本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，具體是一種基于新型磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)磷酸化修飾作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，廣泛參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)諸多生命活動(dòng)。雖然磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但由于磷酸肽豐度低、不易離子化且在質(zhì)譜鑒定中存在大量非特異性肽段的干擾，使得磷酸肽的直接鑒定存在很多困難。因此，研究快速高效、特異性強(qiáng)的磷酸肽富集分離方法仍然有著十分重要的意義。

目前，應(yīng)用較為廣泛的磷酸肽富集分離方法主要有金屬氧化物親和色譜法(Metal Oxide Affinity Chromatography，MOAC)和固相金屬離子親和色譜法(Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)。其中，金屬氧化物親和色譜法中基于TiO₂的富集分離方法由于具有較高的特異性和靈敏度而應(yīng)用最為頻繁。但研究證明TiO₂更易分離出單磷酸化肽段，由于TiO₂對(duì)多磷酸化位點(diǎn)肽段具有較強(qiáng)的吸附性而不易將其洗脫。該方法對(duì)于鑒定多磷酸肽仍然存在一定困難。因此，基于IMAC的磷酸肽富集分離策略由于對(duì)單位點(diǎn)磷酸化肽段和多位點(diǎn)磷酸化肽段的富集不存在偏性而受到了越來(lái)越多的關(guān)注。IMAC富集磷酸肽的基本原理是Zr⁴⁺，F(xiàn)e³⁺，Ti⁴⁺等金屬陽(yáng)離子與適當(dāng)?shù)呐潴w（如磷酸基團(tuán)、氨三乙酸、亞氨乙酸）進(jìn)行螯合形成金屬?gòu)?fù)合物從而將金屬離子固定在材料表面。在酸性環(huán)境下，磷酸肽特有的磷酸基團(tuán)通過(guò)與金屬離子的螯合作用吸附在材料上，從而與樣品中的非磷酸化肽段進(jìn)行了分離。在堿性環(huán)境下，這種特異性吸附作用被破壞，磷酸肽被洗脫下來(lái)進(jìn)而進(jìn)行鑒定。然而研究表明，基于傳統(tǒng)IMAC方法富集磷酸肽的特異性不高。一方面，單一金屬離子的應(yīng)用使材料在富集磷酸肽的同時(shí)也吸附了一些非特異性肽段，導(dǎo)致磷酸肽在質(zhì)譜檢測(cè)中信號(hào)受到抑制而影響檢測(cè)效果；另一方面，用于固載金屬的配體的親疏水性也直接影響磷酸肽的富集效果。

金屬有機(jī)骨架（metal-organic frameworks，MOF）材料是一類(lèi)由金屬離子和有機(jī)配位體通過(guò)自組裝形成的材料。由于其具有較大的比表面積和孔隙率、結(jié)構(gòu)和功能的可變性，已廣泛應(yīng)用于氫氣儲(chǔ)存、催化、生物傳感器、氣體分離等領(lǐng)域。

為了使MOFs材料有更廣泛的應(yīng)用，目前有兩種方法對(duì)MOFs材料進(jìn)行功能基團(tuán)修飾，即合成前功能化和合成后修飾。合成前功能化策略是指在MOFs材料合成前選擇具有功能基團(tuán)的配體，合成后的MOFs材料帶有此目標(biāo)基團(tuán)，IRMOFs（Isoreticular Metal–Organic Framework）和ZIF（Zeolitic Imidazolate Frameworks）系列材料都是利用該方法合成的。合成后修飾方法是指通過(guò)與MOFs材料的固有基團(tuán)的共價(jià)連接或與不飽和金屬離子的配位作用而引入新的功能基團(tuán)，該方法已被證明是MOFs材料進(jìn)行合成后修飾和應(yīng)用的一種高效而實(shí)用的方法。

