐘。最后將精子-連接子復(fù)合物再懸浮于300微升培養(yǎng)基中，加入1毫克的直線(xiàn)化pCMV-β質(zhì)粒或可轉(zhuǎn)譯出B型肝炎表面抗原(HbsAg)的質(zhì)粒，并培養(yǎng)1小時(shí)。
為了采集排出的卵，使每只9至20周大小的FVB雄鼠在采集日四天前注射5I.U.的懷孕母馬血清(PMS)，并于采集日兩天前注射5I.U.的人類(lèi)絨毛膜促性腺激素(hCG)。將由堆積細(xì)胞圍繞的切開(kāi)排出之卵于室溫下置于含一滴經(jīng)修飾的Tyrode’s培養(yǎng)基的35-毫米培養(yǎng)皿中。隨后，直接在排出之卵加入300微升上述制備的精子-連接子-DNA復(fù)合物。將全部混合物于37℃下以CO2平衡并于頂部加入礦物油防止蒸發(fā)。于37℃下在生物體外受精4小時(shí)后，以毛細(xì)管采集受精卵并以CZB培養(yǎng)基洗滌三次。在轉(zhuǎn)移至假性妊娠雌鼠的輸卵管前，將胚胎進(jìn)一步于300微升CZB培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-22小時(shí)。
為了確認(rèn)pCMV-β質(zhì)粒的存在，在移植入假性妊娠雌鼠十天后，由胚胎分離出的DNA進(jìn)行PCR分析，其利用可檢測(cè)對(duì)應(yīng)于pCMV-β質(zhì)粒CMV啟動(dòng)子區(qū)的480 bp片段的引物(圖8)。在圖10中，第6、7、8、9、10、12、13、14、15、17、18、19、24、33及40道明顯地顯示出此480 bp PCR片段。第1及21道為分子大小標(biāo)示劑。
為確認(rèn)HBsAg質(zhì)粒插入老鼠基因組中，進(jìn)行DNA印跡分析。將老鼠尾巴分離出的基因組DNA水解，在膠體上分離，根據(jù)本領(lǐng)域中已知方法轉(zhuǎn)印至尼龍膜上。圖11顯示使用與HBsAg互補(bǔ)的探針序列的DNA印跡雜化結(jié)果。第1-13道含有來(lái)自由接受以上精子-連接子-DNA復(fù)合物受精胚胎之假性妊娠鼠所生的老鼠的基因組DNA；第C1-C7道含有來(lái)自未經(jīng)處理或非轉(zhuǎn)基因老鼠的基因組DNA。第4、5及8道顯示出HBsAg序列插入至老鼠基因組的陽(yáng)性橫帶，因此，證實(shí)13只老鼠中有三只是基因上修飾過(guò)的。實(shí)施例V本實(shí)施例說(shuō)明生產(chǎn)基因上修飾的豬的步驟。
利用動(dòng)物飼養(yǎng)技術(shù)中已知的一般方法收集豬所射出的精細(xì)胞。將其懸浮于1毫升的豬增量培養(yǎng)基(購(gòu)自德國(guó)Merck，Ref.N.R.13151/0001-用于公豬的稀釋混合物M3)，將一千五百萬(wàn)個(gè)精細(xì)胞與5毫克連接子抗體于室溫下培養(yǎng)40分鐘，其間加以間歇性振蕩。用豬增量培養(yǎng)基(extender medium)將精子-連接子混合物洗滌一次，并將該混合物再懸浮于1.5毫升相同的培養(yǎng)基后，加入5毫克pSEAP2-對(duì)照質(zhì)粒(圖12，Clontech Laboratories，Inc.，Cat.#6052-1)，于室溫下與該混合物培養(yǎng)四十分鐘。直接將所生成的精子-連接子-DNA復(fù)合物200微升注入被麻醉的雌豬輸卵管中，使其體內(nèi)受精。
在豬出生并長(zhǎng)至70天后，分析其pSEAP2-對(duì)照質(zhì)粒的存在。圖13顯示由此類(lèi)豬的尾部組織所分離出的基因組DNA的DNA印跡分析。簡(jiǎn)言之，將自此類(lèi)豬分離出的基因組DNA水解，在膠體上分離，按本領(lǐng)域中已知方法轉(zhuǎn)印至尼龍膜上。再用圖12中所示的、pSEAP2-對(duì)照質(zhì)粒的NotI至BamHI區(qū)域的、經(jīng)標(biāo)示的序列來(lái)探測(cè)該DNA印跡。在圖13中，M代表標(biāo)示物，且1-43代表所分析的豬的號(hào)碼。于第5、17、19、25、26、27、28、30、36、38、39及40道中的雜化(hybridization)信號(hào)表明pSEAP2-對(duì)照質(zhì)粒已插入相應(yīng)豬的基因組中。在圖的右下半邊，八條道具有增加的pSEAP2-對(duì)照質(zhì)粒分子復(fù)制數(shù)者(1、2、2、4、4、8、16及32)亦與來(lái)自實(shí)驗(yàn)豬只的DNA一起載入膠體上。此八條道用以根據(jù)橫帶的密度測(cè)定強(qiáng)度來(lái)估算插入的豬只的pSEAP2-對(duì)照質(zhì)粒復(fù)制數(shù)(圖14)。如圖14中所示，S5具有最高強(qiáng)度，其對(duì)應(yīng)于圖13的第5道。
