體裝置放置在倒置顯微鏡（Olympus X71)中，并用通道末端 附近的Phantom V9.1攝像頭（Vision Research Inc. USA)捕捉焚光圖像。通過(guò)用DI水 稀釋不同尺寸的1%固體焚光顆粒（Bangs Laboratories, Inc. USA)來(lái)制成輸入樣品，并用 NE-1000注射泵（New Era Pump Systems, Inc. USA)在不同流率下將其泵入通道中，以觀察 聚集位置。為了評(píng)價(jià)裝置的分離質(zhì)量，混合更高濃度的兩種不同尺寸的顆粒。
[0126] 結(jié)果與討論
[0127] 圖10A示出了從頂部觀察的不同尺寸的顆粒隨著流率增加而形成的聚集條帶。這 些結(jié)果清楚地示出了這樣的分離原理，即，在不同流率下不同尺寸的顆粒流從內(nèi)壁（慣性 狀態(tài)）迀移至外壁（迪恩狀態(tài)）。例如，對(duì)于梯形橫截面，在1.5mL/min的流率下，可通過(guò) 從內(nèi)出口和外出口進(jìn)行收集來(lái)從更小顆粒中分離直徑>15. 5 μπι的顆粒。在同一通道中，將 流率增加至2. 5mL/min使得能夠從更小顆粒分離直徑>26. 25 μ m的顆粒。相比之下，在矩 形通道中，雖然在一定流率下不同尺寸的顆粒傾向于在通道的不同位置聚集，但是它們之 間的距離太小，并且如果顆粒/細(xì)胞濃度高的話，則其可能被污染，限制了處理高血細(xì)胞比 容細(xì)胞樣品的能力。圖IlA至圖IlC示出了在最優(yōu)流率3. 4mL/min下對(duì)兩種不同尺寸的顆 粒（16. 68 μπι和26. 9 μπι)的分離效率。兩個(gè)出口收集物的純度都超過(guò)96%，同時(shí)還可達(dá) 到8. 85 X IO6Aiin的通量，這是1. 33 %的體積對(duì)體積濃度（等于血液樣品中的血細(xì)胞比容 數(shù)）。
[0128] 以前，顆粒被認(rèn)為聚集在螺旋慣性微流通道的通道深度的中心處，這是因?yàn)樵谕?道橫截面的中心區(qū)域處迪恩阻力其中U f是平均流速度）和慣性力CFiOCt//63) 占優(yōu)勢(shì)，而離心力(仄ocV/)被忽略。但是根據(jù)圖IOB示出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顆粒在兩個(gè)不同的 深度處聚集。數(shù)值模擬表示，在不同流率下，迪恩流場(chǎng)的分布僅發(fā)生較小改變，并且最大迪 恩流速度總是出現(xiàn)在深度方向的中心。在顆粒聚集的位置（通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其處于零迪恩線 和零升力線之間）處，F(xiàn)d主要指向內(nèi)壁，并且遠(yuǎn)小于最大迪恩力。在這樣的情況下，不能忽 略Fc〇
[0129] 圖12示出了在通道橫截面中的不同位置處作用于顆粒上的力。在位置#2,所有的 力都沿著通道寬度方向，但是沿通道深度方向的輕微干擾都將使!V變化方向并增加大小， 這使得該點(diǎn)成為不穩(wěn)定的平衡點(diǎn)。位置#3是低流率（0.5mL/min)下的穩(wěn)定力平衡點(diǎn)。隨 著流率增加，^比F d增大更快，并且顆粒平衡點(diǎn)將不得不向頂壁或底壁移動(dòng)，這種移動(dòng)增大 了 Fd的分力從而平衡掉了所增大的Fe (位置#1)。如果流率繼續(xù)升高，F(xiàn)。將占優(yōu)勢(shì)，并且沒(méi) 有其它力能側(cè)向地與其平衡，因此顆粒將移動(dòng)至外側(cè)，并最終將由于該處的強(qiáng)迪恩流而陷 于中心漩渦之一（位置#4)。因?yàn)樗械牧Χ寂c顆粒的尺寸相關(guān)，所以使它們從位置#1迀 移至位置#4的流率是與尺寸相關(guān)的，這使得尺寸基分離成為可能。
[0130] 結(jié)論
