內(nèi)邊910流至第一（內(nèi)）出口 950,并且較小的顆粒980 沿著所述微通道的其它部分流到至少一個其它（外）出口 960,從而按尺寸從所述混合物分 離所述顆粒。所述方法可包括從所述第一出口 950收集根據(jù)尺寸分離的顆粒。
[0098] 可將存在于多種混合物中的顆粒引入該裝置?；旌衔锏睦影ㄉ锪黧w（例 如，諸如血液、淋巴、尿等生物樣品）、液體（例如，水）、培養(yǎng)基、乳劑、污水等。在生物樣品是 全血的方面中，可引入純血或經(jīng)摻雜的（例如，經(jīng)裂解的、經(jīng)稀釋的）血液。裂解血液的方 法是本領域已知的。在一些方面中，與其它細胞相比，顆粒的體積對體積濃度約可小于5 %。 因此，所述體積對體積濃度可為約4 %、約3 %或約2 %。在一些方面中，可將血液樣品稀釋 至約0. 5%至約2%的血細胞比容。因此，經(jīng)稀釋的血液樣品的血細胞比容可為約0. 5%、 約 0. 6%、約 0. 7%、約 0. 8%、約 0. 9%、約 1. 0%、約 I. 1%、約 1. 2%、約 1. 3%、約 1. 4%、約 1. 5%、約 1. 6%、約 1. 7%、約 1. 8%、約 1. 9%或約 2%。
[0099] 另一方面，本發(fā)明涉及從混合物濃縮細胞的方法。所述方法包括將所述混合物引 入微流體裝置的至少一個入口，所述微流體裝置包括曲線微通道，所述曲線微通道具有由 徑向內(nèi)邊210、徑向外邊220、底邊230和頂邊240限定的如圖2a所示的梯形橫截面201，所 述橫截面具有高度大于所述徑向外邊220高度的徑向內(nèi)邊210,以沿著所述微通道的所述 橫截面的所述徑向內(nèi)邊分離所述細胞并將它們導向第一出口（未示出）的流率來進行所述 引入，從而從所述混合物中濃縮所述細胞。所述方法可包括從所述第一出口收集濃縮的細 胞。在一些具體方面中，所述流率可為約0. 5mL/min至約10mL/min。
[0100] 另一方面，本發(fā)明涉及從混合物（例如水）過濾顆粒的方法。顆?？砂ù嬖谟?水中的細菌、真菌、寄生蟲、絮凝物或其它沉淀聚集物。所述方法包括將包含顆粒的水引入 微流體裝置的至少一個入口，所述微流體裝置包括曲線微通道，所述曲線微通道具有由徑 向內(nèi)邊210、徑向外邊220、底邊230和頂邊240限定的如圖2a所示的梯形橫截面201，所述 橫截面具有大于所述徑向外邊220高度的徑向內(nèi)邊210高度，以沿著所述微通道的所述橫 截面的所述徑向內(nèi)邊210分離所述顆粒并將它們導向第一出口（未示出）的流率來進行所 述引入，從而從所述水過濾所述顆粒。所述方法可包括從所述第一出口收集顆粒。在一些 具體方面中，所述流率可為約0. 5mL/min至約10mL/min。
[0101] 另一方面，本發(fā)明涉及使細胞分布于混合物中的方法。所述方法包括將所述混合 物引入所述微流體裝置的至少一個入口，所述微流體裝置包括曲線微通道，所述曲線微通 道具有由徑向內(nèi)邊210、徑向外邊220、底邊230和頂邊240限定的如圖2c所示的梯形橫截 面203,所述橫截面具有包括至少一個階梯（241、242、243等）而形成階形剖面的頂邊240， 以沿著所述階形剖面的部分來分布細胞的流率進行所述引入，其中細胞在分布至分離出口 (未示出）之前、期間或之后都不撞擊所述邊，從而將所述細胞分布于所述混合物中。所述 方法可包括從所述分離出口收集分布后的細胞。在一些具體方面中，所述流率可為約2mL/ min 至約 10mT ,/mi η 〇
[0102] 另一方面，將細胞混合于液體中的方法包括將液體和細胞引入具有曲線微通道的 所述微流體裝置的至少一個入口，所述曲線微通道具有由徑向內(nèi)邊210、徑向外邊220、底 邊230和頂邊240限定的如圖2d所示的梯形橫截面204,所述橫截面具有包括處于所述徑 向內(nèi)邊210與所述徑向外邊220之間的至少一個淺區(qū)240c的所述頂邊240,以沿著所述微 通道混合細胞并將所述混合物導向第一出口（未示出）的流率進行所述引入。所述方法可 包括從所述第一出口收集所述混合物。在一些具體方面中，所述流率可為約〇. lmL/min至 約 2mL/min〇
