專利名稱：氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法
專利說明氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法 技術領域 本發(fā)明涉及一種氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，特別是“3′-脫氧-3′-氟代-胸腺嘧啶核苷在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法”。
該方法的實質(zhì)是基于腫瘤細胞增殖周期-S階段-細胞介質(zhì)中高濃度的胸腺嘧啶核苷激酶-1(TK1)的生物化學，以3’-脫氧-3’-氟代-胸腺嘧啶核苷-5’-單磷酸衍生物(FLT-5’-MP)為例，對捕獲富集后的生存循環(huán)腫瘤細胞進行的質(zhì)譜鑒定。
背景技術 原發(fā)腫瘤細胞經(jīng)自然、診療脫落后，可進入外周血循環(huán)系統(tǒng)。部份能承受并逃脫免疫系統(tǒng)殺滅的循環(huán)腫瘤細胞，侵潤上皮組織形成最終致命的轉(zhuǎn)移灶。外周血循環(huán)腫瘤細胞的捕獲、鑒定、計數(shù)對亞健康人群的早期普查，進行腫瘤的臨床分期，手術化療放療的個體優(yōu)化方案具有獨特不可替代的意義。但是，由于外周血循環(huán)系統(tǒng)中腫瘤細胞的極低濃度，即每十億正常血液細胞僅含低達數(shù)個腫瘤細胞，由此產(chǎn)生對變異腫瘤細胞捕獲、鑒定、計數(shù)過程中的假陰-陽性問題。消除假陰-陽性問題對變異腫瘤細胞捕獲、鑒定和計數(shù)的影響是一個目前尚沒有解決好的世界性難題。
循環(huán)腫瘤細胞CTCs的定義1，腫瘤細胞密度小于1.077克/毫升，而血液正常細胞及粒細胞的細胞密度大于1.077克/毫升。2，細胞相對大小，腫瘤細胞的直經(jīng)一般為6至30微米，血液中最大白細胞的直徑為8至11微米。3，腫瘤細胞形態(tài)為不規(guī)則的圓形或卵圓形態(tài)。4，細胞核DAPI陽性反應(DAPI4’，6-diamidino-2-phenylidole)。5，細胞角蛋白8，18，19等呈陽性，在上皮組織中成對表達，細胞角蛋白的陽性表達在蛋白質(zhì)水平被證明是上皮源性腫瘤細胞的較敏感和較特異的標志物。6，由于CTCs不表達白細胞共同抗原CD45，CD45檢測為陰性。
目前用于腫瘤診斷的方法可歸為三大類病理學，影像學和血清學。外周血CTCs的CellSearch檢測儀目前已是被FDA認可的靈敏檢測手段之一。但其對捕獲富集后的CTCs鑒定法，可歸納為單克隆抗體對腫瘤表達蛋白的識別或以核酸為基礎的測定。CTCs質(zhì)譜鑒定法基于以下三個不同領域的技術支持背景。
1.捕獲富集鑒定循環(huán)腫瘤細胞技術 CTCs指自發(fā)或因診療操作進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。自1869年發(fā)現(xiàn)CTCs以來，其生物行為已漸為人們重視。腫瘤細胞有其特異的生長周期。所有生存細胞或者處于休整G0態(tài)，或者處于活性階段。腫瘤細胞的增殖是由G0態(tài)進入第一階段的G1態(tài)，在此準備進入合成階段的S態(tài)，所謂S態(tài)指細胞核DNA的合成。隨后進入滯后期的G2階段，然后進入完成細胞的有絲分裂的M階段。在此DNA分離為兩相同的染色單體、整個細胞一分為二。細胞分裂周期中，DNA的合成不但在細胞介質(zhì)中進行，同時也可在線粒體中合成。兩種不同的異構酶胸苷激酶TK1與胸腺嘧啶核苷激酶-2(TK2)，分別在細胞介質(zhì)與線粒體中對胸腺嘧啶核苷(下面簡稱胸苷)的5’位羥基進行磷酸化反應。TK1的濃度可在G1-S轉(zhuǎn)變期增加10-20倍之多，并于G2及M階段繼續(xù)保持高濃度?；氐紾0和G1階段后，TK1則迅速降解回到正常水平。與此相反，線粒體中的TK2濃度及活性不隨細胞增殖周期的影響。由于TK1在腫瘤細胞生長周期的S階段特征性的激酶表達方式，TK1成為腫瘤治療的靶點及檢測鑒定的可靠方法，目前被公認為表征腫瘤細胞的黃金標準。CTCs的臨床應用近5年獲得實質(zhì)進展，主要取決以下領域的技術發(fā)展。
(1-1)免疫細胞化學 隨著腫瘤細胞的不斷增殖，85％的上皮屬性腫瘤細胞可以通過表達一種表皮細胞黏附分子的糖蛋白(EpCAM)，以增加其相互識別，擴散能力并使之與腫瘤母體脫離，進而破壞周邊宿主結締組織，并進入脈管系統(tǒng)形成轉(zhuǎn)移灶。與此相反，周血循環(huán)系統(tǒng)的細胞成分無表達該表皮細胞黏附分子的生物基礎。由此為相應的抗體提供了識別、捕獲周血循環(huán)系統(tǒng)CTCs的笫一選擇性。
(1-2)捕獲富集技術 文獻數(shù)據(jù)表明，腫瘤脫離細胞的速度大致為1×10-5到3×10-6CTCs/天/克腫瘤組織。因此，測定周血循環(huán)系統(tǒng)的CTCs計數(shù)，可用于腫瘤的早期診斷，腫瘤手術、化療評估的方法。但是，CTCs的濃度極低，大約為每10億分之1，或每毫升含5-1281CTCs。因此，有效的捕獲、富集CTCs為技術關鍵。有市場前景的兩項捕獲、富集技術為免疫磁珠流體的CellSearch和由78,000個帶抗體的微型柱組成的芯片CTC-Chip。目前美國FDA唯一批準的CellSearch技術，以及捕獲、富集CTCs潛力看好的美國麻省總醫(yī)院研制的芯片技術CTC-Chip都是基于識別腫瘤細胞特征EpCAM的免疫抗體。此外，聚碳酸酯膜過濾分離技術，以及采用Ficoll-Paque為介質(zhì)的離心分離技術，均可分離不同純度的CTCs。
(1-3)捕獲細胞的鑒定 CellSearch和CTC-Chip的腫瘤細胞的鑒定法基于細胞形態(tài)學及生物標記物分折。上皮細胞角蛋白陽性，無論免疫細胞化學檢測還是轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應都存在著一定的局限性，不能排除假陽性。DAPI陽性，即鑒定DNA的AT部位蘭色熒光法、以及CD45顯色計數(shù)陰性，即CK+/DAPI+/CD45-。該組合鑒定法為目前鑒定CTCs細胞水平的第二選擇性，并為FDA批準。且優(yōu)于Adams所報導的CTCs直接從微流控捕獲后電導計數(shù)法。
