微流體裝置及其用圖
【專利說(shuō)明】微流體裝置及其用途
[0001] 政府支持
[0002] 本發(fā)明是由空海作戰(zhàn)系統(tǒng)司令部（Space and Naval Warfare Systems Command) 資助的基金No. N66001-11-1-4182下的政府支持來(lái)完成的。政府在本發(fā)明中具有一些權(quán) 利。
[0003] 相關(guān)申請(qǐng)
[0004] 本申請(qǐng)要求于2012年9月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/704, 128的權(quán)益。通 過(guò)引用將該申請(qǐng)的全部教導(dǎo)并入本發(fā)明中。
【背景技術(shù)】
[0005] 用于細(xì)胞分離的常規(guī)的大規(guī)模方法包括使用膜基過(guò)濾器的物理過(guò)濾法，以及利用 細(xì)胞尺寸、變形性和密度的不同來(lái)過(guò)濾掉靶細(xì)胞的密度梯度離心法。這些技術(shù)是勞動(dòng)密集 型的，并且需要多步驟的樣品制備，這可能引入人工因素，或者導(dǎo)致期望細(xì)胞的損失。膜過(guò) 濾法還容易遇到堵塞問(wèn)題，需要經(jīng)常進(jìn)行清理。此外，也有報(bào)道證明經(jīng)過(guò)過(guò)濾和離心技術(shù) 的靶細(xì)胞具有機(jī)械應(yīng)力引入的在初始表型上的變化。最近，探討了將慣性微流體裝置作 為無(wú)過(guò)濾器的尺寸基細(xì)胞分級(jí)方法。參見(jiàn)Di Carlo D. Inertial microfluidics. Lab on a chip.2009;9(21):3038_46;Kuntaegowdanahalli SS 等，Lab on a chip.2009;9(20); 2973-80 ;Bhagat AAS 等，Biomedical Microdevices· 2010 ;12 (2):187-95。
[0006] 然而，仍然需要開(kāi)發(fā)可使細(xì)胞損失最小并維持初始靶細(xì)胞表型用于后續(xù)分析的更 簡(jiǎn)單并且更高效的技術(shù)來(lái)處理血液樣品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明總體涉及用于顆粒聚集和混合的具有彎曲微通道的微流體裝置，所述彎曲 微通道具有非矩形橫截面。在一個(gè)具體方面中，本發(fā)明涉及這樣的微流體裝置，其包括至少 一個(gè)入口以及曲線微通道，所述曲線微通道具有由徑向內(nèi)邊、徑向外邊、底邊和頂邊限定的 梯形橫截面，所述橫截面具有a)高度不等的所述徑向內(nèi)邊和所述徑向外邊，或b)高度與所 述徑向外邊的高度相等的所述徑向內(nèi)邊，并且其中所述頂邊具有寬度與所述底邊各不相等 的至少兩個(gè)連續(xù)的直區(qū)段。所述微流體裝置還包括至少一個(gè)出口。在某些方面中，所述微 流體裝置包括兩個(gè)出口。在一些方面中，所述微流體裝置包括單個(gè)的入口。
[0008] 在一些方面中，所述微流體裝置的所述橫截面可具有（a)大于所述徑向外邊高度 的所述徑向內(nèi)邊高度，或（b)小于所述徑向外邊高度的所述徑向內(nèi)邊高度，或（C)包括形成 階形剖面的至少一個(gè)階梯的所述頂邊，或（d)包括處于所述徑向內(nèi)邊與所述徑向外邊之間 的至少一個(gè)淺區(qū)的所述頂邊。所述梯形橫截面可為直角梯形橫截面。在某些方面中，所述 梯形橫截面的所述頂邊及/或底邊可為彎曲的，該彎曲可為凸起或凹陷。