在另一研究中，也在70天大小的基因修飾豬中，檢測(cè)由pSEAP2-對(duì)照質(zhì)粒所表達(dá)的分泌性堿性磷酸酶(SEAP)。收集此類(lèi)豬只的血清并利用Clontech’s Great EscAPETMSEAP化學(xué)熒光檢測(cè)套組(Cat.#K2041-1)及其方法分析SEAP活性，在此，其作為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)。由Clontech’s pSEAP-2載體所表達(dá)的SEAP酶具有熱穩(wěn)定性。因此，為測(cè)定與豬的內(nèi)源性堿性磷酸酶活性相反的SEAP活性量，該分析在添加化學(xué)熒光基質(zhì)前，需先將樣品于65℃下加熱三十分鐘，以將內(nèi)源性堿性磷酸酶去活化。作為對(duì)照，圖15顯示未進(jìn)行熱去活化步驟的分析結(jié)果?；蛏闲揎椮i及非-轉(zhuǎn)基因?qū)φ肇i之間的總堿性磷酸酶活性無(wú)顯著差異。反之，圖16顯示了進(jìn)行此熱去活化步驟的結(jié)果。在沒(méi)有內(nèi)源性堿性磷酸酶的活性下，基因上修飾豬的SEAP活性顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ肇i的活性。因此，pSEAP2-對(duì)照質(zhì)粒確實(shí)已插入豬的基因組并可表達(dá)SEAP酶。
前述實(shí)施例證實(shí)本發(fā)明利用上述的精子載體可以生產(chǎn)許多基因上修飾的動(dòng)物。但這些數(shù)據(jù)僅作為實(shí)施例，并非將本發(fā)明限制為這些實(shí)施例。可以理解，下述對(duì)實(shí)施例的改進(jìn)并未脫離本發(fā)明的精神。
權(quán)利要求
1.一種用于基因上修飾非人類(lèi)之動(dòng)物或細(xì)胞的載體，其包括一種非人類(lèi)的精細(xì)胞以及至少一種結(jié)合于該非人類(lèi)的精細(xì)胞之上的聚核苷酸分子，該結(jié)合至少通過(guò)一種非脂質(zhì)體基底的連接子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述的非脂質(zhì)體基底的連接子是結(jié)合于所述的非人類(lèi)精細(xì)胞的外表面。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述的非脂質(zhì)體基底的連接子還含有至少一種多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其中，所述的多肽是一種蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述的非脂質(zhì)體基底的連接子是一種精子專(zhuān)一性連接子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述的非脂質(zhì)體基底的連接子優(yōu)先結(jié)合在非人類(lèi)精細(xì)胞的外表面上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述的非脂質(zhì)體基底的連接子是一種免疫球蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述的非脂質(zhì)體基底的連接子是一種抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述的至少一種聚核苷酸分子是為一種DNA分子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的載體，其中，所述的DNA分子能為基因產(chǎn)物進(jìn)行編碼。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的載體，其中，所述的基因產(chǎn)物是一種RNA分子。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的載體，其中，所述的基因產(chǎn)物是一種蛋白質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述的非脂質(zhì)體基底的連接子與所述的至少一種聚核苷酸分子通過(guò)分子間的相互作用而發(fā)生相互作用，該分子間的相互作用包括離子相互作用、共價(jià)相互作用、范德瓦相互作用以及配體-受體間的相互作用。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述的非脂質(zhì)體基底的連接子，通過(guò)至少一種第二非脂質(zhì)體基底的連接子，與所述的至少一種聚核苷酸分子發(fā)生相互作用。