[0131] 已經(jīng)開(kāi)發(fā)了梯形橫截面螺旋微流通道將其用于尺寸基顆粒分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示出， 該通道能夠?qū)崿F(xiàn)高分辨率和高通量的細(xì)胞分離。在3. 4mL/min的流率下，以超過(guò)96%的效 率成功地在1. 33%濃度的16. 68 μπι顆粒和26. 9 μπι顆粒之間成功地進(jìn)行了顆粒分離。這 是到目前為止達(dá)到的最高的通量和效率。通過(guò)觀察力平衡顆粒流的位置，并通過(guò)對(duì)迪恩流 場(chǎng)的數(shù)值模擬研宄了顆粒聚集機(jī)制。該分析表示，顆粒聚集于慣性升力和迪恩阻力不占優(yōu) 勢(shì)的位置，并且應(yīng)在對(duì)顆粒力平衡的解釋中考慮離心力。
[0132] 實(shí)施例2:
[0133] 使用具有梯形橫截面的螺旋通道從血液中分離白細(xì)胞
[0134] 最近，作為高效、高通量的微流細(xì)胞分離方法，慣性微流體引起了廣泛關(guān)注。但是， 該技術(shù)所達(dá)到的分離分辨率和通量，以及因細(xì)胞間相互作用而導(dǎo)致的細(xì)胞分散問(wèn)題，似乎 已成為其用于諸如血液和其它生物流體等現(xiàn)實(shí)生活樣品中的限制因素。本發(fā)明提出了新 設(shè)計(jì)的具有增強(qiáng)的分離分辨率的螺旋慣性微流（梯形橫截面）分選器，并且通過(guò)以高效率 (>80% )從經(jīng)稀釋的人血液（1%至2%血細(xì)胞比容）分離/回收多形核白細(xì)胞（PMN)和單 核白細(xì)胞（MNL)來(lái)顯示該分選器的能力。通過(guò)該方法富集的PMN還示出與原始輸入樣品相 比可忽略的活化，而常規(guī)的RBC裂解方法明顯地將人為活化誘導(dǎo)到敏感ΡΜΝ。因此，對(duì)于治 療或診斷應(yīng)用而言，該技術(shù)將是富集/分離敏感血細(xì)胞的有前景的備選方法。
[0135] 紅細(xì)胞（RBC)或紅細(xì)胞是包括血液（其占體積的約45 % )、骨髓抽吸物和腹膜 抽吸物在內(nèi)的許多生物流體中最豐富的細(xì)胞成分。出于多種原因，從這些樣品中去除污 染性的RBC通常是在用于任何科學(xué)、臨床和診斷測(cè)試之前不可或缺的樣品制備步驟（參 見(jiàn) Guder, W. G.等，1996 年，第 1 版，Darmstadt, Germany:GIT Verlag)。例如，RB 的意 外裂解釋放血紅蛋白，導(dǎo)致化學(xué)干擾并劣化基于PCR的測(cè)試性能（參見(jiàn)Al-Soud，W.A.和 P. Ridslrdm, Journal of Clinical Microbiology, 2001. 39 (2):第 485-493 頁(yè)）。還 出版了支持在人細(xì)胞的原代細(xì)胞培養(yǎng)中RBC的抗增殖作用和促凋亡作用的報(bào)道（參見(jiàn) Fredriksson, K.等，Scandinavian Journal of Immunology, 2004. 59 (6):第 559-565 頁(yè)， 以及 Atkin，S.L.等，In Vitro Cell Dev Biol Anim，1995.31(9):第 657-658 頁(yè)）。雖然 所需要的RBC去除程度根據(jù)下游應(yīng)用而變化很大，但是對(duì)于所有研宄而言，避免對(duì)經(jīng)分選 細(xì)胞的表型進(jìn)行人為改變是重要的標(biāo)準(zhǔn)。在從人血中去除RBC以分離在對(duì)多種病原體實(shí)施 和介導(dǎo)免疫應(yīng)答過(guò)程中起重要作用的白細(xì)胞（WBC)或白細(xì)胞的情況下，這尤其重要。在樣 品制備的人為因素沒(méi)有掩蓋白細(xì)胞的原始狀態(tài)的關(guān)鍵特征的情況下，從所分離的白細(xì)胞中 提取的信息將對(duì)幫助疾病預(yù)后很有意義。