[0009] 在另一些方面中，所述梯形橫截面的所述徑向內(nèi)邊和所述徑向外邊的高度可為約 20微米（μ m)至約200 μ m。在某些方面中，所述梯形橫截面的所述頂邊和所述底邊的寬度 可為約100 μ m至約2000 μ m。
[0010] 在一個(gè)方面中，所述曲線微通道可為螺旋微通道。另一方面，所述曲線微通道可為 蛇形微通道。所述曲線微通道可具有約2. 5mm至約25mm的曲率半徑，以及約4cm至約IOOcm 的長(zhǎng)度。
[0011] 另一方面，本發(fā)明涉及按尺寸從顆?；旌衔锓蛛x一個(gè)或多個(gè)顆粒的方法。所述方 法包括將所述混合物引入微流體裝置的至少一個(gè)入口，所述微流體裝置包括曲線微通道， 所述曲線微通道具有由徑向內(nèi)邊、徑向外邊、底邊和頂邊限定的梯形橫截面，所述橫截面具 有小于所述徑向外邊高度的徑向內(nèi)邊高度，以基于粒度沿著所述微通道的所述橫截面的部 分分離顆粒的流率來(lái)進(jìn)行所述引入，其中較大的顆粒沿著所述微通道的所述徑向內(nèi)邊流至 第一出口，并且較小的顆粒沿著所述微通道的其它部分流到至少一個(gè)其它出口，從而按尺 寸從所述混合物分離所述顆粒。所述方法還可包括從所述第一出口收集根據(jù)尺寸分離的顆 粒。在一個(gè)方面中，所述流率可為約0. 5mL/min至約7. 5mL/min。在一些方面中，所述顆粒 可為細(xì)胞，例如干細(xì)胞。
[0012] 在一個(gè)具體方面中，所述流率可為約2. 5mL/min，所述較大顆粒的直徑可為約 18 μ m至約40 μ m，并且所述較小顆粒的直徑可為約10 μ m至約20 μ m。在另一個(gè)具體方面 中，所述流率可為約I. 5mL/min，所述較大顆粒的直徑可為約15 μ m至約25 μ m，并且所述較 小顆粒的直徑可為約5 μπι至約10 μπι。在另一個(gè)具體方面中，所述流率可為約2. 5mL/min 至約3. OmL/min，所述較大顆粒的直徑可為約25 μ m至約40 μ m，并且所述較小顆粒的直徑 可為約5 μ m至約15 μ m。
[0013] 另一方面，所述細(xì)胞混合物可為血液樣品，并且所述較大細(xì)胞可為循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTC)，并且所述較小細(xì)胞可為血細(xì)胞。在一個(gè)方面中，可將流率適配為在約8分鐘內(nèi)按尺 寸分離約7. 5mL的血液。另一方面，所述較大細(xì)胞可為白細(xì)胞，并且所述較小細(xì)胞可為血細(xì) 胞。另一方面，所述混合物可為骨髓樣品，其中可從血細(xì)胞分離干細(xì)胞。
[0014] 另一方面，本發(fā)明涉及從混合物濃縮細(xì)胞的方法。所述方法包括將所述混合物引 入微流體裝置的至少一個(gè)入口，所述微流體裝置包括曲線微通道，所述曲線微通道具有由 徑向內(nèi)邊、徑向外邊、底邊和頂邊限定的梯形橫截面，所述橫截面具有大于所述徑向外邊高 度的徑向內(nèi)邊高度，以沿著所述微通道的所述橫截面的所述徑向內(nèi)邊分離所述細(xì)胞，并以 將它們導(dǎo)向第一出口的速率來(lái)進(jìn)行所述引入，從而從所述混合物濃縮所述細(xì)胞。所述方法 可包括從所述第一出口收集濃縮的細(xì)胞。在一些具體方面中，所述流率可為約0. 5mL/min 至約 10mT ,/mi η 〇
[0015] 另一方面，本發(fā)明涉及從混合物過(guò)濾粒子的方法。所述方法包括將包含粒子的混 合物引入微流體裝置的至少一個(gè)入口，所述微流體裝置包括曲線微通道，所述曲線微通道 具有由徑向內(nèi)邊、徑向外邊、底邊和頂邊限定的梯形橫截面，所述橫截面具有大于所述徑向 外邊高度的徑向內(nèi)邊高度，以沿著所述微通道的所述橫截面的所述徑向內(nèi)邊分離粒子并將 它們導(dǎo)向第一出口的速率來(lái)進(jìn)行所述引入，從而從所述混合物中分離所述粒子。在一些方 面中，所述混合物可為水。所述方法可包括從所述第一出口收集顆粒。在一些具體方面中， 所述流率可為約〇. 5mL/min至約10mL/min。