(1-4)假陽性問題 鑒定捕獲細胞的假陽性問題可歸于以下因素免疫磁珠流體捕獲的腫瘤細胞基本為死亡細胞，目前捕獲效力達106富集度的CTC-Chip技術的生存細胞純度為50％。變異中的基因型-表現(xiàn)型無疑對免疫細胞化學鑒定法，以核酸為基礎的PCR，RT-PCR鑒定法產(chǎn)生假陽性反應。有關單克隆抗體以及熒光鍵合化學的制備、提純、應用在實驗室之間存在校大誤差。假陽性問題是低濃度CTCs鑒定的首要問題。
(1-5)外周血循環(huán)腫瘤細胞的捕獲、富集、鑒定技術現(xiàn)況評估 鑒定外周血循環(huán)腫瘤細胞的先決條件是捕獲后生存的CTCs。在此，本申請專利將以捕獲后腫瘤細胞的存活與否界定當前該領域的技術效果。第一類，即捕獲后存活的腫瘤細胞技術。其代表技術為美國麻省總醫(yī)院研制，CELLective Dx公司發(fā)展的CTC-Chip，含CTCs的全血在精密控制的層流條件下，流經(jīng)芯片中78,000個帶抗體的微型柱，使得CTCs與表面化學鍵合的抗體均勻接觸，免疫識別后捕獲。CTC-Chip捕獲的生存腫瘤細胞精度為99％，純度50％。捕獲生存腫瘤細胞的意義在于提供了進一步代謝組、蛋白質(zhì)組、基因組鑒定的基礎。如對肺癌的表皮細胞生長蛋白受體基因突變的測定。CTC-Chip的鑒定屬于CD45-/DAPI+/CK+的螢光組合測定，即CD45-陽性正常血液白細胞、DAPI用于DNA含量測定、CK+表皮細胞角質(zhì)蛋白陽性。CTCs雙電泳法捕獲細胞的存活率為90％，生存細胞的鑒定基于蹤跡熒光測定。此外，還有細胞密度梯度離心分離及卵巢腫瘤高表述的葉酸鹽受體熒光測定法。上述三項捕獲富聚生存CTCs技術目前都還處實驗室發(fā)展階段。第二類，即捕獲后非存活的腫瘤細胞技術。目前唯一用于臨床CellSearch技術基礎為識別EpCAM的免疫磁珠流體。經(jīng)一系列半自動化的處理、分離、清洗后，捕獲為固化死亡的CTCs。其鑒定方法也與CTC-Chip相同CD45-/DAPI+/CK+的熒光組合測定。與CTC-Chip的主要區(qū)別在于捕獲方式以及CTCs的生存率。免疫磁珠流體還被用于表皮細胞角質(zhì)蛋白的識別、捕獲，配之以Ariol掃描鑒定技術，其研制公司Genetix獲得優(yōu)于CellSearch的結果。需要指出的是由Adnagen開發(fā)的以EpCAM為基礎的捕獲技術配之靈敏的RT-PCR檢測。目前鑒定CTCs的主要方法都局限于CTCs變異中的基因型-表現(xiàn)型，也正是現(xiàn)有捕獲方法需加以多重交叉測定，以降底CTCs假陽性的原因。以識別表皮細胞角質(zhì)蛋白的捕獲富聚技術稱為正向富聚技術，而對紅細胞的選擇性溶血技術稱為負向富聚技術。
2.用于正電子發(fā)射計算機斷層掃描的[18氟]代示蹤劑(PET) PET示蹤劑技術使得細胞內(nèi)生化代謝可被直接進行觀測，但無法區(qū)分示蹤劑及其特定代謝產(chǎn)物的相對分布及相對定量用于能量代謝示蹤劑的2’-脫氧-2’-[18氟]-D葡萄糖([18氟]-FDG)、DNA代謝的3’-脫氧-3’-[18氟]代胸腺嘧啶核苷([18氟]-FLT)、抑制參與損壞RNA及DNA合成的5-[18氟]尿嘧啶(5-FU)。由于該三種示蹤劑的共同特點是腫瘤細胞吸收后的代謝中間體的磷酸酶化反應，帶負電荷的磷酸根則為串級質(zhì)譜測定提供了理想的分子結構特征。本申請專利僅討論進入細胞后抑制進一步代謝的標記物[18氟]-FDG、[18氟]-FLT及[18氟]-FU。并以FLT為例，進行腫瘤細胞質(zhì)譜鑒定法的演示實例。作為PET用的放射性同位素18氟將以質(zhì)譜所用的穩(wěn)定同位素氟替代。
(2-1)2’-脫氧-2’-[18氟]-D葡萄糖能量代謝示蹤劑 腫瘤細胞的低效生“能”機制導致腫瘤細胞對葡萄糖較高需求。FDG與普通葡萄糖化學性質(zhì)相似，可在人體中產(chǎn)生有標記的代謝物，并且在人體中存留時間較長，便于測量。正常腦組織、心肌組織、腎臟及膀胱組織由于高糖代謝的需要因而對FDG攝取較多。其它一些組織如肝臟、肌肉和腸壁由于其糖代謝水平低，則對FDG的攝取量較少，顯示出的FDG活性水平也較低。作為一種葡萄糖類似物，F(xiàn)DG將為葡萄糖高利用率細胞所攝取，如腦、腎臟以及癌細胞。在此類細胞中，磷酸化過程將會阻止葡萄糖以原有的完整形式從細胞之中釋放出來。葡萄糖之中的2’位氧是隨后糖酵解所必需。因而，F(xiàn)DG與2-脫氧-D-葡萄糖類似，在細胞內(nèi)無法繼續(xù)代謝。因此，在放射性衰變之前，由六碳糖激酶作用所生成的FDG-6-磷酸將不會發(fā)生糖酵解。[18氟]-FDG的分布情況很好地反映體內(nèi)細胞對葡萄糖的攝取和磷酸化的總體信息。不過，F(xiàn)DG發(fā)生放射性衰變之后，其中的18氟將轉(zhuǎn)變?yōu)?80。而且，在從環(huán)境中獲取一個H+之后，F(xiàn)DG的衰變產(chǎn)物就變成了葡萄糖-6-磷酸，而其2’位上的標記則變?yōu)闊o害的非放射性重氧。這樣，該衰變產(chǎn)物通常就可以按照普通葡萄糖的方式進行代謝。FDA己批準[18氟]-FDG用于PET以評估其它技術持疑的腫瘤病人。[18氟]-FDG雖然靜態(tài)累積于腫瘤細胞內(nèi)，但基于“能量代謝”機理的[18氟]-FDG用于低純度CTCs鑒定時將導致低撿出率，假陽性。穩(wěn)定同位素FDG的代謝磷酸衍生物與相應正常代謝磷酸衍生物之比可作腫瘤細胞的質(zhì)譜鑒定參數(shù)。
(2-2)3’-脫氧-3’-[18氟]代胸腺嘧啶核苷DNA代謝示蹤劑 [18氟]-FLT經(jīng)由細胞膜核苷輸送蛋白進入細胞，進而為細胞介質(zhì)中的TK1對5’位羥基磷酸化。與[18氟]-FDG類似，3’-脫氧-3’-[18氟]代-胸腺嘧啶核苷-5’-磷酸衍生物僅累積于腫瘤細胞內(nèi)，不能參與DNA的合成。需要指出的是DNA的合成涉及兩不同途經(jīng)攝取細胞外已有的胸腺嘧啶核苷衍生物，即補救合成途經(jīng)；或直接攝取細胞內(nèi)的尿嘧啶核苷磷酸衍生物，即從頭合成途徑。經(jīng)由細胞外攝取的[18氟]-FLT水平直接反映了TK1的生化活性。文獻表明，在細胞生長周期的S階段，腫瘤細胞的TK1生化活性通常為正常細胞的10-20倍。這就為本申請專利提供了鑒定周血循環(huán)腫瘤細胞生化特性的基礎。