最近，在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域研究中，MOFs材料已合成并應(yīng)用于大分子蛋白的篩除、低豐度肽段富集、磷酸肽/糖肽富集等。Gu等人合成了MIL-53，MIL-100，MIL-101用于肽段富集，由于MOFs材料中的孔徑結(jié)構(gòu)，使得在富集肽段的同時(shí)，又可以去除分子量較大的蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了蛋白和肽段的分離，然而這幾種MOFs材料需要借助離心的手段進(jìn)行分離，使得操作過(guò)程不便而且容易引起材料的丟失；Zhao等合成了Fe₃O₄@PDA@[Cu₃(btc)₂]用于不同蛋白酶的固定和蛋白質(zhì)的酶解，然而由于蛋白酶是通過(guò)非特異性吸附作用固定在材料上的，導(dǎo)致在蛋白質(zhì)酶切的過(guò)程中酶會(huì)隨著溫度等變化而從材料上脫落，這極大限制了該類(lèi)固定化酶反應(yīng)器的應(yīng)用。因此，考慮到蛋白酶固定在MOFs材料上的不同方式以及磁性材料易于操作的優(yōu)勢(shì)，設(shè)計(jì)和和合成新型的磁性MOFs材料用于蛋白酶的共價(jià)固定仍然是十分必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于新型磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種基于新型磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，包括：

（1）磁性MOFs材料Fe₃O₄@DOTA-ZIF-90的制備

首先，將DOTA共價(jià)連接到經(jīng)過(guò)氨基修飾的磁性納米材料NH₂-MNP表面；隨后金屬離子Zn²⁺通過(guò)與DOTA的螯合作用固定在材料表面形成Fe₃O₄@DOTA-Zn納米顆粒；然后，將所得到的Fe₃O₄@DOTA-Zn顆粒懸浮于含硝酸鋅和2-咪唑甲醛的DMF溶液中；

（2）磷酸肽富集

采用步驟（1）制備的磁性MOFs材料Fe₃O₄@DOTA-ZIF-90進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白和Hela細(xì)胞全蛋白提取物復(fù)雜樣本中的磷酸肽富集。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：步驟（1）的具體操作步驟為：一、將1mLNH₂-MNP置于含有10mgDOTA的乙腈溶液中，反應(yīng)4h，然后用水和乙醇分別洗滌三次；將磁性納米顆粒重懸在含有8mMZn(NO₃)₂·4H₂O的乙醇溶液中，70℃條件下反應(yīng)6h，得到Fe₃O₄@DOTA-Zn²⁺顆粒；將得到的Fe₃O₄@DOTA-Zn²⁺顆粒用乙醇和去離子水分別洗滌三次，并在4℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆?；二、將硝酸鋅和2-咪唑甲醛按2：3的摩爾比溶解于DMF溶液，然后從步驟一得到的Fe3O4@DOTA-Zn2+顆粒中取1mL加入到含硝酸鋅和2-咪唑甲醛的DMF溶液中，將混合物溶液在100℃條件下加熱18h，起始外層ZIF-90的生長(zhǎng)，得到磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90；三、通過(guò)外加磁場(chǎng)對(duì)上述磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90進(jìn)行分離和收集，并分別用DMF和二氯甲烷進(jìn)行洗滌，最后將所得磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90在80℃烘箱中烘干備用。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：步驟（2）的具體步驟為：取磁性MOF材料置于1.5mL離心管中，用上樣緩沖液（50%乙腈，1%TFA）清洗三次；向離心管中加入150μL上樣緩沖液重懸磁性MOF材料，加入蛋白酶切產(chǎn)物，室溫渦旋15min；在外加磁場(chǎng)作用下，吸去上清液，用上樣緩沖液和洗滌緩沖液（50%乙腈，0.1%TFA）各漂洗材料三次；用1μL 0.1M氨水洗脫結(jié)合在材料上的磷酸肽，重復(fù)五次。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述NH₂-MNP通過(guò)熱溶劑法制備。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

該合成的磁性MOF材料具有較大的金屬固載量、穩(wěn)定的金屬?gòu)?fù)合物以及良好的親水性；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合成的不同金屬離子固載的磁性MOF材料在全磷酸肽富集過(guò)程中具有更高的選擇性、靈敏度及富集效率；與傳統(tǒng)的TiO₂方法相比，由于材料具有良好的磁響應(yīng)能力使得操作過(guò)程更加省時(shí)、便捷。

附圖說(shuō)明

圖1為固載Ti的磁性MOF材料富集磷酸肽后的質(zhì)譜圖。

圖2為固載Zr的磁性MOF材料富集磷酸肽后的質(zhì)譜圖。

圖3為固載Fe的磁性MOF材料富集磷酸肽后的質(zhì)譜圖。

圖4為固載Tb的磁性MOF材料富集磷酸肽后的質(zhì)譜圖。

圖5為固載Tm的磁性MOF材料富集磷酸肽后的質(zhì)譜圖。

圖6為固載Ho的磁性MOF材料富集磷酸肽后的質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本專(zhuān)利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。