15.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其中，所述的至少一種聚核苷酸分子，在生物體內(nèi)通過(guò)非脂質(zhì)體基底的連接子而結(jié)合到非人類(lèi)精細(xì)胞的外表面。
16.一種用于將至少一種聚核苷酸分子連接至非人類(lèi)精細(xì)胞外表面的非脂質(zhì)體基底的連接子，其含有至少一種多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的非脂質(zhì)體基底的連接子，其中，所述的多肽是一種蛋白質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的非脂質(zhì)體基底的連接子，其中，所述的多肽是一種免疫球蛋白。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的非脂質(zhì)體基底的連接子，其中，所述的多肽是一種抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的非脂質(zhì)體基底的連接子，其中，所述的至少一種多肽是結(jié)合于非人類(lèi)精細(xì)胞的外表面。
21.一種細(xì)胞，其衍生自具有一種載體的、有效受精的非人類(lèi)卵細(xì)胞，其中，所述的載體包括一種非人類(lèi)的精細(xì)胞和至少一種通過(guò)一種非脂質(zhì)體基底的連接子而結(jié)合于該非人類(lèi)的精細(xì)胞的聚核苷酸分子。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的細(xì)胞，其中，所述的受精發(fā)生在生物體外或生物體內(nèi)。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的細(xì)胞，其中，所述的至少一種聚核苷酸分子是全部地或部分地插入至該細(xì)胞的基因組中。
24.一種基因修飾的非人類(lèi)動(dòng)物，其來(lái)自于用如下的載體使非人類(lèi)的卵細(xì)胞受精，所述的載體含有非人類(lèi)的精細(xì)胞以及至少一種通過(guò)一種非脂質(zhì)體基底的連接子而結(jié)合于該非人類(lèi)的精細(xì)胞的聚核苷酸分子。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的基因修飾的非人類(lèi)動(dòng)物，其中，所述的非人類(lèi)的動(dòng)物是一種哺乳動(dòng)物。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的基因修飾的非人類(lèi)動(dòng)物，其中，所述的非人類(lèi)的動(dòng)物是一種鳥(niǎo)類(lèi)。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的基因修飾的非人類(lèi)動(dòng)物，其中，所述的非人類(lèi)的動(dòng)物是豬類(lèi)。
28.根據(jù)權(quán)利要求24所述的基因修飾的非人類(lèi)動(dòng)物，其中，所述的至少一種聚核苷酸分子是全部地或部分地插入至該非人類(lèi)動(dòng)物的基因組中。
29.根據(jù)權(quán)利要求24所述的基因修飾的非人類(lèi)動(dòng)物，其中，所述的受精是在生物體外或生物體內(nèi)進(jìn)行的。
30.根據(jù)權(quán)利要求24所述的基因修飾的非人類(lèi)動(dòng)物，其中，所述的至少一種聚核苷酸分子是在生物體外或生物體內(nèi)通過(guò)非脂質(zhì)體基底的連接子而結(jié)合至非人類(lèi)精細(xì)胞的外表面。
31.一種非人類(lèi)的動(dòng)物，其是如權(quán)利要求24所述的基因修飾的非人類(lèi)動(dòng)物的后代。