(2-3)5-[18氟]尿嘧啶DNA及RNA代謝示蹤劑 自1957年以來，5-FU用于直腸癌，乳腺癌治療。其作用及代謝主要有三途徑其一、5-FU代謝中間體5-氟代-2’-脫氧尿苷-5’-單磷酸抑制胸苷酸合酶；其二、5-氟代尿苷-5’-三磷酸參與損壞RNA的合成；其三、5-氟代-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸參與抑制和損壞DNA的合成。穩(wěn)定同位素5-氟尿嘧啶的代謝磷酸衍生物，與其結構相應的正常代謝磷酸衍生物之比可作腫瘤細胞的質(zhì)譜鑒定參數(shù)。
3.納升電噴霧負離子源用于四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀 用于正電子發(fā)射計算機斷層掃描的[18氟]放射性示蹤劑，即上所述[18氟]-FDG與[18氟]-FLT，其共同點是代謝中間體不再參與能量代謝和DNA合成。而5-[18氟]FU則抑制、損壞DNA及RNA的合成。細胞內(nèi)的磷酸化衍生物的累積，為高分辨、高靈敏的質(zhì)譜鑒定提供了有利條件。由此為質(zhì)譜鑒定提供了天然化合物與其結構極類似的人工合成化合物的腫瘤相關信息，以及有利于質(zhì)譜測定的磷酸根負電荷。另一方面，隨蛋白質(zhì)組學的開拓，采用先進精密質(zhì)譜儀對分折物進行離子化，根據(jù)待分折物的分子基團結構調(diào)節(jié)電場極性后，完成質(zhì)譜鑒定。代謝過程中產(chǎn)生的負離子分子導入第一級四極桿質(zhì)量過濾器，由待分折化合物的質(zhì)-荷比，選擇性地導入四極桿碰撞離解室，在高純充電氬氣碰撞下，被分折化合物據(jù)其分子結構發(fā)生碎片裂解。反映特定結構的碎片離子以其攜帶的質(zhì)-荷比在第二級飛行時間單元檢測記錄。對鑒定CTCs而論，四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀Q-TOF的技術關鍵是負離子源的電離效率，以及飛行時間單元在低分子量100-500Da的范圍進行精密校正。用于PET的[18氟]放射性示蹤劑，可以生命中不存在、抑制代謝的氟的穩(wěn)定同位素[19氟]替代。本申請中涉及的FLT，F(xiàn)DG，5-FU均指非放射性的穩(wěn)定氟代化合物。
一級質(zhì)譜由四極桿組成，主要起選擇離子的過濾作用，二級質(zhì)譜為飛行時間分折器，是該儀器的主要質(zhì)量分折單元。質(zhì)譜離子源及不同的串級質(zhì)譜儀還包括A.離子源的電離效率及干擾雜質(zhì)；B.串級質(zhì)譜儀的質(zhì)譜分辨率及靈敏度。這些離子源包括基質(zhì)扶助激光解吸電離源MALDI，離子噴霧電離源IonSpray，快離子轟擊電離源FIB，快原子轟擊電離源FAB。而串級質(zhì)譜儀可由以下組成串級四極桿質(zhì)譜儀，其中的Q3可為離子捕獲質(zhì)譜分折器Iontrap，串級飛行時間-飛行時間質(zhì)譜儀TOF-TOF，分辨率極高的富利葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀FTICR-MS。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種不受腫瘤異變影響，基于細胞生長周期，新穎的質(zhì)譜鑒定法，即腫瘤細胞增殖周期的黃金鑒定法，簡稱循環(huán)腫瘤細胞的質(zhì)譜鑒定法，迄今為止尚未見采用高靈敏、精確質(zhì)譜儀鑒定循環(huán)腫瘤細胞的報導。
本發(fā)明所提出的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，其特征在于 (1)對外周血循環(huán)系統(tǒng)中生存腫瘤細胞的捕獲，捕獲過程可分為單克隆抗體從大量紅細胞中識別極微量的腫瘤細胞的正富集過程，還可經(jīng)由降解紅細胞的負富集方法，以及過濾、離心等基于腫瘤細胞密度、大小的物理分離法； (2)在細胞培養(yǎng)條件下，迫使所捕獲的生存腫瘤細胞以補救合成途徑攝取氟代化合物； (3)對腫瘤細胞代謝產(chǎn)生并積累于細胞介質(zhì)中的氟代單磷酸產(chǎn)物進行電噴霧負離子串級質(zhì)譜鑒定。
為獲得準確鑒定結果，首先采用已知糖類化合物在負電離條件下對質(zhì)譜儀進行校正，進而獲取氟代單磷酸產(chǎn)物的分子負離子以及由此產(chǎn)生的特定負離子碎片，由該譜圖唯一地確定腫瘤細胞代謝氟代單磷酸產(chǎn)物。
氟代單磷酸代謝產(chǎn)物與正常代謝的單磷酸代謝產(chǎn)物之比值消除整個鑒定過程中的累積誤差，唯一地表征了所捕獲腫瘤細胞的惡性增殖程度。
氟代化合物，如3’-脫氧-3’-氟代-胸腺嘧啶核苷(FLT)，其磷酸化產(chǎn)物阻礙DNA合成，不參與腫瘤細胞的代謝，從而累積于細胞內(nèi)形成有利腫瘤細胞鑒定的高濃度，提高質(zhì)譜檢測可靠性，降低或消除假陽性。
腫瘤細胞內(nèi)氟代磷酸衍生物與正常代謝相應的磷酸衍生物，二者經(jīng)標準化后的細胞攝取相對比值，消除測定過程中的系統(tǒng)誤差，真實地反映了細胞內(nèi)相關激酶的表達水平及活性。
串級質(zhì)譜鑒定法以四極桿-時間飛行串級質(zhì)譜儀為例。對不同檢測精度，高通量篩選，質(zhì)譜分辨率組合的串級質(zhì)譜儀還包括碳18反相高效液相色譜偶合四極桿-四極桿串級質(zhì)譜儀，飛行時間-飛行時間串級質(zhì)譜儀，四極桿-富利葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀。其中作為質(zhì)譜分折器的四極桿可由離子阱替代。
負離子質(zhì)譜測定細胞內(nèi)磷酸化代謝產(chǎn)物，除使用電噴霧負離子源外，還可由基質(zhì)扶助激光解吸電離源獲得有關負離子進行質(zhì)譜鑒定。
以D-(+)-棉子糖及其碎片產(chǎn)物負離子系列，對TOF質(zhì)譜分折器的有效飛行距離及有關磷酸衍生物實驗測定范圍(100-550Da)進行校正。
周血系統(tǒng)循環(huán)腫瘤細胞的分離可由精密控制的商品直經(jīng)為8微米的膜分離器進行，所得細胞吸收FLT后，進行串級質(zhì)譜鑒定。