請(qǐng)參閱圖1-6，一種基于新型磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，包括：

（1）磁性MOFs材料Fe₃O₄@DOTA-ZIF-90的制備

磁性MOFs材料的合成方法使用熱溶劑法、合成前功能化法或合成后修飾法。首先，將DOTA共價(jià)連接到經(jīng)過(guò)氨基修飾的磁性納米材料NH₂-MNP表面；隨后金屬離子Zn²⁺通過(guò)與DOTA的螯合作用固定在材料表面形成Fe₃O₄@DOTA-Zn納米顆粒；然后，將所得到的Fe₃O₄@DOTA-Zn顆粒懸浮于含硝酸鋅和2-咪唑甲醛的DMF溶液中，基于DOTA和金屬離子Zn²⁺的金屬?gòu)?fù)合物的穩(wěn)定存在保證了MOFs材料在磁性納米顆粒表面的生長(zhǎng)；

具體操作步驟如下：一、將1mLNH₂-MNP置于含有10mgDOTA的乙腈溶液中，反應(yīng)4h，然后用水和乙醇分別洗滌三次；將磁性納米顆粒重懸在含有8mMZn(NO₃)₂·4H₂O的乙醇溶液中，70℃條件下反應(yīng)6h，得到Fe₃O₄@DOTA-Zn²⁺顆粒；將得到的Fe₃O₄@DOTA-Zn²⁺顆粒用乙醇和去離子水分別洗滌三次，并在4℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆?；二、將硝酸鋅和2-咪唑甲醛按2：3的摩爾比溶解于DMF溶液，然后從步驟一得到的Fe3O4@DOTA-Zn2+顆粒中取1mL加入到含硝酸鋅和2-咪唑甲醛的DMF溶液中，將混合物溶液在100℃條件下加熱18h，起始外層ZIF-90的生長(zhǎng)，得到磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90；三、通過(guò)外加磁場(chǎng)對(duì)上述磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90進(jìn)行分離和收集，并分別用DMF和二氯甲烷進(jìn)行洗滌，最后將所得磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90在80℃烘箱中烘干備用。

（2）磁性MOFs材料Fe₃O₄@DOTA-ZIF-90的表征

使用掃描電鏡（HitachiS-4800）觀(guān)察磁性MOFs材料的形貌、粒徑和尺寸；采用能量散射X射線(xiàn)進(jìn)行元素分析；紅外光譜分析由Nicolet傅立葉變換紅外光譜儀（Nicolet）完成，樣品采用KBr壓片法制備；熱重分析（TGA）由熱重分析儀（SDTQ600）完成，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作在氮?dú)夥諊M(jìn)行；樣品磁學(xué)性能用物理性能測(cè)量系統(tǒng)（QuantumDesign）在室溫下測(cè)定；X射線(xiàn)衍射分析使用布魯克X射線(xiàn)衍射儀（D8Advance）完成。

（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶切產(chǎn)物的制備

將500μg標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白α-酪蛋白溶解于100μL的50mM碳酸氫銨溶液，放入沸水中變性10min；按蛋白質(zhì)：胰蛋白酶=50：1的質(zhì)量比加入胰蛋白酶，在37℃水浴中孵育16h，收集的酶切肽段分裝后在-20℃條件下保存，備用；將1mg牛血清白蛋白（BSA）溶解于50mM碳酸氫銨溶液，經(jīng)過(guò)DTT還原變性和IAA烷基化處理后，按上述步驟進(jìn)行酶切，收集的肽段分裝后在-20℃條件下保存，備用。

（4）Hela細(xì)胞蛋白酶切產(chǎn)物的制備

將Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，5%CO₂，飽和濕度）；收集培養(yǎng)的Hela細(xì)胞置于細(xì)胞裂解液中（8M尿素，50mMTris-HCL緩沖液，1%二硫蘇糖醇，1mM氟化鈉，0.2mM釩酸鈉，2mM焦磷酸鈉），冰上裂解30min后，將樣品在4℃以14000g轉(zhuǎn)速離心10min；收集上清液，在沸水中變性5min；變性后的蛋白樣品的酶切使用FASP(filteraidedsamplepreparation)方法去除尿素，最后用NanoDrop測(cè)量收集的肽段濃度。