32.一種細(xì)胞，其衍生自根據(jù)權(quán)利要求25所述的基因修飾的動(dòng)物或衍生自根據(jù)權(quán)利要求24所述的基因修飾的動(dòng)物后代。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的細(xì)胞，其中，所述的細(xì)胞是一種生殖細(xì)胞。
34.一種細(xì)胞系，其衍生自根據(jù)權(quán)利要求24所述的基因修飾的動(dòng)物或衍生自根據(jù)權(quán)利要求24所述的基因修飾的動(dòng)物后代。
35.一種基因修飾非人類(lèi)動(dòng)物的方法，其包括下列步驟通過(guò)至少一種非脂質(zhì)體基底的連接子將至少一種聚核苷酸分子連接至非人類(lèi)的精細(xì)胞；用通過(guò)所述的非脂質(zhì)體基底的連接子與所述的至少一種聚核苷酸分子連接的非人類(lèi)的精細(xì)胞，使非人類(lèi)的卵細(xì)胞在生物體外或生物體內(nèi)有效地受精。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述的連接發(fā)生在生物體外或生物體內(nèi)。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述的非脂質(zhì)體基底的連接子還含有一種多肽。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述的多肽是一種蛋白質(zhì)。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述的非脂質(zhì)體基底的連接子是連接于非人類(lèi)精細(xì)胞的外表面。
40.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述的非脂質(zhì)體基底的連接子是一種精子專(zhuān)一性的連接子。
41.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述的非脂質(zhì)體基底的連接子是一種免疫球蛋白。
42.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述的非脂質(zhì)體基底的連接子是一種抗體。
43.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述的至少一種聚核苷酸分子是一種DNA分子。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述的DNA分子能為基因產(chǎn)物進(jìn)行編碼。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述的基因產(chǎn)物是一種RNA分子。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述的基因產(chǎn)物是一種蛋白質(zhì)。
47.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述的非脂質(zhì)體基底的連接子與所述的至少一種聚核苷酸分子通過(guò)分子間的相互作用而發(fā)生相互作用，該分子間的相互作用包括離子相互作用、共價(jià)相互作用、范德瓦相互作用以及配體-受體間的相互作用。
48.一種生產(chǎn)較天然的非人類(lèi)動(dòng)物生長(zhǎng)快速的非人類(lèi)動(dòng)物的方法，其包括下列步驟通過(guò)至少一種非脂質(zhì)體基底的連接子，將至少一種聚核苷酸分子結(jié)合至非人類(lèi)的精細(xì)胞，其中，所述的至少一種聚核苷酸分子能為促生長(zhǎng)素進(jìn)行編碼；用通過(guò)所述的至少一種非脂質(zhì)體基底的連接子與所述的至少一種聚核苷酸分子連接的非人類(lèi)精細(xì)胞，在生物體外或生物體內(nèi)使非人類(lèi)的卵細(xì)胞有效地受精，以形成一胚胎；以及使該胚胎發(fā)育成一種動(dòng)物。
49.一種生產(chǎn)抗疾病或抗病原體的非人類(lèi)動(dòng)物的方法，其包括下列步驟通過(guò)至少一種非脂質(zhì)體基底的連接子將至少一種聚核苷酸分子結(jié)合至非人類(lèi)的精細(xì)胞，其中，所述的至少一種聚核苷酸分子能為基因產(chǎn)物進(jìn)行編碼，該基因產(chǎn)物賦予疾病抗性或病原體抗性；用通過(guò)所述的至少一種非脂質(zhì)體基底的連接子與所述的至少一種聚核苷酸分子連接的非人類(lèi)精細(xì)胞，在生物體外或生物體內(nèi)使非人類(lèi)的卵細(xì)胞有效地受精，以形成一胚胎；以及使該胚胎發(fā)育成一種動(dòng)物。