周血系統(tǒng)循環(huán)腫瘤細胞的分離還可由商品Ficoll-Paque離心分離獲得，所得細胞吸收FLT后，進行串級質(zhì)譜鑒定。
周血系統(tǒng)循環(huán)腫瘤細胞芯片鑒定為經(jīng)微流控抗體富聚后，再偶合串級質(zhì)譜儀，于微流控出口引入電噴霧裝置，與串級質(zhì)譜儀離子源電極形成引導測定代謝磷酸衍生物的完整裝置。微流控由識別表皮細胞特征生物標記蛋白的抗體及鉑金電極組成，作為串級質(zhì)譜儀負電離電噴霧離子源。
周血系統(tǒng)循環(huán)腫瘤細胞可由簡單的負向富聚技術獲取即大量的紅細胞經(jīng)商品溶劑選擇性地降解、清除。而腫瘤細胞則附著于膠原蛋白載體，經(jīng)吸收FLT后，進行串級質(zhì)譜鑒定。
單獨或組合提取捕獲腫瘤細胞后，相關淬取磷酸衍生物的溶劑乙腈-水(50％)為最佳高通量測定溶劑。碳18反相高效液相色譜分離的最佳淬取溶劑為乙腈-水(2％)。其它乙腈替代有機溶劑，如甲醇，也可取得類似結果。
所述氟代化合物不限于DNA合成特定的FLT，還包括其它氟代化合物。包括抑制、損壞DNA及RNA合成的5-氟尿嘧啶(5-FU)以及細胞能量代謝的2’-氟代-2’-脫氧葡萄糖(FDG)。以上三種氟代化合物的單一或組合使用，均可在激酶作用下生成磷酸化代謝產(chǎn)物，遵循本專利規(guī)范的生化原理及基本操作流程，以質(zhì)譜法測定其磷酸化代謝產(chǎn)物，鑒定腫瘤細胞。
所述微流控電噴霧離子源，如權利要求十二所述溶血負向富聚技術，權利要求十四所述三種氟代合物的單一或組合的生化試劑、組合配套構成的循環(huán)腫瘤細胞診斷測試盒，可用于鄉(xiāng)、縣級衛(wèi)生所進行當?shù)伢w外腫瘤普查及建立個體化腫瘤信息。捕獲腫瘤細胞由串級質(zhì)譜中心評估診斷、治療效果。
本發(fā)明提出的CTCs鑒定基于以下原理A.鑒定基礎為捕獲生存細胞惡性增殖程度，具體以腫瘤細胞增殖過程中DNA的合成直接相關的激酶TK1為例詳述；B.FLT分子結構中3’取代基氟具有穩(wěn)定分子免遭細胞內(nèi)降解，以及中止進一步DNA的合成代謝雙重作用，導致細胞內(nèi)的累積，并由此提高質(zhì)譜鑒定的可靠性，降低CTCs的檢測假陰性。此外氟具有最小原子半經(jīng)，因此為TK1的理想非天然基質(zhì)；C.FLT-5’-MP的磷酸根所攜帶負電荷為負離子質(zhì)譜檢測提供了電離基團及離子特征碎片；D.與天然胸苷-5’-單磷酸(胸苷-5’-MP)衍生物的細胞攝取比值，消除測定過程中的系統(tǒng)誤差，真實地反映了CTCs增殖過程中TK1的表達水平。C.負離子電噴霧源四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀的高靈敏、高分辨提供了結構確認的唯一性，以及對TK1活性的準確質(zhì)譜定量。上述基于CTCs惡性增殖的質(zhì)譜鑒定法顯然優(yōu)于FDA認可的細胞生物標記物組合鑒定法，即CD45-/DAPI+/CK+的熒光組合鑒定法。
(3-2)質(zhì)譜檢測FLT-5’-MP衍生物結構的優(yōu)勢 穩(wěn)定同位素氟置換3’位的羥基對本專利發(fā)展的質(zhì)譜測定方法有以下三點結構優(yōu)勢A.防止糖單元從胸苷單元降解，導致細胞內(nèi)FLT的高穩(wěn)定性；B.FLT對細胞介質(zhì)TK1的選擇優(yōu)于對線粒體內(nèi)的TK2，而只有TK1與細胞增殖期有關；C.3’-氟取代基團阻止了DNA的合成，因此累積于細胞介質(zhì)中。
(3-3)測定CTCs的負離子電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀 所有待分折分子首先需在離子源進行電離。對于測定CTCs的上述物質(zhì)對的標準吸收比值而言，即FLT-5’-MP與相應的胸苷-5’-MP的吸收比值。該對磷酸衍生物帶有負電荷的磷酸根，在無需任何添加物，體積比為50％乙腈-水混合液中，直接施與1,600V電壓，用穩(wěn)定的注射泵，于20-100nl/min的流量，經(jīng)由直經(jīng)為10μm的電噴霧針頭于常溫常壓下，形成穩(wěn)定的羽狀電噴霧。帶負電離子經(jīng)90度角方向的錐形離子入口，于35V電壓下引入第一級四極桿質(zhì)譜過濾器。該過程即特殊的“Z-電噴霧”。中性分子、正離子等雜質(zhì)背景信號得予改善。本文采應同位素12C＝12.0000Da進行具有確定元素組成負離子的m/z的單一同位素質(zhì)量計算。
(3-4)低分子量負離子質(zhì)譜儀的校正 由于磷酸化的FDG與FLT均屬于帶負電荷的小分子。飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀的測量精度隨溫度以及質(zhì)譜儀內(nèi)部元件表面化合物的沉積而發(fā)生變化。室溫變化1℃通常導致50mDa的測定誤差。這就要求對飛行時間分折器進行有效飛行距離以及100-500Da低分子量的負離子動態(tài)范圍進行校正。本申請采用木棉塘的負離子分子及其負離子碎片完成上述二項校正。上述各型質(zhì)譜儀主要用于生物聚合物的鑒定。如蛋白質(zhì)組學中對多肽的氨基酸序列的鑒定，通常以正離子電離方式在較大的分子量范圍測定，如150-1500Da。而FLT-5’-MP與相應的胸苷-5’-MP分子結構及產(chǎn)物碎片負離子范圍125-323Da小分子范圍內(nèi)。此范圍存在較多的溶劑加合離子的雜質(zhì)干擾，測量精度也受室溫影響。因此對串級Q-TOF的校正極為重要。本申請專利以D-(+)-棉子糖及其碎片產(chǎn)物負離子糸列，對TOF的有效飛行距離及上述實驗測定范圍以三次方程進行校正。
本發(fā)明首次提出分離富聚后生存循環(huán)腫瘤細胞的黃金鑒定法，該方法不受腫瘤細胞體內(nèi)發(fā)展，轉(zhuǎn)移，手術，放療及化療過程中基因型-表現(xiàn)型生物標記物變異的影響。以串級質(zhì)譜儀測定腫瘤細胞增殖過程中特征代謝化合物，準確地反映了腫瘤細胞增殖周期的惡性程度與外周血正常細胞的本質(zhì)區(qū)別。



圖1是串級質(zhì)譜測定腫瘤細胞DNA增殖原理示意圖。