（5）磷酸肽富集

取磁性MOF材料置于1.5mL離心管中，用上樣緩沖液（50%乙腈，1%TFA）清洗三次；向離心管中加入150μL上樣緩沖液重懸磁性MOF材料，加入蛋白酶切產(chǎn)物，室溫渦旋15min；在外加磁場(chǎng)作用下，吸去上清液，用上樣緩沖液和洗滌緩沖液（50%乙腈，0.1%TFA）各漂洗材料三次；用1μL0.1M氨水洗脫結(jié)合在材料上的磷酸肽，重復(fù)五次。將洗脫下來(lái)的磷酸肽與1μLDHB基質(zhì)（50%ACN，0.1%H₃PO₄）混合點(diǎn)于4800MALDI-TOF/TOFMS靶上，自然風(fēng)干后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，或?qū)⑾疵撓聛?lái)的磷酸肽經(jīng)過(guò)脫鹽處理后進(jìn)行液-質(zhì)聯(lián)用分析。

作為優(yōu)選，所述NH₂-MNP通過(guò)熱溶劑法制備；

一、磁性MOFs材料Fe₃O₄@DOTA-ZIF-90的表征結(jié)果：

磁性MOFs材料Fe₃O₄@DOTA-ZIF-90的粒徑明顯增大，平均直徑約為30um；ZIF-90成功沉積在磁性納米材料中；磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90具有極良好的熱穩(wěn)定性；磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90可以在外加磁場(chǎng)的作用下實(shí)現(xiàn)快速分離；磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90具有較大比表面積。

二、固載不同金屬離子的磁性MOF材料富集磷酸肽效果考察

實(shí)驗(yàn)組處理：首先，1ugα-酪蛋白酶切后肽段與150uL單一過(guò)渡金屬離子固載的磁性MOF材料室溫混合15mins，通過(guò)外加磁場(chǎng)分離后磁性MOF材料經(jīng)上樣緩沖液（50%乙腈，1%TFA）、洗滌緩沖液（50%乙腈，0.1%TFA）和去離子水各洗滌三次，最后用0.1M氨水洗脫富集的磷酸肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。

對(duì)照組處理：未經(jīng)材料富集的α-酪蛋白酶切后肽段直接進(jìn)行質(zhì)譜分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：磷酸化肽段且信號(hào)顯著提高，非磷酸化肽段幾乎檢測(cè)不到。其中，經(jīng)Fe₃O₄@DOTA-ZIF-90-Ti和Fe₃O₄@DOTA-ZIF-90-Tb富集后可鑒定到15條磷酸化肽段，而基于Zr⁴⁺，F(xiàn)e³⁺，Tm³⁺，Ho³⁺固載的磁性MOF材料可分別鑒定到14，11，11，13條磷酸肽。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果其結(jié)果Fe₃O₄@DOTA-ZIF-90-Ti和Fe₃O₄@DOTA-ZIF-90-Tb的富集結(jié)果較好，而且經(jīng)Fe3O4@DOTA-ZIF-90-Ti和Fe3O4@DOTA-ZIF-90-Tb富集后鑒定到的磷酸肽中，多磷酸肽占46.67%，其比例高于其他金屬離子固載的磁性納MOF材料富集的多磷酸肽比例，說(shuō)明在磷酸肽富集過(guò)程中，不同金屬離子直接影響多磷酸肽的吸附效果。

三、固載不同金屬離子的磁性MOF材料富集磷酸肽的靈敏度考察

實(shí)驗(yàn)處理：降低富集樣品的上樣量，當(dāng)樣品上樣量為100fmol時(shí)，對(duì)α-酪蛋白酶切產(chǎn)物進(jìn)行磷酸肽富集。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)過(guò)渡金屬Ti，Zr，F(xiàn)e固載的磁性MOF材料富集后仍可檢測(cè)到5，4，5條磷酸化肽段，而經(jīng)鑭系金屬離子Tb，Tm，Ho固載的磁性MOF材料富集后可鑒定到3，2，3條磷酸肽。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：過(guò)渡金屬對(duì)于磷酸肽富集的靈敏度在整體上優(yōu)于鑭系金屬對(duì)磷酸肽的富集靈敏度。

