本發(fā)明涉及一種適用于生物活性涂層制備過(guò)程的冷凍干燥處理工藝，具體涉及一種基于蛋白、多肽修飾的鎂、鈦合金復(fù)合涂層的冷凍干燥處理方法，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、鎂、鈦合金等醫(yī)用金屬材料在生物植入性材料領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，由于鎂、鈦合金耐蝕性低、生物降解速度高，界面處與人體細(xì)胞結(jié)合性差，所以，在其表面涂上一層生物活性涂層是極其必要的，且這種涂層需擁有較好耐腐蝕性、生物活性，這樣就能更好地運(yùn)用鎂、鈦合金解決目前生物植入性材料領(lǐng)域存在的問(wèn)題，該類生物活性涂層常用的生物活性成分主要包括：蛋白質(zhì)、多肽、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、多糖以及有機(jī)小分子藥物等。其中蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命體的重要結(jié)構(gòu)和功能單元，具有多種特殊的生物功能，將生物親和的蛋白類物質(zhì)修飾在醫(yī)用金屬表面，對(duì)提升植入體的生物活性和生物功能具有重要意義，目前，基于蛋白質(zhì)、多肽修飾的生物涂層多處于實(shí)驗(yàn)階段，實(shí)際應(yīng)用效果不盡如人意，原因在于涂層蛋白修飾物的失活、涂層生物活性的長(zhǎng)期保存等問(wèn)題。

2、真空冷凍干燥技術(shù)，簡(jiǎn)稱凍干，其基本流程是先將待干燥物料溶液降溫冷凍至共晶點(diǎn)以下，直至物料溶液完全凍結(jié)，不含任何液相，然后給凍結(jié)的物料提供熱量，在真空條件下，將物料溶液中的水分直接升華為氣態(tài)，再用冷阱將這些水蒸氣捕獲，最后得到干燥物料的過(guò)程。真空冷凍干燥是由真空技術(shù)、干燥技術(shù)、制冷技術(shù)等多種技術(shù)相互結(jié)合的重要的用于物質(zhì)干燥分離的化工過(guò)程。凍干工藝較普通濕法干燥相比優(yōu)越之處在于：冷凍干燥是在極低溫度下操作的，這能夠保持凍干后的物料理化性質(zhì)基本不變，避免了生物類物料受熱導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，保證了物料的生物活性；凍干的物料疏松多孔，具有較好的物理形狀，比表面積大，使用時(shí)可快速恢復(fù)到原來(lái)的性狀；凍干干燥效果好，可除去95％至99％以上的水分，密封后的干燥產(chǎn)品可以較長(zhǎng)時(shí)間保存而不變質(zhì)。

3、目前生物活性涂層制備工藝往往忽視干燥工藝的重要作用，或者采取較為傳統(tǒng)的干燥工藝，這就導(dǎo)致涂層中的活性蛋白修飾物過(guò)早失活，而失活的蛋白物質(zhì)又對(duì)醫(yī)用金屬產(chǎn)生強(qiáng)烈的腐蝕作用，降低了醫(yī)用金屬的使用壽命。因此，本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種適合于生物活性涂層的冷凍干燥處理工藝。

4、中國(guó)專利《一種基于蛋白質(zhì)顆粒的超疏水涂層及制備方法》(公開(kāi)號(hào)：cn112029146a)公開(kāi)了一種基于蛋白質(zhì)顆粒的超疏水涂層材料制備方法，包括以下具體步驟：s1：多孔基底材料的預(yù)處理；s2：蛋白質(zhì)顆粒的吸附和固定；s3：低表面能材料改性。其有蛋白質(zhì)團(tuán)簇的多孔基底材料經(jīng)活性污泥浸泡后需進(jìn)行干燥處理，除去大部分水分，采用常規(guī)干燥方法不利于保持蛋白顆?；钚?，實(shí)際應(yīng)用具有局限性。