圖中通過DNA補救合成途徑進入細胞介質(zhì)的高濃度FLT，在胸苷激酶(TK1)作用下生成FLT-5’-MP洐生物。并進一步與其DP洐生物，TP洐生物，且形成動態(tài)平衡。但以MP洐生物為主要成份(70％)。由于氟在戊糖3’位取代，DNA合成由此中斷，導致FLT-5’-MP洐生物累積于細胞內(nèi)。而胸苷激酶在腫瘤細胞的生長周期的G1/S階段合成上升可達10至20倍，作為酶基質(zhì)磷酸化的FLT-5’-MP洐生物唯一地表征腫瘤的惡性增殖程度。同時帶負電的磷酸根為負電子噴霧串級質(zhì)譜的測定提供了高靈敏結構測定基礎。
圖2是腫瘤細胞鑒定的特異性結構圖。
圖中細胞增殖周期S階段高表達胸苷激酶(TK1)對戊糖5’的磷酸化反應的代謝產(chǎn)物FLT-5’-MP相對于胸苷-5’-MP的標準化吸收比值唯一地表征了腫瘤細胞的增殖屬性。FLT-5’-MP洐生物與正常代謝的胸苷-5’-MP洐生物分子濃度標準化吸收比值消除實驗中產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差，唯一地反映腫瘤細胞增殖的生化特征。
圖3是用于校正質(zhì)譜儀的D-(+)-棉子糖及其碎片產(chǎn)物負離子系列計算值圖。
圖中分子負離子計算值，[M-H]＝503.1612，根據(jù)實驗觀測值用于TOF分折器的有效飛行距離的校正。并以其碎片負離子于實驗100-550Da測定范圍內(nèi)進行三次方程對質(zhì)譜儀進行校正。
圖4是FLT-5’-MP的分子結構負離子裂解機理圖。
圖中分子負離子m/z＝323.04；胸腺嘧啶負離子m/z＝125.05；3’-氟代-脫氧核糖-5’-單磷酸負離子m/z＝197.03；以及由m/z＝197.03失去中性分子HF(20Da)的脫氧核糖-5’-單磷酸負離子m/z＝177.02。
圖5是乳腺癌細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP的質(zhì)譜實驗值圖。
圖中實驗值m/z 323.00及m/z 321.16表明質(zhì)量差為2Da表明FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP的分子負離子，此為該對分子結構的第一判斷。帶有結構確認的碎片負離子3’-脫氧-3’-氟代-核糖-5’-單磷酸負離子與相應的脫氧核糖-5’-單磷酸負離子對的實驗測定質(zhì)分別為m/z 196.96與m/z 194.99，該對碎片負離子進一步確定核糖-3’位上取代基的質(zhì)量差別(2Da)19氟(19Da)與羥基(17Da)。碎片負離子m/z 176.98是由3’-脫氧-3-氟代-核糖-5’-單磷酸負離子(m/z 196.96)失去中性分子HF(20Da)以及脫氧核糖-5’-單磷酸負離子失去中性分子H2O(18Da)的共同結果。碎片負離子m/z 125.02為FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP分子結構的共同特征，即胸腺嘧啶負離子，與核糖3’取代基無關。
圖6是乳腺癌細胞與正常人體全血細胞對FLT的吸收對比示意圖。
Y軸FLT-5’-MP洐生物與正常代謝的胸苷-5’-MP洐生物分子吸收比值；X軸細胞培養(yǎng)液中FLT的濃度測定范圍。FLT的補救合成及代謝產(chǎn)物由TK1的表達控制，即與細胞增殖惡性程度相關。
圖7是乳腺癌細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP的吸收比值示意圖。
圖中累積于細胞內(nèi)的FLT-5’-MP相對于胸苷-5’-MP的比值達70，為正常全血細胞比值(約0.5)的上百倍。從而降低循環(huán)腫瘤細胞鑒定的假陽性。
圖8是單克隆抗體芯片與串級質(zhì)譜儀對接示意圖。
圖中新穎結構部件1，孔徑0.22微米芯片出口膜過濾器、2聯(lián)接芯片鉑金電極，PicoTip噴霧發(fā)射針及芯片出口毛細管采用死體積為零的T型聚四氟乙烯三通、3，PicoTip噴霧發(fā)射針內(nèi)徑為10微米，在20-75納升/分鐘流量，室溫，1,600伏電壓條件下，乙腈-水(50％)形成羽狀電噴霧，無需氮氣輔助。
具體實施方式
下面結合附圖進一步說明本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果。
實施例1細胞培養(yǎng)及質(zhì)譜定性 將ATCC獲取的乳腺癌細胞MCF-7置于含有10％的牛胎血清RPMI1640培養(yǎng)液中。培養(yǎng)箱空氣二氧化碳的含量為5％，溫度37℃。每兩天更換一次培養(yǎng)液，當培養(yǎng)細胞達70％的單細胞融合度后，細胞培養(yǎng)更換為分別含F(xiàn)LT濃度為0.01，0.05，0.1，0.5，1，1.5mM的培養(yǎng)液。細胞于溫度37℃下攝取FLT，時間1小時。以PBS清洗細胞后，加入0.05％胰蛋白酶并保持于37℃約10分鐘。于5000g離心2分鐘回收脫落細胞，并將底部細胞小餅重懸浮于1ml的PBS中，輕微震蕩清洗后置于1.5ml的erppendorf離心管中。重復PBS清洗、5000rpm離心回收三次。加入體積比為50％乙腈-水細胞溶解液100微升于細胞小餅中，激烈震蕩5秒后，置于超聲波2分鐘。細胞經(jīng)三次-78℃深凍與4℃解凍后，于14,000rpm離心2分鐘，回收上層清洗并經(jīng)孔徑為0.22微米膜過濾。另一方面，于EDTA收集管采集的健康自愿者的全血100微升用于以上不同濃度FLT的對照實驗。經(jīng)處理的乳腺癌細胞及全血FLT攝取直接用于串級Q-TOF定性定量測定。
FLT對DNA合成過程的抑制機理參見圖-1。作為DNA合成的基本單元，胸苷-5’-MP衍生物可由細胞內(nèi)脫氧尿苷單磷酸在胸苷酸合酶作用下獲得，即細胞內(nèi)從頭合成途徑；或者攝取細胞外胸苷的補救合成途徑。作為磷酸基團施主的ATP，其細胞內(nèi)具較高的mM水平的生理濃度，因此，本專利采用磷酸基團受主濃度為1mM的FLT作為對CTCs測定。以期取得對極少量CTCs達到更靈敏的檢測極限。圖-2表明細胞增殖周期S階段高表達激酶TK1對戊糖5’的磷酸化反應的代謝產(chǎn)物FLT-5’-MP的理論計算為m/z＝323.04，胸苷-5’-MP的理論計算為m/z＝321.05。該對化合物的標準化吸收比值唯一地表征了腫瘤細胞的增殖屬性。獲得對細胞內(nèi)該對化合物的精確測定之前，需要以D-(+)-棉子糖對串級質(zhì)譜儀在小分子負離子范圍內(nèi)進行校正。D-(+)-棉子糖的負電離碎片產(chǎn)物的單一同位素計算值參見圖-3，其中負分子離子m/z＝503.1612，碎片負離子C6H11O6m/z＝179.0556，碎片負離子C8H13O7m/z＝221.0661，碎片負離子C10H19O9m/z＝281.0873，碎片負離子C12H20O10m/z＝323.0978作為校正內(nèi)標。當D-(+)-棉子糖的濃度為5ng/μl時，TOF的有效飛行距離實測值為503.161+/-0.05Da。小分子實驗測定范圍由D-(+)-棉子糖的分子負離子及電離碎片上述產(chǎn)物糸列的實測值與理論計算值之間的殘余誤差分布小于10mDa作為通過校正的標準。