[0016] 另一方面，本發(fā)明涉及將細(xì)胞分布于混合物中的方法。所述方法包括將所述混合 物引入所述微流體裝置的至少一個(gè)入口，所述微流體裝置包括曲線微通道，所述曲線微通 道具有由徑向內(nèi)邊、徑向外邊、底邊和頂邊限定的梯形橫截面，所述橫截面包括形成階形剖 面的至少一個(gè)階梯的所述頂邊，以沿著所述階形剖面的部分來(lái)分布細(xì)胞的流率進(jìn)行所述引 入，其中細(xì)胞在分布至分離出口之前、期間或之后都不撞擊所述邊，從而將所述細(xì)胞分布于 所述混合物中。所述方法可包括從所述分離出口收集經(jīng)分布的細(xì)胞。在一些具體方面中， 所述流率可為約2mL/min至約10mL/min。
[0017] 另一方面，本發(fā)明涉及將細(xì)胞混合于液體中的方法。所述方法包括將液體和細(xì)胞 引入所述微流體裝置的至少一個(gè)入口，所述微流體裝置包括曲線微通道，所述曲線微通道 具有由徑向內(nèi)邊、徑向外邊、底邊和頂邊限定的梯形橫截面，所述橫截面的所述頂邊包括處 于所述徑向內(nèi)邊與所述徑向外邊之間的至少一個(gè)淺區(qū)，以沿著所述微通道混合細(xì)胞并將所 述混合物導(dǎo)向第一出口的流率進(jìn)行所述引入。所述方法可包括從所述第一出口收集所述混 合物。在一些具體方面中，所述流率可為約0. lmL/min至約2mL/min。
[0018] 本發(fā)明具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括分辨率比用現(xiàn)有微流體裝置可得分辨率更高的分離。 通道尺寸的大小一般大于顆粒直徑的3倍，這不僅使該裝置不會(huì)受到堵塞問(wèn)題影響并且具 有高通量，而且還降低了制造成本。這些優(yōu)點(diǎn)顯示了彎曲微流體裝置在未來(lái)的廣泛應(yīng)用。此 外，對(duì)于通道形狀的變化，這里描述的本發(fā)明在此提供了相對(duì)于傳統(tǒng)的矩形彎曲微通道的 許多明顯優(yōu)點(diǎn)。特別是對(duì)于高分辨率顆粒分離的應(yīng)用，根據(jù)顆粒的直徑和流率沿著內(nèi)側(cè)和 外側(cè)將它們分成兩條主流。該類型裝置能夠達(dá)到傳統(tǒng)矩形通道無(wú)法企及的高分辨率高通量 分離。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 通過(guò)如在附圖中所示的對(duì)本發(fā)明示例性實(shí)施例的如下更具體描述，前述內(nèi)容將變 得顯而易見(jiàn)，其中在所有不同附圖中相同的附圖標(biāo)記指相同的部件。附圖不一定是成比例 的，相反重點(diǎn)在于描述本發(fā)明的實(shí)施例。
[0020] 圖IA和圖IB示出了兩種典型的曲線微通道的頂視圖的示意圖（圖IA :螺旋形，圖 IB :蛇形）。左邊示出了螺旋微通道的剖切圖。通道的寬度一般大于深度。矩形橫截面通 道中的迪恩流（Dean flow)具有從內(nèi)側(cè)流向外側(cè)的主流，以及與頂壁和底壁平行的流。在 迪恩流和慣性上升的影響下，顆粒將聚集于具有更低迪恩流的通道內(nèi)半側(cè)。通過(guò)諸如通道 尺寸、縱橫比、曲率半徑、顆粒直徑和流率等參數(shù)來(lái)控制顆粒位置。