5、中國(guó)專利《一種用于制備鎂合金心臟支架材料的多功能復(fù)合涂層及其制備方法》(公開(kāi)號(hào)：cn?114917414?a)公開(kāi)了一種用于制備鎂合金心臟支架材料的多功能復(fù)合涂層及其制備方法，該多功能復(fù)合涂層內(nèi)部是磷酸化的聚堿性氨基酸，在磷酸化的聚堿性氨基酸外部引入同時(shí)含有巰基和羧基的偶聯(lián)劑，并通過(guò)同時(shí)含有巰基和羧基的偶聯(lián)劑的偶聯(lián)作用，在外部引入親水性陰離子聚合物，最后通過(guò)浸漬-提拉的方法涂覆在鎂合金表面得到。該復(fù)合涂層經(jīng)乙醇清洗后經(jīng)n2氛圍干燥處理，保證了涂層被氧化但高溫干燥環(huán)境下涂層活性成分極易失活，降低涂層的生物功能。

6、中國(guó)專利《一種復(fù)合高分子材料表面防污涂層的制備方法》(公開(kāi)號(hào)：cn116285682a)公開(kāi)了通過(guò)高碘酸鈉氧化氫化咖啡酸介導(dǎo)牛血清白蛋白，在材料表面組裝蛋白質(zhì)涂層，首先氧化后的氫化咖啡酸迅速與牛血清白蛋白通過(guò)疏水相互作用聚集，同時(shí)，蛋白與酚類間形成的氫鍵和離子鍵增強(qiáng)了交聯(lián)效果，組裝形成穩(wěn)定的氫化咖啡酸介導(dǎo)牛血清白蛋白涂層，氫化咖啡酸介導(dǎo)牛血清白蛋白涂層展現(xiàn)了良好的抗細(xì)胞以及抗血小板粘附性能，具有一定的抗污效果，同時(shí)氫化咖啡酸介導(dǎo)牛血清白蛋白涂層表面具備的大量羧基基團(tuán)為二次接枝抗污分子提供可能，通過(guò)酰胺化反應(yīng)共價(jià)接枝聚乙二醇，得到復(fù)合高分子材料表面防污涂層。其制備過(guò)程反應(yīng)溫度高達(dá)70℃，臨近蛋白失活溫度，采取普通濕法干燥蛋白活性難以保證。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明為了克服現(xiàn)有生物活性涂層制備技術(shù)的不足，滿足實(shí)際應(yīng)用需要，設(shè)計(jì)了一種生物活性涂層的冷凍干燥處理工藝，該工藝可替代大多數(shù)生物活性涂層制備過(guò)程中的干燥工藝，保證涂層生物活性，延長(zhǎng)涂層使用壽命，助力涂層的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、一種適用于生物活性涂層的冷凍干燥處理工藝，包括以下步驟：

4、1)預(yù)處理液成分為甘露醇和叔丁醇，甘露醇在凍干過(guò)程中起骨架支撐作用，提高凍干效率，叔丁醇的作用是可與蛋白類物質(zhì)結(jié)合，改善凍干晶型，形成獨(dú)有針型晶型，增大凍干表面積，加速凍干。

5、所述預(yù)處理液中甘露醇質(zhì)量體積為8％w/v～12％w/v、叔丁醇的質(zhì)量體積為3％w/v～9％w/v，余量為水。

6、2)開(kāi)啟冷凍干燥機(jī)，設(shè)定進(jìn)料前擱板溫度為0.0±5.0℃，為凍干提供較高過(guò)冷度，在干燥后可在蛋白涂層表面形成堅(jiān)硬凍膠層，以隔絕空氣，防止涂層失活。

7、3)預(yù)處理待凍干的涂層制品，將外覆涂層的待干燥制品置于干燥容器中，使用噴壺向樣品表面噴涂常溫預(yù)處理液，待樣品表面噴涂均勻后，快速將樣品置于凍干機(jī)擱板上。

8、所述的外覆涂層的待干燥制品為鎂合金或鈦合金。

9、所述涂層為蛋白類。

10、4)調(diào)節(jié)冷凍干燥室溫度為-14.0±3℃，維持1～3小時(shí)。

11、5)調(diào)節(jié)冷凍干燥室溫度為-53.0±5.0℃，維持3～5小時(shí)，將涂層樣品快速冷凍；持續(xù)觀察冷凍情況，充足的冷凍時(shí)間可使晶體凍結(jié)更加堅(jiān)固，消除在升華階段出現(xiàn)制品熔化，蛋白涂層失活的隱患。