四、固載不同金屬離子的磁性MOF材料富集磷酸肽的使用重復(fù)性考察

實(shí)驗(yàn)處理：將磁性MOF材料用洗脫液進(jìn)行充分洗滌，所得材料對(duì)α-酪蛋白酶切產(chǎn)物進(jìn)行磷酸肽富集，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)過(guò)5次富集后，固載過(guò)渡金屬Ti，Zr，F(xiàn)e的磁性MOF材料仍可鑒定到17，15，16條磷酸肽，而固載鑭系金屬Tb，Tm，Ho的磁性MOF材料仍可以檢測(cè)到17，16，17條磷酸肽。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：固載過(guò)渡金屬Ti，Zr，F(xiàn)e，Tb，Tm和Ho的磁性MOF材料對(duì)于磷酸肽富集具有良好的使用重復(fù)性，也說(shuō)明鑭系金屬與DOTA之間較強(qiáng)的螯合作用。

五、固載不同金屬離子的磁性MOF材料富集磷酸肽的特異性考察

實(shí)驗(yàn)處理：將α-酪蛋白酶切產(chǎn)物與非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶切產(chǎn)物按1：50比例混合，經(jīng)過(guò)固載不同金屬離子的磁性MOF材料進(jìn)行磷酸肽富集，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)過(guò)渡金屬Ti，Zr，F(xiàn)e固載的磁性MOF材料富集后可以分別檢測(cè)到14，12，12條信號(hào)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)的磷酸肽對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰，而經(jīng)鑭系金屬Tb，Tm，Ho固載的磁性MOF材料富集后可以分別檢測(cè)到15，12，17條磷酸肽。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：鑭系金屬固載的磁性MOF材料對(duì)磷酸肽的特異性富集效果優(yōu)于過(guò)渡金屬固載的磁性MOF材料對(duì)磷酸肽的特異性富集。

六、固載不同金屬離子的磁性MOF材料用于Hela細(xì)胞蛋白酶切產(chǎn)物全磷酸肽的富集

實(shí)驗(yàn)處理:首先，將1.0mgHela細(xì)胞蛋白提取液進(jìn)行胰蛋白酶酶切、凍干后用上樣緩沖液（50%乙腈，1%TFA）進(jìn)行重溶；然后，重溶的酶切樣品經(jīng)Fe₃O₄@DOTA-ZIF-90-Ti和Fe₃O₄@DOTA-ZIF-90-Tb兩種材料進(jìn)行全磷酸肽富集；最后，將收集的磷酸肽樣品經(jīng)除鹽處理后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：一共鑒定到13450條磷酸肽，對(duì)應(yīng)2965個(gè)磷酸化蛋白，其中13116條是特異性磷酸肽。磷酸肽富集特異性高達(dá)94%，說(shuō)明發(fā)展的新方法克服了IMAC材料富集磷酸肽過(guò)程中非特異性肽段吸附較多的缺點(diǎn)，在富集特異性方面有了顯著提升；在所有富集的磷酸肽中，48.16%是單磷酸肽，35.97%是具有兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)的肽段，11.36%是具有三個(gè)磷酸化位點(diǎn)的肽段，4.5%是是具有四個(gè)磷酸化位點(diǎn)的肽段。多磷酸肽在鑒定到的特異性肽段中的比例超過(guò)了50%，該方法的多磷酸肽富集效果明顯優(yōu)于DHB/TiO₂法。

該合成的磁性MOF材料具有較大的金屬固載量、穩(wěn)定的金屬?gòu)?fù)合物以及良好的親水性；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合成的不同金屬離子固載的磁性MOF材料在全磷酸肽富集過(guò)程中具有更高的選擇性、靈敏度及富集效率；與傳統(tǒng)的TiO₂方法相比，由于材料具有良好的磁響應(yīng)能力使得操作過(guò)程更加省時(shí)、便捷。

上面對(duì)本專(zhuān)利的較佳實(shí)施方式作了詳細(xì)說(shuō)明，但是本專(zhuān)利并不限于上述實(shí)施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專(zhuān)利宗旨的前提下做出各種變化。