[0103] 在本發(fā)明描述的方法中，可通過多種方式將流體引入微流體裝置中。在一個方面 中，可使用注射泵將流體引入微流體裝置。在另一些方面中，可使用活塞泵、齒輪泵、蠕動 泵、壓電微型泵或使用可控的壓力調(diào)節(jié)器將流體引入微流體裝置。通過微流體裝置的流體 流率將根據(jù)用途而變化。在一些方面中，所述流率可為約0. 5mL/min至約10mL/min，例如以 下流率：約 lmL/min、約 2mL/min、約 3mL/min、約 4mL/min、約 5mL/min、約 6mL/min、約 7mL/ min、約 8mT,/miη 或約 QmT,/miη 〇
[0104] 可使用該微流體裝置分離多種顆粒。在一個具體方面，可將較大顆粒從較小顆粒 中分離。較大顆?？删哂屑s18 μ m至約50 μ m的直徑。例如，較大顆粒的直徑可為約19 μ m、 約 20 μ m、約 21 μ m、約 22 μ m、約 23 μ m、約 24 μ m、約 25 μ m、約 26 μ m、約 27 μ m、約 28 μ m、 約 29 μ m、約 30 μ m、約 31 μ m、約 32 μ m、約 33 μ m、約 34 μ m、約 35 μ m、約 36 μ m、約 37 μ m、 約 38 μ m、約 39 μ m、約 40 μ m、約 41 μ m、約 42 μ m、約 43 μ m、約 44 μ m、約 45 μ m、約 46 μ m、 約47 μ m、約48 μ m、約49 μ m或約50 μ m。較小顆粒可具有約2 μ m至約14 μ m的直徑。例 如，較小顆粒的直徑可為約2 μ m、約3 μ m、約4 μ m、約5 μ m、約6 μ m、約7 μ m、約8 μ m、約 9 μ m、約10 μ m、約11 μ m、約12 μ m、約13 μ m或約14 μ m。在一個具體方面中，所述流率可 為約2. 5mL/min，所述較大顆粒的直徑可為約18 μ m至約40 μ m，并且所述較小顆粒的直徑 可為約10 ym至約20 μπι。在另一個具體方面中，所述流率可為約I. 5mL/min，所述較大顆 粒的直徑可為約15 μπι至約25 μπι，并且所述較小顆粒的直徑可為約5 μπι至約10 μπι。在 另一更具體方面中，所述流率可為約2. 5mL/min至約3. OmL/min，所述較大顆粒的直徑可為 約25 μ m至約40 μ m，并且所述較小顆粒的直徑可為約5 μ m至約15 μ m。
[0105] 在一些方面中，所述顆?？蔀榧毎绺杉毎?。另一方面，細胞可存在于生物流 體（例如，血液、尿、淋巴、腦脊液等）中。在一個具體方面中，細胞存在于血液樣品中，其中 較大的細胞是循環(huán)腫瘤細胞（CTC)，并且較小的細胞是血液細胞。在一些方面中，所述CTC 是來自（一種或多種）乳腺癌、結(jié)直腸癌、腎癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、鱗狀細胞癌、 肝細胞癌、鼻咽癌的癌細胞（例如，轉(zhuǎn)移癌細胞）以及其它類型的癌細胞。因為該方法不需 要選擇起始細胞表面生物標記，所以其適用于上皮起源和非上皮起源的不同癌癥。
[0106] 本發(fā)明描述的方法還可包括收集和分離經(jīng)分離的顆粒（例如細胞）。在某些方面 中，所述方法還可包括下游分析，例如免疫染色、qRT_PCR、FISH和測序。在一個具體方面中， 所述方法還可包括進行異質(zhì)性研宄。
[0107] 在本發(fā)明描述的方法中，除非另有說明，否則對顆粒（例如CTC)的捕獲效率可 為約60%至約100%，例如約62%、約64%、約66%、約68%、約70%、約72%、約74%、 約 76%、約 78%、約 80%、約 82%、約 84%、約 86%、約 88%、約 90%、約 92%、約 94%、約 96 %、約98 %和約99 %。在一個具體方面中，捕獲效率可為80 %或85 %或87 %的平均回收 率。在另一個具體方面中，在CTC中檢測HER2擴增可鑒定高風險乳腺癌患者，這些患者將 從HER2相關的治療策略中受益。