經(jīng)校正的質(zhì)譜儀可實施上述相關代謝物的測定。四極桿質(zhì)譜過濾器根據(jù)負離子FLT-5’-MP與相應的胸苷-5’-MP的質(zhì)-電荷比，導入四極桿碰撞單元。在此由高純氬氣于22V電壓下，與負離子m/z＝323.04及m/z＝321.05發(fā)生碰撞，形成碎片產(chǎn)物離子。碎片產(chǎn)物離子的信號強度由第二級飛行時間質(zhì)譜分折器準確測定。FLT 5’-MP的負離子系列理論計算值參見圖-4分子負離子m/z＝323.04；胸腺嘧啶負離子m/z＝125.05；3’-氟代-脫氧核糖-5’-單磷酸負離子m/z＝197.03；以及由m/z＝197.03失去中性分子分子量為20Da的HF，即脫氧核糖-5’-單磷酸負離子m/z＝177.02。與此負離子系列相應的胸苷-5’-MP結構為脫氧核糖-5’-單磷酸負離子m/z＝195.03。需要指出的是3’-氟代-脫氧核糖-5’-單磷酸負離子m/z＝197.03與脫氧核糖-5’-單磷酸負離子m/z＝195.03的質(zhì)量差為2Da。此2Da的質(zhì)量差由核糖3’位質(zhì)量17Da羥基為質(zhì)量19Da氟原子取代所致。圖-5顯示FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP的質(zhì)譜實驗測定值。m/z 323.00及m/z 321.16質(zhì)譜對表明質(zhì)量差為2Da的FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP的分子負離子，此為結構確認的第一判斷。帶有結構確認的碎片負離子3’-脫氧-3’-氟代-核糖-5’-單磷酸負離子與相應的脫氧核糖-5’-單磷酸負離子對的實驗測定質(zhì)分別為m/z 196.96與m/z 194.99，該對碎片負離子進一步確定核糖-3’位上取代基的質(zhì)量為2Da差別19氟(19Da)與羥基(17Da)之差。碎片負離子m/z 176.98是由3’-脫氧-3’-氟代-核糖-5’-單磷酸負離子(m/z 196.96)失去中性分子HF(20Da)以及脫氧核糖-5’-單磷酸負離子失去中性分子H2O(18Da)的共同結果。最后，碎片負離子m/z 125.02為FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP分子結構的共同特征，即胸腺嘧啶負離子，與核糖3’取代基無關。所有觀測到的質(zhì)譜特征無疑證實FLT在腫瘤細胞中為TK1在核糖5’羥基發(fā)生磷酸化反應。表1為FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP的Q-TOF計算值與測定值對比結果。
表1.FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP分子結構的Q-TOF串級質(zhì)譜鑒定 FLT-5’-MP 胸苷-5’-MP 實施例2細胞培養(yǎng)及質(zhì)譜定量 上述乳腺癌細胞MCF-7與新鮮采集的健康人體靜脈全血對FLT的攝取對比實驗按實施例1條件進行。鑒定CTCs對FLT的攝取條件的選擇基礎為A，由于ATP mM的細胞內(nèi)高濃度，因此FLT的培養(yǎng)液濃度上限設為1.5mM。B，F(xiàn)LT的代謝研究表明FLT攝取于60分鐘達峰值，并繼續(xù)保持2小時。C，F(xiàn)LT磷酸洐生物的細胞內(nèi)分布以FLT-5’-MP為主，約占70％。D，培養(yǎng)液高濃重的FLT有利于“補救合成途徑”，即乳腺癌細胞中高濃度的TK1。E，F(xiàn)LT-5’-MP并非脫氧核糖核酸酶的良好基質(zhì)化合物，即核糖5’位去磷酸化相對緩慢。F，F(xiàn)LT-5’-MP的磷酸根負電荷阻礙其由細胞內(nèi)向細胞外的擴散。標準化吸收比值m/z 323.04m/z 321.05，即FLT-5’-MP胸苷-5’-MP的比值表征TK1對該對化合物的選擇性及核糖5’位羥基的磷酸化反應。表達了二者在細胞內(nèi)的相對定量關系FLT-5’-MP于細胞內(nèi)中止代謝，累積形成高濃度，而胸苷-5’-MP處于正常代謝，保持動態(tài)低濃度。FLT的徑由補救合成途徑的凈吸收劑量關系，此種吸收差異完全由TK1隨腫瘤細胞的增殖而唯一確定。因此，標準化吸收比值表征了腫瘤細胞的的增殖程度。本法與FDA批準的CTCs當今流行的腫瘤細胞熒光組合鑒定法截然不同。乳腺癌細胞的標準化吸收比值隨初始劑量為0.001mM的0.6增加到1mM劑量的70，參見圖-6。即兩個數(shù)量級的增加。與此相反，新鮮抽取的健康全血細胞在同樣FLT培養(yǎng)液的條件下，其標準化吸收比值＜1。即正常全血細胞由TK1支配的補救合成途徑在實驗條件下活性效果幾乎為零。圖-7表明質(zhì)譜測定的標準化吸收比值m/z 322.99m/z 320.98即FLT-5’-MP胸苷-5’-MP的比值準確靈敏地反映了腫瘤細胞的惡性程度。