50.一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，其包括下列步驟通過(guò)一種非脂質(zhì)體基底的連接子將至少一種聚核苷酸分子結(jié)合至非人類(lèi)的精細(xì)胞，其中，所述的至少一種聚核苷酸分子能為一種蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼，該蛋白質(zhì)可專(zhuān)一性地生產(chǎn)于非人類(lèi)動(dòng)物的乳汁中；用通過(guò)所述的至少一種非脂質(zhì)體基底的連接子與所述的至少一種聚核苷酸分子連接的非人類(lèi)精細(xì)胞，在生物體外或生物體內(nèi)使非人類(lèi)的卵細(xì)胞有效地受精，以形成一胚胎；使該胚胎發(fā)育成一種動(dòng)物；以及收集由成熟的該非人類(lèi)動(dòng)物所生產(chǎn)的乳汁。
51.動(dòng)物-人類(lèi)外源性的移植方法，其包括下列步驟通過(guò)至少一種非脂質(zhì)體基底的連接子將至少一種聚核苷酸分子結(jié)合至非人類(lèi)的精細(xì)胞，其中，所述的至少一種聚核苷酸分子能為一種基因產(chǎn)物進(jìn)行編碼；用通過(guò)所述的至少一種非脂質(zhì)體基底的連接子與所述的至少一種聚核苷酸分子連接的非人類(lèi)精細(xì)胞，在生物體外或生物體內(nèi)使非人類(lèi)的卵細(xì)胞有效地受精，以形成一胚胎；使該胚胎發(fā)育成一種動(dòng)物；以及通過(guò)手術(shù)由該非人類(lèi)動(dòng)物移出一器官，以移植至人類(lèi)，其中，被所述的至少一種聚核苷酸分子所編碼的基因產(chǎn)物，賦予人體移植后的耐受性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種載體及其用于生產(chǎn)基因修飾的動(dòng)物和細(xì)胞的用途。一方面，本發(fā)明涉及一種載體，其含有一個(gè)精細(xì)胞及一個(gè)或多個(gè)通過(guò)一個(gè)或多個(gè)非脂質(zhì)體基底的連接子結(jié)合于精細(xì)胞上的聚核苷酸分子。精細(xì)胞可以是任何動(dòng)物的細(xì)胞，優(yōu)選為非人類(lèi)動(dòng)物的。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方案中，所述的一個(gè)或多個(gè)聚核苷酸分子可以為一種基因產(chǎn)物進(jìn)行編碼，其可賦予細(xì)胞或動(dòng)物所需的特征。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的連接子為一種蛋白質(zhì)或多肽，優(yōu)選具有精子專(zhuān)一性，例如可與精細(xì)胞的外表面結(jié)合的抗體。連接子優(yōu)選為借助離子作用力與一個(gè)或多個(gè)聚核酸分子發(fā)生相互作用。此類(lèi)相互作用的進(jìn)行亦可借助其它的分子相互作用，包括使用另一連接子或第二連接子。精子、連接子及一個(gè)或多個(gè)聚核苷酸的相連亦可發(fā)生在生物體外或生物體內(nèi)。另一方面，在本發(fā)明中，可由具有上述載體的動(dòng)物卵細(xì)胞受精而衍生出基因上修飾的細(xì)胞或動(dòng)物。受精可發(fā)生在生物體外或生物體內(nèi)。在一優(yōu)選的具體實(shí)施例中，基因修飾的發(fā)生是因聚核苷酸分子全部或部分地插入至細(xì)胞或動(dòng)物之基因組中。在本發(fā)明的又一方面中，其包括細(xì)胞，例如衍生自此類(lèi)基因上修飾的動(dòng)物或其后代的精細(xì)胞或卵細(xì)胞及其細(xì)胞系。再一方面，在本發(fā)明中，通過(guò)利用具有某些所需特征的上述精子載體，可以得到基因上修飾的動(dòng)物。此類(lèi)所需的特征的實(shí)施例包括較快的生長(zhǎng)速率、抗疾病能力或抗病原體能力、在乳汁中的某些蛋白質(zhì)的高率以及在動(dòng)物至人類(lèi)的外源性移性移植中移植器官的適應(yīng)性等。
文檔編號(hào)C07K16/28GK1432067SQ01810496
公開(kāi)日2003年7月23日 申請(qǐng)日期2001年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月28日
發(fā)明者王康圣 申請(qǐng)人:百圭生物科技公司