[0136] 用于大規(guī)模血細(xì)胞分離的常規(guī)方法學(xué)包括差速離心和選擇性RBC裂解。雖然 差速離心的性能受到血源的影響，尤其對(duì)于來(lái)自患有諸如復(fù)發(fā)性感染等疾病的個(gè)體的血 液更是如此（參見(jiàn) Needham, P. L.，Journal of Immunological Methods, 1986. 99:第 283-284頁(yè)），但是常常與離心結(jié)合使用以實(shí)現(xiàn)完全去除RBC的RBC裂解法使細(xì)胞暴露在 低滲環(huán)境下，以細(xì)胞類(lèi)型特異性的方式改變了細(xì)胞代謝（參見(jiàn)Selzner，N.等，Cell Death and Differentiation 2004. 11:第 S172-S180 頁(yè)）。此外，已經(jīng)報(bào)道了一些案例，說(shuō)明 這些樣品制備方法可導(dǎo)致所分離的WBC的免疫表型發(fā)生改變或者活力受損。此外，大規(guī) 模樣品處理因控制不精確以及條件不均而在分離和下游應(yīng)用中引入變異性，使得不同實(shí) 驗(yàn)室和平臺(tái)之間的相似結(jié)果的比較差異不小。（參見(jiàn)Consortium, M. 〇· t. T. R.，Nature Methods, 2005. 2(5):第 351-356 頁(yè)）。
[0137] 已經(jīng)報(bào)道了 一些利用尺寸相關(guān)的流體動(dòng)力學(xué)效應(yīng)的高分辨率的連續(xù) 微流分離技術(shù)（參見(jiàn) Hou, H.W.等，Micromachines, 2011.2 (3):第 319-343 頁(yè)； Toner,Μ.和 D. Irimia, Blood-on-a-chip, in Annual Review of Biomedical Engineering 2005, Annual Reviews: Palo Alto.第 77-103 頁(yè)；Huang, L. R.等， Science，2004.304(5673):第 987-990 頁(yè)；以及 Yamada，M.，M. Nakashima 和 M.Seki, Analytical Chemistry, 2004. 76(18):第 5465-5471 頁(yè)）以實(shí)現(xiàn)對(duì)幾乎不 到微米級(jí)的粒度差異的區(qū)分，該尺寸差異與在血細(xì)胞之間觀察到的尺寸的固有差異 相當(dāng)（RBC :6 μ m至8 μ m，盤(pán)狀；單核白細(xì)胞（MNL) :7 μ m至10 μ m，球狀；多形核白 細(xì)胞（PMN) :10 μπι 至 12 μπι，球狀；WBC 包括 MNL 和 PMN)。（參見(jiàn) Downey, G. P.等， Journal of Applied Physiology, 1990. 69 (5):第 1767-1778 頁(yè)，以及 Daniels, V. G. , P.R.Wheater 和 H.G. Burkitt,Functional histology:A text and colour atlas. 1979, Edinburgh:Churchill Livingstone。）這些方法被視為繞過(guò)上述與大規(guī)模 血細(xì)胞分離方法的問(wèn)題的有前景的替選方法，并且能夠以無(wú)標(biāo)記并且連續(xù)的方式來(lái)處理樣 品。尺寸基微流分離技術(shù)不需要添加任何裂解劑或進(jìn)行在先的細(xì)胞標(biāo)記處理，并且使得 能夠在血液樣品處理期間更好地控制微環(huán)境。