[0108] 本發(fā)明描述的微流體裝置可在數(shù)分鐘內(nèi)處理毫升級的流體（例如血液）量。在一 個具體方面中，具有梯形橫截面的微流體裝置可在約8分鐘內(nèi)處理7. 5ml血液（例如，經(jīng)裂 解的紅細胞），使得能夠富集可存活的CTC，并且可處理更小的血液量，例如約5分鐘內(nèi)處理 4mL血液，并且可處理更大的血液量，例如約15分鐘內(nèi)處理約20mL血液，或約30分鐘內(nèi)處 理約40mL血液，或約45分鐘內(nèi)處理約60mL血液，或約60分鐘內(nèi)處理約80mL血液，或約一 小時內(nèi)更大量。
[0109] 另一方面，所述較大細胞可為白細胞，并且所述較小細胞可為血液細胞。另一方 面，所述混合物可為骨髓樣品，其中可將干細胞從血細胞分離。
[0110] 在用于從細胞混合物中分離某些種類的細胞的細胞研宄中，尺寸基細胞分離是富 有挑戰(zhàn)性的要求。例如，因癌轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生導致的死亡占所有癌癥相關死亡的90%。在 轉(zhuǎn)移期間，在腫瘤發(fā)生的早期，腫瘤來源的可存活上皮細胞（循環(huán)腫瘤細胞或CTC)脫落至 患有轉(zhuǎn)移性癌癥患者的外周血中，并且這些細胞可能與在遙遠器官處的外滲從而形成新的 轉(zhuǎn)移位點有關。臨床報道已經(jīng)示出，CTC的檢測可提供與疾病階段和癌癥進展相關的有價 值視角。基于直徑為一般約20 μ m的CTC與其它血細胞（RBC約8 μ m ;白細胞約10 μ m至 15 μ m)之間尺寸差異的分離將是從血液細胞分離這些稀有CTC的好方法。
[0111] 另一個例子是作為針對細菌感染的先天性免疫應答關鍵效應蛋白的嗜中性粒細 胞；在敗血癥中，過于劇烈的應答可導致系統(tǒng)性炎癥以及器官機能障礙。因此，嗜中性粒細 胞本身在控制敗血癥中被識別為潛在的標靶。在敗血癥動物模型中，研宄示出，減少嗜中性 粒細胞或拮抗它們的活性有助于維持器官功能。關于減少敗血癥患者血液中的循環(huán)嗜中性 粒細胞有助于控制炎癥的假說很誘人，并且連續(xù)血液分離技術是驗證該假說所必需的。因 為具有多種細胞類型的血細胞具有不同細胞尺寸是公知的，例如，多形核白細胞（PNL)的 細胞直徑為約10 ym至約15 μL?，單核細胞和淋巴細胞的細胞直徑為約7 μL?至約8 μL?，并 且紅細胞的細胞直徑為約6 μπι至約8 μπι，所以尺寸基分離技術有助于將血液分級成不同 的血液成分。
[0112] 間充質(zhì)干細胞（MSC)是來自骨髓的成年人干細胞，其可分化成多種非造血細胞 系。據(jù)以前的論文報道，單個細胞衍生的骨髓基質(zhì)細胞克隆包含若干種形態(tài)學不同的細胞 類型。在早期克隆中，與大細胞相比，很小的圓細胞快速自我更新。富含所述較小細胞的樣 品比富含所述較大細胞的樣品具有更大的多潛能分化潛力。對于這類應用，還需要高分辨 率的尺寸基分離。
[0113] 圖6Α至圖6D示出了一種示例性裝置從新鮮人血中分離PNL中的性能。用PDMS 聚合物制造了具有寬度為500 μ m，內(nèi)壁或外壁處的深度分別為90 μ m和120 μ m的梯形橫截 面的螺旋通道。對2%血細胞比容血液樣品而言，該裝置以連續(xù)并且高通量的方式實現(xiàn)了 >90 %的PNL回收，同時保持-75 %的RBC去除，使得能夠在耦接時進行對嗜中性粒細胞減少 的血液進行選擇性輸注。對輸出樣品的吉姆薩染色還進一步證實，經(jīng)分離的PNL的98%是 嗜中性粒細胞。雖然機械應力可導致嗜中性粒細胞活化是已知的，但是對輸入樣品和輸出 樣品的NBT測試都顯示，在經(jīng)該裝置處理后，所分離的嗜中性粒細胞保持存活并且是非活 化的。因此，對所分離的嗜中性粒細胞進行的后續(xù)臨床和分子診斷學測試應顯示輸入樣品 的初始狀態(tài)。