[0021] 圖2a至圖2d是彎曲通道的不同橫截面的示意圖。圖2a):具有較深內(nèi)側(cè)（曲率 中心附近）和淺外側(cè)的彎曲微通道。兩個(gè)迪恩渦心向內(nèi)側(cè)傾斜，使顆粒陷于其中。這種類 型的微通道可用于顆粒濃縮和過(guò)濾；圖2b):具有淺內(nèi)側(cè)和較深外側(cè)的彎曲微通道。兩個(gè) 渦心向外側(cè)傾斜，并且能夠使一些較小直徑的顆粒陷于其中，可應(yīng)用于基于尺寸的分離；圖 2c):在具有類階梯形橫截面的彎曲微通道中，顆粒陷于階梯的角落；圖2d):具有夾在中間 的淺區(qū)的彎曲微通道，產(chǎn)生復(fù)雜的迪恩流和慣性上升分布，阻止顆粒聚集或困陷。這樣的通 道可用作混合機(jī)。
[0022] 圖3A和圖3B是具有單個(gè)入口和兩個(gè)出口管的實(shí)際梯形橫截面螺旋微流體裝置的 照片。圖3A中示出了填充了用于顯示的染料的通道。該裝置由經(jīng)等離子體結(jié)合的兩個(gè)PDMS 層制成，其中具有螺旋模式的一層由經(jīng)微磨的PMM模具鑄造。圖3B示出了剖切圖。通道 的寬度為600 μπι，內(nèi)高度（底）為80μπι，并且外高度（頂）為140ym。
[0023] 圖4A至圖4H示出了以下出口處的熒光珠分布比較的頂視圖，圖4A至圖4D):高 度80 μ m寬度600 μ m的矩形橫截面螺旋微通道，并且圖4E至圖4H)如圖IA中描述的梯形 橫截面螺旋微通道，流率從0. 5mL/min (左）升高至7. 5mL/min (右）。所示珠的直徑為：圖 4A和圖4E)中為5·78μπι，圖4B和圖4F)中為mum，圖4C和4G)中為Ιδ.δμπι，圖4D 和圖4Η)中為26. 25 μ m。
[0024] 圖5是與實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較的橫跨梯形橫截面螺旋通道的迪恩流場(chǎng)的計(jì)算流體動(dòng)力 學(xué)（CFD)的模擬結(jié)果，表示螺旋通道橫截面中顆粒的力平衡位置。箭頭標(biāo)出了迪恩流的方 向和大小，圖譜表示迪恩流的大小。點(diǎn)來(lái)自實(shí)驗(yàn)結(jié)果的26. 25 μπι珠的位置。
[0025] 圖6Α至圖6D示出了使用具有梯形橫截面的螺旋通道從新鮮人血中分離嗜中性 粒細(xì)胞的結(jié)果和照片。圖 6Α):使用 Mono-Poly Resolving Medium(Catalog#1698049，MP Biomedicals)從新鮮人血中分離的主要為嗜中性粒細(xì)胞的多形核白細(xì)胞（PNL)，并且使用 以IXPBS稀釋的0. 1%血細(xì)胞比容的血液樣品來(lái)揭示在多種流率下通道內(nèi)每種細(xì)胞的位 置。對(duì)由Phantom v9. 1快速攝像頭捕捉的一系列明視場(chǎng)圖像取標(biāo)準(zhǔn)差，從而得到所示的頂 視圖圖像。該實(shí)驗(yàn)中使用的通道具有寬度為500 μπι并且內(nèi)壁或外壁處深度分別為90 μπι和 120μπι的梯形橫截面。頂部的虛線表示內(nèi)通道壁，而底部的虛線表示外通道壁。圖6Β):向 具有不同血細(xì)胞比容的血液樣品添加用APC綴合的抗CD45抗體染色的經(jīng)分離的PNL，并用 作以0. 8mL/min流率螺旋通道的輸入樣品。分別通過(guò)流式細(xì)胞分析和血細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)確定內(nèi) 出口的輸出級(jí)分中回收的PNL細(xì)胞和RBS細(xì)胞的計(jì)數(shù)。圖6C):當(dāng)使用0.1%血細(xì)胞比容的 新鮮人血作為0. 8mL/min下的輸入樣品時(shí)，對(duì)內(nèi)出口輸出級(jí)分的吉姆薩染色。大多數(shù)細(xì)胞 是嗜中性粒細(xì)胞。圖6D):經(jīng)螺旋通道以0. 8mL/min的流率處理1%血細(xì)胞比容的血沉棕黃 層，并且對(duì)輸入細(xì)胞和輸出細(xì)胞在具有1 μΜ PM或沒(méi)有PM的條件下進(jìn)行四唑氮藍(lán)（NBT) 測(cè)試。該圖像示出，只有在外加 PM的條件下細(xì)胞才會(huì)變藍(lán)，表示該裝置不會(huì)活化樣品中的 嗜中性粒細(xì)胞，并且輸出的嗜中性粒細(xì)胞保持可存活狀態(tài)，并能夠通過(guò)體外刺激來(lái)活化。