通過(guò)具有精心設(shè)計(jì)的幾何結(jié)構(gòu)的微通道均 勻地驅(qū)動(dòng)單個(gè)細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離，這導(dǎo)致細(xì)胞在通道寬度方向上按照與細(xì)胞尺寸相關(guān) 的方式的不同位置對(duì)齊，然后在不同出口連續(xù)收集樣品。通道設(shè)計(jì)對(duì)分離的分辨率和通 量都極其關(guān)鍵，并且根據(jù)確切的尺寸基流體動(dòng)力學(xué)作用工作原理的變化而不同。在一個(gè) 例子中，包括微桿陣列的"確定性側(cè)向位移（DLD) "導(dǎo)致大于或小于臨界流體靜力學(xué)直徑 的顆粒因微桿周?chē)膶恿鞯牟粚?duì)稱分叉而產(chǎn)生差異化側(cè)向位移。（參見(jiàn)Huang，L.R.等， Science，2004. 304(5673):第987-990頁(yè)）。在另一種微流體裝置中，以收縮-擴(kuò)張區(qū)段 進(jìn)行"捏流分級(jí)（pinched-f low fractionation，PFF) "（參見(jiàn) Yamada, Μ.，M. Nakashima 和 M. Seki, Analytical Chemistry, 2004. 76(18);第 5465-5471 頁(yè)）模式化，收縮區(qū)內(nèi)層流的 拋物線式速度分布導(dǎo)致顆粒在通道側(cè)壁附近以尺寸基方式對(duì)齊，從而使直徑比得上收縮區(qū) 通道寬度的大顆粒更靠近中間流線，而較小顆粒中心更靠近通道側(cè)壁。在進(jìn)入擴(kuò)張區(qū)后，尺 寸不等的顆粒的側(cè)向位置的該差異進(jìn)一步擴(kuò)大，從而導(dǎo)致高效分離。這兩種技術(shù)都具有將 RBC從其它細(xì)胞類(lèi)型分離所需的高分辨率，但是在臨床樣品的實(shí)際應(yīng)用上，這些技術(shù)受到低 處理通量的嚴(yán)重限制。另一方面，已經(jīng)報(bào)道了在具有矩形橫截面的曲線微通道中使用迪恩 流的慣性微流基技術(shù)以實(shí)現(xiàn)高通量的尺寸基顆粒分離（參見(jiàn)Di Carlo, D等，Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007. 104(48):第18892-18897頁(yè)（下文中簡(jiǎn)稱為 "Di Carlo 等，2007"）；Bhagat, A. A. S.，S.S. Kuntaegowdanahalli 和 I. Papautsky, Lab on a Chip, 2008. 8 (11):第 1906-1914 頁(yè)；Di Carlo，D.等，Analytical Chemistry, 2008. 80 (6): 第2204-2211 頁(yè)；Kuntaegowdanahalli，S.S.等，Lab on a Chip, 2009. 9(20):第2973-2980 頁(yè)；以及 Seo, J.，Μ· H. Lean 和 A. Kole, Applied Physics Letters, 2007. 91 (3):第 033901-033903 頁(yè)）。
[0138] 如下文所述，已通過(guò)將通道橫截面改造成梯形而非矩形從而在保持了高通量特征 的情況下改進(jìn)了曲線微通道的分離分辨率，并且下文闡述了其高效地從人血樣品中去除 RBC同時(shí)對(duì)PMN免疫表型的影響可忽略的能力。此外，為了符合對(duì)從微升級(jí)至毫升級(jí)體積范 圍的樣品進(jìn)行處理的需要，當(dāng)血液樣品是微米級(jí)（例如手指針刺）時(shí)，當(dāng)前設(shè)計(jì)可直接處理 經(jīng)稀釋的全血樣品，并且作為RBC裂解法的替代方法，其還可用于結(jié)合差速離心從而針對(duì) 較大的樣品體積（例如，約ImL)來(lái)得到經(jīng)分選細(xì)胞的沒(méi)有表現(xiàn)出活化狀態(tài)改變的純WBC。 本發(fā)明描述的梯形橫截面螺旋微通道可作為一種通用的高通量方法，用于從其它生物流體 去除RBC以及富集靶細(xì)胞，例如，從骨髓抽吸物收獲間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)。