12、6)之后在-53.0±5.0℃下，設(shè)備抽真空；真空條件為由40±2pa遞減至20±2pa，每小時(shí)壓力下降不超過(guò)1pa，每小時(shí)壓力下降不超過(guò)1pa。

13、7)繼續(xù)調(diào)節(jié)冷凍干燥室溫度，4～6小時(shí)由-53.0±5.0℃緩慢升至-28.0±5.0℃；5～7小時(shí)由-28.0±5.0℃緩慢升至-8.0±5.0℃；維持冷凍干燥室溫度在-8.0±5.0℃7～9小時(shí)；3～5小時(shí)由-8.0±5.0℃緩慢升溫至0.0±5.0℃，在步驟6)設(shè)定的真空條件下保持3～5小時(shí)。

14、8)繼續(xù)調(diào)節(jié)冷凍干燥室溫度，2～4小時(shí)由0.0±5.0℃緩慢升溫至45.0±5℃，真空條件下保持3～5小時(shí)；真空條件為在10～30pa之間變壓狀態(tài)。最后冷凍干燥室在45.0±5℃恒溫時(shí)抽極限真空；解吸干燥階段主要任務(wù)是除去涂層中的較難除去的結(jié)合水，約占全部水分的5％，同時(shí)最高解吸干燥溫度不應(yīng)高于50℃，既保證蛋白涂層水分的徹底清除，也保證了涂層蛋白成分不失活。

15、上述步驟6)-步驟7)中的真空條件的設(shè)定摻氣量為0.09±0.03mbar。

16、9)關(guān)閉冷凍干燥機(jī)，真空條件下對(duì)外覆涂層樣品進(jìn)行包裝，調(diào)節(jié)冷凍干燥室內(nèi)環(huán)境為常壓后取出涂層樣品。凍干后，經(jīng)氣相測(cè)定，涂層樣品內(nèi)沒(méi)有叔丁醇?xì)埩?，免去了叔丁醇脫除的難題。

17、凍干后，經(jīng)氣相測(cè)定，涂層樣品內(nèi)沒(méi)有叔丁醇?xì)埩簟?/p>

18、本發(fā)明所公開(kāi)的技術(shù)方案，通過(guò)預(yù)處理、凍干條件調(diào)節(jié)等方式，實(shí)現(xiàn)涂層制品的冷凍干燥。從而在保證涂層原有的活性的基礎(chǔ)上，除去多余水分，保證涂層制品長(zhǎng)期不失活。

19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

20、1、本發(fā)明將制藥領(lǐng)域的冷凍干燥技術(shù)用于生物活性涂層處理工藝，大大增強(qiáng)生物涂層保存期限，保障了涂層不失活。

21、2、本發(fā)明篩選出適用蛋白類涂層的凍干輔料叔丁醇，可形成針型晶型，提高凍干效率，同時(shí)凍干結(jié)束后經(jīng)氣相檢測(cè)叔丁醇全部分離，對(duì)產(chǎn)品性質(zhì)無(wú)影響。

22、3、凍膠層原是凍干工藝中有害現(xiàn)象，是在凍干品表面形成的堅(jiān)固硬層，降低凍干效率，但在本發(fā)明中，有意形成特定的凍膠層，有效阻隔空氣及細(xì)菌的介入，進(jìn)一步保障涂層的活性及無(wú)菌性。

23、4、本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、工藝成熟可行，凍干后的涂層制品外觀規(guī)整、含水量極低，克服了現(xiàn)有生物活性涂層制備技術(shù)的不足，滿足實(shí)際應(yīng)用需要，可替代大多數(shù)生物活性涂層制備過(guò)程中的干燥工藝，保證涂層生物活性，延長(zhǎng)涂層使用壽命，助力涂層的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，為相關(guān)研究提供有力支撐。