實施例3循環(huán)腫瘤細胞溶血反向富聚串級質(zhì)譜鑒定法 新鮮采集一期乳腺癌病人10毫升靜脈血收集于含EDTA試管中并于8小時內(nèi)實施紅細胞溶血降解。商品氯化銨紅細胞溶血降解緩沖液組成155mM氯化銨、10mM KHCO3、0.1mM EDTA，pH＝7.4，50毫升。將溶血降解緩沖液預熱至室溫并置于100毫升離心管中，將收集的2毫升靜脈血加入，上蓋密封。于搖動盤上輕盈溶血10分鐘左右。將離心管于室溫下，于300g離心分離5分鐘，去降上層紅色懸浮液。于離心管底部應獲得白細胞與腫瘤細胞沉降物，若仍有分層可重復上述步驟。將沉降物重溶于0.5毫升PBS/EDTA溶液，EDTA的濃度為2mM。加入內(nèi)表面涂有膠原蛋白的96孔細胞培養(yǎng)皿，于37℃過夜附著。經(jīng)PBS/EDTA洗滌后，加入含有1mM FLT的RPMI1640培養(yǎng)液0.5毫升，靜置于37℃培養(yǎng)箱1小時。經(jīng)PBS洗滌，加入體積比為50％乙腈-水細胞溶解液100微升提取相關磷酸衍生物。并遵照實施例1所述進行循環(huán)腫瘤細胞串級質(zhì)譜鑒定。本法選擇性地對紅細胞進行溶血降解，保留完整的白細胞及腫瘤細胞，即對紅細胞進行負向富聚。精密質(zhì)譜測定的標準化吸收比值m/z 323.04m/z 321.05大于5為確診。
實施例4循環(huán)腫瘤細胞過濾分離串級質(zhì)譜鑒定法 聚碳酸酯(polycarbonate)膜過濾分離循環(huán)腫瘤細胞基于精密加工的膜孔直徑。周血循環(huán)糸統(tǒng)中體積較大的表皮腫瘤細胞可與體積較小的血液正常細胞分離。新鮮采集體積為2毫升一期乳腺癌病人全血經(jīng)相同體積PBS/EDTA稀釋后，過Millipore Isopore商品膜分離器。膜直徑13毫米，孔直徑8微米，8-20％孔徑誤差。稀釋全血可于5分鐘左右通過分離器，而循環(huán)腫瘤細胞留于分離器內(nèi)。經(jīng)兩次體積為7.5毫升PBS/EDTA洗滌后，加入含有濃度為1mM FLT的RPMI 1640培養(yǎng)液1毫升，靜置于37℃培養(yǎng)箱1小時。經(jīng)PBS洗滌并離心分離后，加入1毫升體積比為50％乙腈-水，超聲波2分鐘后置于-80℃。細胞溶解液徑-80℃深凍4℃解凍后回收于eppendorf離心管，徑14,000rpm離心2分鐘，上層清洗轉(zhuǎn)入另一eppendorf離心管。置于-80℃深凍后，于室溫下Speed-Vac至干。重溶于50微升體積比為50％乙腈-水后，于Q-TOF測定標準化吸收比值。精密質(zhì)譜測定的標準化吸收比值m/z 323.04m/z 321.05大于5為確診。
實施例5循環(huán)腫瘤細胞離心分離串級質(zhì)譜鑒定法 本方法基于商品化的分離CTCs的產(chǎn)品RosetteSep。將350微升RosetteSep離心液加入新鮮采集體積為7.5毫升一期乳腺癌病人全血，混勻，置于室溫20分鐘。用7.5毫升PBS稀釋后，輕勻。將稀釋后全血均勻置于Ficoll-Paque 50毫升離心管上部，仔細盡量避免兩者互混。室溫下1200g離心分離20分鐘。離心前關閉離心機止動剎閘。在Ficoll-Paque與血清界面回收富聚后的腫瘤細胞，并以1毫升PBS于enppendorf離心管清洗兩次。加入含有濃度為1mM FLT的RPMI 1640培養(yǎng)液1毫升，靜置于37℃培養(yǎng)箱1小時。經(jīng)PBS 7.5毫升洗滌后。加入1毫升體積比為50％乙腈-水，超聲波2分鐘后置于-80℃。細胞溶解液徑-80℃深凍4℃解凍后回收于eppendorf離心管，徑14,000rpm離心2分鐘，上層清洗轉(zhuǎn)入另一eppendorf離心管。置于-80℃深凍后，于室溫下Speed-Vac至干。重溶于50微升體積比為50％乙腈-水后，于Q-TOF測定標準化吸收比值。精密質(zhì)譜測定的標準化吸收比值m/z323.04m/z 321.05大于5為確診。
實施例6循環(huán)腫瘤細胞微流控富聚串級質(zhì)譜鑒定法 改進后的微流控芯片及附帶含1mM FLT的RPMI 1640培養(yǎng)液試劑，可用于鄉(xiāng)、縣級衛(wèi)生所及醫(yī)院腫瘤檢測的方法，經(jīng)處理后的芯片郵寄至質(zhì)譜中心后，于芯片出口組裝一次性電噴霧裝置進行標準化吸收比值的測定。微流控芯片制作結構為改進的Adams裝置，優(yōu)點是對1毫升未經(jīng)處理的一期乳腺癌病人全血經(jīng)37分鐘后完成CTCs的捕獲，該裝置采用嵌入鉑金電極可作為質(zhì)譜儀離子源電極。圖8為識別EpCAM芯片與串級質(zhì)譜儀對接示意圖。其中改進后的關鍵部件包括1，芯片出口孔徑為0.22微米膜過濾器、2聯(lián)接芯片外鉑金電極，PicoTip噴霧發(fā)射針及芯片出口毛細管的死體積為零的T型三通、3，PicoTip噴霧發(fā)射針口內(nèi)徑為10微米，在納升/分鐘流量室溫條件下形成羽狀電噴霧，無需氮氣輔助?；厥崭痪酆蟮哪[瘤細胞，以PBS(0.5毫升)清洗兩次。通入含有1mM FLT的RPMI 16400.5毫升培養(yǎng)液1小時。經(jīng)0.5毫升的PBS洗滌后，通入0.5毫升體積比為50％乙腈-水置換PBS，芯片經(jīng)超聲波2分鐘后可進行串級質(zhì)譜儀對接。本方法在Adams裝置的基礎上，在其微流控芯片出口引入一次性電噴霧裝置(PicoTip emitter，部件號FS360-20-10-D-20-C7，New Objective，Woburn，MA.USA)。電噴霧裝置為外徑20微米，發(fā)射空心針頭內(nèi)徑為10微米。微流控芯片出口由絕緣塑膠密封。鉑金電極與Q-TOF離子源電極于1,600伏電壓下，形成羽狀電噴霧，從而在高靈敏狀態(tài)下對帶負電磷酸化的-FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP的標準化吸收比值進行相對定量測定。精密質(zhì)譜測定的標準化吸收比值m/z 323.04m/z 321.05大于5為確診。
權利要求
1.一種氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，其特征在于
(1)對外周血循環(huán)系統(tǒng)中生存腫瘤細胞的捕獲，捕獲過程分為單克隆抗體從大量紅細胞中識別極微量的腫瘤細胞的正富集過程，經(jīng)由降解紅細胞的負富集方法，以及過濾、離心等基于腫瘤細胞密度、大小的物理分離法；
(2)在細胞培養(yǎng)條件下，迫使所捕獲的生存腫瘤細胞以補救合成途徑攝取氟代化合物；
(3)對腫瘤細胞代謝產(chǎn)生并積累于細胞介質(zhì)中的氟代單磷酸產(chǎn)物進行電噴霧負離子串級質(zhì)譜鑒定。