[0114] 作為MSC分離的一個范例，將早期傳代的MSC細胞系稀釋至約10k/ml，并且在內(nèi)高 度80 μπκ外高度130 μπκ寬度600 ym的8環(huán)螺旋中進行測試。在實驗后，從每個出口手動 測量100個隨機細胞。圖7A-7B和圖8A-8B中示出了尺寸分布結(jié)果。如所預期的那樣，細 胞被按尺寸分成兩個子群。在2. 2mL/min流率下，內(nèi)出口處收集的大部分細胞是18 μ m至 30 μπι細胞（受試MSC的約30% )，而在外出口處的細胞則為15 μπι至19 μπι(受試MSC的 約70% )。如果流率升高至3mL/min，則在外側(cè)會有更多20 ym細胞，并且在內(nèi)側(cè)中收集到 更少的22 μπι以下的細胞，因此分離閾值發(fā)生迀移。這些結(jié)果表示，梯形橫截面能夠?qū)崿F(xiàn)用 矩形橫截面通道時從未報道過的高分辨率分離。
[0115] 在具有如圖2-c所示的具有階形橫截面的螺旋通道的情況下，階梯附近的迪恩流 被階梯干擾，產(chǎn)生局部迪恩漩渦。初始結(jié)果表示，這些漩渦能夠使顆粒陷于其中。這類通道 的潛在應用是可作為高流率細胞遞送中的分布器。細胞陷于不同位置，這使它們在分離至 多個子分支時免于因撞擊通道壁而受損。
[0116] 如圖2d所示，具有夾在兩個較深區(qū)之間的淺區(qū)的螺旋微通道甚至使迪恩流分布 和慣性上升分布更為復雜。高度在〇. 3mm與0. 45mm之間切換的兩個中心螺旋通道已經(jīng)示 出，不能使顆粒聚集在或陷于任何位置。該結(jié)果表示，這樣的模式可用作混合機。該類型混 合機的優(yōu)點是，其根據(jù)二次流來混合樣品，因此該混合物方法比具有柱子模式的混合機更 柔和。
[0117] 實施例：
[0118] 實施例1 :
[0119] 具有梯形橫截面螺旋微通道的高分辨率尺寸基微顆粒/細胞分離器
[0120] 下文中描述了顆粒在具有梯形橫截面的螺旋微流通道中的聚集行為。通過從側(cè)視 圖和頂視圖二者中觀察顆粒流的位置，結(jié)合迪恩流場的數(shù)值模擬，研宄了這些通道內(nèi)的力 平衡狀態(tài)，以更好地理解螺旋慣性微流通道中的顆粒聚集機制。在螺旋慣性微流通道中，改 變通道橫截面可導致迪恩流場的迀移，從而顯著影響顆粒聚集行為?；谠摍C制，實現(xiàn)了同 時具有高分辨率和高通量的顆粒分離。
[0121] 理論
[0122] 在矩形橫截面螺旋通道中，迪恩漩渦在寬度方向上是對稱的，并且顆粒主要聚集 在彎曲通道的內(nèi)側(cè)處。直徑/高度比>0. 07的顆粒一般聚集為處于通道上半部分和下半部 分的迪恩渦內(nèi)的兩股流。隨著流率增加，顆粒聚集位置因慣性升力增加而開始更靠近內(nèi)通 道壁，而在更高流率下，離心力開始占優(yōu)勢，使顆粒位置遠離內(nèi)壁而朝向外壁（圖10A)。該 現(xiàn)象使顆粒/細胞分離的通量和分辨率受到限制，這是因為不同尺寸的顆粒的聚集位置彼 此接近。參見Kuntaegowdanahalli等。在梯形橫截面螺旋通道中，由于內(nèi)壁比外壁更窄，所 以從"慣性優(yōu)勢"狀態(tài)向"迪恩優(yōu)勢"狀態(tài)的轉(zhuǎn)變是突然的，因此，聚集位置立即從通道的內(nèi) 半部分跳至通道的外半部分。這是因為強迪恩渦心朝微通道的外半部分偏移的演化使得迪 恩流場為非線性（參見圖9A中的較深區(qū)）。因為慣性升力與尺寸高度密切相關，所以不同 尺寸的顆粒/細胞在不同流率下從慣性優(yōu)勢狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榈隙鲀?yōu)勢狀態(tài)。通過使用該原理， 相比于傳統(tǒng)矩形橫截面微通道，可以用更高的空間分辨率分離不同尺寸的顆粒/細胞。
[0123] 實驗
[0124] 用通過精密銑削加工（Whits Technologies, Singapore)制成的聚甲基丙稀酸甲 酯（PMM)模具來鑄造微流通道。該設計由具有多環(huán)并且曲率半徑約為IOmm的單個入口和 兩個出口的螺旋通道組成。用以10:1比例與固化劑混合的Sylgard 184硅橡膠（PDMS)預 聚物鑄造模式。在固化后，剝下具有模式的TOMS模具，并使其等離子體結(jié)合至另一個3mm 厚的PDMS層。在結(jié)合之前打孔形成輸入口和輸出口。為了從旁邊觀察顆粒位置，沿著通道 輸出截面切割裝置約2_距離，然后通過使裝置與平的瓶容器垂直來制造第二鑄件。在制 造第二鑄件之前將管連接至口，以防止PDMS混合機流至通道內(nèi)。
[0125] 在測試期間，將微流