[0026] 圖7A和圖7B是描述用內(nèi)部為80 μ m、外部為130 μ m和寬度為600 μ m的梯形橫截 面螺旋裝置分離后從兩個(gè)出口收集的MSC的尺寸分布圖，手動(dòng)測(cè)量來(lái)自每個(gè)出口收集物的 100個(gè)細(xì)胞。圖7A):以2. 2mL/min的流率泵入樣品。圖7B):以3. OmL/min的流率泵入樣 品。
[0027] 圖8A和圖8B是來(lái)自以2. 5mL/min流率的內(nèi)80μπκ外130μπι和寬度600 μπι的梯 形橫截面螺旋裝置的內(nèi)輸出（圖8Β)和外輸出（圖8Α)的MSC收集的顯微圖像。
[0028] 圖9Α示出了顆粒聚集并陷于迪恩漩渦內(nèi)的原理的梯形橫截面通道的示意圖。圖 9Β示出了實(shí)際的去除了兩個(gè)出口管的PDMS鑄造的梯形橫截面螺旋微流體裝置的照片。左 邊示出了橫截面的剖切圖。螺旋曲線半徑為7. 5_至12. 5_不等。通道橫截面的內(nèi)高度 和外高度分別為80 μ m和130 μ m。通道的寬度為600 μ m。
[0029] 圖IOA是頂視圖圖像，示出了在0. 5mL/min至7. 5mL/min的流率下，內(nèi)/外深度為 80/130 μ m的梯形橫截面螺旋微通道的出口與高度為80 μ m的矩形通道的出口的熒光珠分 布比較。圖IOB是結(jié)合了來(lái)自頂視圖和側(cè)視圖的26. 25 μ m熒光珠分布的迪恩流場(chǎng)（內(nèi)/外 深度：80/140 μ m，寬度：600 μ m，流率：3. 5mL/min，通道半徑：7. 5mm)的CFD模擬，表示顆粒 的力平衡位置。黑色錐表示迪恩流的方向和大小?；疑κ莵?lái)自實(shí)驗(yàn)結(jié)果的26. 25 μπι珠 在典型流率下的位置。
[0030] 圖11Α、圖IlB和圖IlC是用內(nèi)/外深度為80/130 μm、寬為600 μπι的梯形橫截面 螺旋微通道以3. 4mL/min流率進(jìn)行顆粒分離的FACS結(jié)果圖。圖IlA :輸入0. 665%體積對(duì) 體積濃度（約2.6X106/mL)的16·68μπι顆粒和26·9μπι顆粒，圖11B:內(nèi)側(cè)輸出，圖11C: 外側(cè)輸出。
[0031] 圖12示出不同位置的顆粒上的力方向的示意圖。黑色圈表示不穩(wěn)定平衡點(diǎn)的位 置。白色圈表示穩(wěn)定的力平衡點(diǎn)。白色錐表示迪恩速度的方向和對(duì)數(shù)大小。
[0032] 圖13是具有寬度為500 μ m、深度為70 μ m(內(nèi)）和100 μ m(外）的梯形橫截面的 螺旋通道的示意圖，以描述工作原理。在出口處，較大的白細(xì)胞（WBC)因慣性升力（FJ和 迪恩阻力（F d)的合力聚集于內(nèi)壁附近，而較小的紅細(xì)胞（RBC)陷于迪恩渦心，并在外壁附 近形成寬的條帶。
[0033] 圖14A至圖14D是：表示在以下通道中ΙΟμπι(白色）和6μπι(灰色）珠的慣性聚 集的示意圖（不按比例）和平均復(fù)合熒光圖像。圖14Α):最優(yōu)流率lmL/min(De = 4. 31) 下具有500 ymX90ym(WXH)的矩形橫截面的螺旋通道；圖14B):最優(yōu)流率2mL/min(De = 8. 63)下具有500 μ mX 120 μ m的矩形橫