2.根據(jù)權利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，其特征在于為獲得準確鑒定結果，首先采用已知糖類化合物在負電離條件下對質(zhì)譜儀進行校正，進而獲取氟代單磷酸產(chǎn)物的分子負離子以及由此產(chǎn)生的特定負離子碎片，由該譜圖唯一地確定腫瘤細胞代謝氟代單磷酸產(chǎn)物。
3.根據(jù)權利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，其特征在于氟代單磷酸代謝產(chǎn)物與正常代謝的單磷酸代謝產(chǎn)物之比值消除整個鑒定過程中的累積誤差，唯一地表征所捕獲腫瘤細胞的惡性增殖程度。
4.根據(jù)權利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，其特征在于氟代化合物，如3’-脫氧-3’-氟代-胸腺嘧啶核苷(FLT)，其磷酸化產(chǎn)物阻礙DNA合成，不參與腫瘤細胞的代謝，從而累積于細胞內(nèi)形成有利腫瘤細胞鑒定的高濃度，提高質(zhì)譜檢測可靠性，降低或消除假陽性。
5.根據(jù)權利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，其特征在于腫瘤細胞內(nèi)氟代單磷酸衍生物與正常代謝相應的單磷酸衍生物，二者經(jīng)標準化后的細胞攝取相對比值，消除測定過程中的系統(tǒng)誤差，反映細胞內(nèi)相關激酶的表達水平及活性。
6.根據(jù)權利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，其特征在于串級質(zhì)譜鑒定法以四極桿-時間飛行串級質(zhì)譜儀為例，對不同檢測精度，高通量篩選，質(zhì)譜分辨率組合的串級質(zhì)譜儀還包括碳18反相高效液相色譜偶合四極桿-四極桿串級質(zhì)譜儀，飛行時間-飛行時間串級質(zhì)譜儀，四極桿-富利葉變換離子迴旋共振質(zhì)譜儀，其中作為質(zhì)譜分折器的四極桿可由離子阱替代。
7.根據(jù)權利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，其特征在于負離子質(zhì)譜測定細胞內(nèi)磷酸化代謝產(chǎn)物，除使用電噴霧負離子源外，還可由基質(zhì)扶助激光解吸電離源獲得有關負離子進行質(zhì)譜鑒定。
8.根據(jù)權利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，其特征在于以D-(+)-棉子糖及其碎片產(chǎn)物負離子系列，對TOF質(zhì)譜分折器的有效飛行距離及有關磷酸衍生物實驗測定范圍(100-550Da)進行校正。
9.根據(jù)權利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，其特征在于周血系統(tǒng)循環(huán)腫瘤細胞的分離可由精密控制的商品直經(jīng)為8微米的膜分離器進行，所得細胞吸收FLT后，進行串級質(zhì)譜鑒定。
10.根據(jù)權利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，其特征在于周血系統(tǒng)循環(huán)腫瘤細胞的分離還可由商品Ficoll-Paque離心分離獲得，所得細胞吸收FLT后，進行串級質(zhì)譜鑒定。
11.根據(jù)權利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，其特征在于周血系統(tǒng)循環(huán)腫瘤細胞芯片鑒定為經(jīng)微流控抗體富聚后，再偶合串級質(zhì)譜儀，于微流控出口引入電噴霧裝置，與串級質(zhì)譜儀離子源電極形成引導測定代謝磷酸衍生物的完整裝置。微流控由識別表皮細胞特征生物標記蛋白的抗體及鉑金電極組成，作為串級質(zhì)譜儀負電離電噴霧離子源。
12.根據(jù)權利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，其特征在于周血系統(tǒng)循環(huán)腫瘤細胞可由簡單的負向富聚技術獲取即大量的紅細胞經(jīng)商品溶劑選擇性地降解、清除。而腫瘤細胞則附著于膠原蛋白載體，經(jīng)吸收FLT后，進行串級質(zhì)譜鑒定。
13.根據(jù)權利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，其特征在于單獨或組合提取捕獲腫瘤細胞后，相關淬取磷酸衍生物的溶劑乙腈-水(50％)為最佳高通量測定溶劑，碳18反相高效液相色譜分離的最佳淬取溶劑為乙腈-水(2％)。
14.根據(jù)權利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，其特征在于氟代化合物不限于DNA合成特定的FLT，還包括其它氟代化合物，包括抑制、損壞DNA及RNA合成的5-氟尿嘧啶(5-FU)以及細胞能量代謝的2’-氟代-2’-脫氧葡萄糖(FDG)，以上三種氟代化合物的單一或組合使用，均在激酶作用下生成磷酸化代謝產(chǎn)物，以質(zhì)譜法測定其磷酸化代謝產(chǎn)物，鑒定腫瘤細胞。
全文摘要
一種氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細胞中的應用方法，它包括對外周血循環(huán)系統(tǒng)中生存腫瘤細胞的捕獲，捕獲過程分為單克隆抗體從大量紅細胞中識別極微量的腫瘤細胞的正富集過程，經(jīng)由降解紅細胞的負富集方法，以及過濾、離心等基于腫瘤細胞密度、大小的物理分離法；在細胞培養(yǎng)條件下，迫使所捕獲的生存腫瘤細胞以補救合成途徑攝取氟代化合物；對腫瘤細胞代謝產(chǎn)生并積累于細胞介質(zhì)中的氟代單磷酸產(chǎn)物進行電噴霧負離子串級質(zhì)譜鑒定；本發(fā)明首次提出分離富聚后生存循環(huán)腫瘤細胞周期的黃金鑒定法，該方法以串級質(zhì)譜儀測定腫瘤細胞增殖過程中特征代謝化合物，準確地反映了腫瘤細胞增殖周期的惡性程度與外周血正常細胞的本質(zhì)區(qū)別。
文檔編號G01N30/72GK101769930SQ20101003913
公開日2010年7月7日 申請日期2010年1月8日 優(yōu)先權日2010年1月8日
發(fā)明者盧小明 申請人:盧小明