[0139] 材料與方法
[0140] 微通道制造
[0141] 通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)軟光刻技術(shù)從聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA)母版模板，用聚二甲基 硅氧烷聚合物（PDMS，Sylard 184娃橡膠試劑盒，Dow Corning, USA)來(lái)制成梯形橫截面螺 旋通道。通過(guò)銑削加工（Whits Technologies, Singapore)來(lái)制造 PMMA模板母版，以滿足 橫截面幾何形狀的特定需求。考慮到可用的銑床能力，模板模具的實(shí)際模式與虛擬設(shè)計(jì)相 比具有± IOym的容忍度，并且表面粗糙度為Ra= 0.8 μ m。隨后，在PMMA模板母版上鑄 造10:1 (w/w)比率的與固化劑混合的PDMS預(yù)聚物，并于80°C下固化2小時(shí)以復(fù)制微通道 特征。從PMMA母版剝離經(jīng)固化的PDMS模具，并用I. 5mm直徑的活檢穿孔器為入口儲(chǔ)池和 出口儲(chǔ)池打孔。最后，在氧等離子體處理（Harrick Plasma Cleaner/Sterilizer, Harrick Plasma, Inc.，USA)后，PDMS模具不可逆地結(jié)合至另一個(gè)平的0. 5cm厚的PDMS片。在四個(gè) 不同位置切割所得的PDMS裝置，并在顯微鏡下測(cè)量橫截面以確定該裝置的準(zhǔn)確尺寸。還 在PDMS聚合物中制造了矩形橫截面螺旋通道，但通過(guò)使用雙模工藝從經(jīng)蝕刻的硅片母版 來(lái)制造（參見(jiàn) Bhagat, A.A.S.等，Lab on a Chip, 2011. 11(11) :ρ· 1870-1878)。簡(jiǎn)要說(shuō) 來(lái)，首先在6英寸的硅片上將陽(yáng)性ΑΖ4620光刻膠模式化以限定微通道特征。然后使用深反 應(yīng)離子蝕刻術(shù)（DRIE)將該經(jīng)模式化的晶片蝕刻至期望的深度，接著使用氧等離子體處理 去除剩余的光刻膠。然后，在該經(jīng)蝕刻的晶片上涂覆三氯（1Η，1Η，2Η，2Η-全氟辛基）硅烷 (Sigma-Aldrich，USA) 1. 5小時(shí)（h)，以輔助PDMS模具的釋放。將具有5份預(yù)聚物和1份固 化劑的PDMS液體混合物澆鑄于硅片上，并于80°C下固化2小時(shí)。所得的PDMS模具具有從 表面凸出的通道特征，并且充當(dāng)用于后續(xù)PDMS模制的母版。對(duì)該P(yáng)DMS母版反復(fù)進(jìn)行硅烷 處理和PDMS固化，以得到陰模。最后一步，通過(guò)等離子體輔助結(jié)合使具有已打孔的入口儲(chǔ) 池和出口儲(chǔ)池的陰模結(jié)合至另一個(gè)PDMS襯底。
[0142] 樣品制備
[0143] 對(duì)于珠實(shí)驗(yàn)而言，將直徑 6μηι(5·518μηι±0·122μηι)、10μηι(10·3μηι±0·4μηι) (Polysciences, Inc. , USA)或 15. 5 μ m(15. 5 μ m± L 52 μ m，Bangs Laboratories, Inc.) 的焚光聚苯乙稀顆粒（lwt %固體含量）分別稀釋至包含0. 025mg/mL PEG-PPG-PEG PIuronicSF-丨 08 (Sigma-Aldrich, USA)的去離子水（0· 1 % 體積百分率） 中，充當(dāng)輸入樣品。所添加的少量PEG-PEG-PEG Pluronic?F-l08不足以