技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物化學(xué)工程領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的生物化學(xué)回收方法，在該方法中可以使基于IL-15/IL-15Rα的綴合物以單體形式重折疊和回收。該組合物可以用于藥物制劑。

背景技術(shù)：

在免疫療法中，人們特別感興趣的是基于細(xì)胞因子的免疫療法。這些為可溶性分子的分子調(diào)節(jié)體液和/或細(xì)胞免疫。在這些分子中，人們更特別感興趣的是IL-2、IL-7、IL-12和IL-15，這是由于這些分子誘導(dǎo)NK細(xì)胞的存活和/或增殖，因此其作為用于治療感染或癌癥的助劑而被關(guān)注。

最早在類人猿腎上皮細(xì)胞系CV-1/EBNA和T細(xì)胞白血病細(xì)胞系HuT-102的培養(yǎng)物上清液中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-15(IL-15)。IL-15的cDNA序列編碼162個氨基酸(aa)的前體蛋白，該前體蛋白由一個長的48-aa的前導(dǎo)肽和一個114-aa的成熟蛋白組成。盡管IL-15與IL-2不具有序列同源性，但是氨基酸序列分析預(yù)測，IL-15與IL-2一樣，為四α螺旋束細(xì)胞因子家族的一員。

實(shí)際上將白細(xì)胞介素-15看作是一種非常有前途的未來藥物。然而，由于IL-15的短的半衰期及其它參數(shù)，其在哺乳動物細(xì)胞系中的生產(chǎn)實(shí)際上是以低產(chǎn)量進(jìn)行的。

專利US 8,124,084 B2和EP 1,934,353 B1中描述了基于白細(xì)胞介素-15及其受體IL-15Rα或其片段的新的綴合物。

不過，盡管這些綴合物具有顯著更長的半衰期，但是其純化由于二聚的和多聚的復(fù)合物的形成而變得復(fù)雜。此外，由于存在高百分?jǐn)?shù)的二聚的和低聚的聚集體，因此，相應(yīng)的純化組合物不能用作藥劑，因?yàn)榫奂w可能參與針對注射用生物制品的免疫原性/過敏性反應(yīng)(抗藥物抗體，ADA)。

因此，需要新的純化方法從而獲得能夠用作藥劑的綴合物組合物。

發(fā)明概述

提供一種用于單體綴合物的制備的純化方法。該方法提供包含這種單體綴合物的液體藥物組合物。該方法包括可能增強(qiáng)所述綴合物在回收過程中重折疊的條件。

發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)了一種采用陰離子交換色譜、然后采用疏水相互作用色譜的純化過程能夠獲得單體形式的綴合物；但是采用疏水相互作用色譜、然后采用陰離子交換色譜的純化不能獲得單體形式的綴合物。此外，發(fā)明人已經(jīng)驚奇地證實(shí)疏水相互作用色譜的上樣步驟必須通過如下完成：將第一洗脫液與上樣緩沖液直接混合至所述色譜柱的混合室內(nèi)。事實(shí)上，這種上樣程序是使能夠獲得高濃度的單體形式的活性融合蛋白而不具有其在色譜樹脂上的共沉淀的最有效的程序。

第一方面，因此，本發(fā)明涉及一種用于制備包含來自樣品的單體綴合物的組合物的方法，所述綴合物包含：

a)包含白細(xì)胞介素15或其衍生物的氨基酸序列的多肽，和

b)包含IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域或其衍生物的氨基酸序列的多肽；

其中，所述方法包括陰離子交換色譜、然后是疏水相互作用色譜對所述樣品的應(yīng)用。

第二方面，本發(fā)明涉及一種包含所述單體綴合物的藥物組合物。

第三方面，本發(fā)明涉及所述組合物用于治療受試者中的癌癥和/或感染的用途。

附圖說明

圖1示出了在CHO細(xì)胞系中RLI生產(chǎn)的兩個色譜洗脫曲線。

圖2示出了在CHO細(xì)胞系中RLI生產(chǎn)的尺寸排阻色譜曲線。

圖3示出了采用IL-15抗體對在CHO細(xì)胞系(第2至7泳道)或在畢赤酵母(Pichia pastoris)(第9和10泳道)中產(chǎn)生的RLI的蛋白質(zhì)印跡。通過聚糖酶(PNGase)的RLI的去糖基化對應(yīng)于第3、5、7和10泳道。

圖4示出了RLI產(chǎn)品的SEC-MALLS譜圖(光散射)。

圖5示出了不同的RLI生產(chǎn)對kit225細(xì)胞系的增殖活性。

圖6示出了不同的RLI生產(chǎn)對32DB細(xì)胞系的增殖活性。

圖7示出了在小鼠注射若干RLI樣品后獲得的小鼠NK增殖。

發(fā)明詳述

本發(fā)明涉及一種新的用于制備包含單體綴合物的藥物組合物的方法。

術(shù)語“單體(的)”是指存在于組合物中的大多數(shù)綴合物是單體的而不是聚集的?！熬奂摹笔侵付嚯姆肿又g的物理相互作用而形成多聚體，即二聚體或低聚體，這些多聚體保持是可溶性的，也可從溶液中沉淀出來。大多數(shù)時候，這種聚集的狀態(tài)是不可逆的，并且導(dǎo)致所述綴合物的變性。在綴合物變性之后，必須注意該綴合物可與強(qiáng)的免疫原性相關(guān)。

在所述組合物中，單體形式的綴合物百分?jǐn)?shù)(以重量計)，即與其聚集的形式相對的，為至少80％或更多，優(yōu)選地為至少90％或更高，和更優(yōu)選地為至少95％或更高。

術(shù)語“樣品”是指表達(dá)所述綴合物的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基樣品。用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選地為CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞，如CHO K1(ATCC編號：CCL-31，CCL-61或CRL-9618)、CHO-DHFR(ATCC CRL-9096)、CHO-DXB-11、具有ATTC編號為ATCC CRL 1610或CHO DG44的CHO細(xì)胞；HEK293(人胚腎)，如293(ATCC編號：CRL-1573)或HEK-293.2sus(ATCC編號：CRL-1573.3)；COS細(xì)胞，如COS-1(ATCC編號：CRL-1650)和COS-7(ATCC編號：CRL-1651)；PER.細(xì)胞(人視網(wǎng)膜源性細(xì)胞系；DSM BIOLOGICS，CRUCELL)；SP2O，如SP2/0-Agl4細(xì)胞(ATCC登錄號：CRL-1851)，NSO細(xì)胞或源于它們的任何細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞對應(yīng)于CHO細(xì)胞系。

在第一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的方法包括如下步驟：

(a)使所述樣品經(jīng)受陰離子交換色譜(AEX)以產(chǎn)生第一洗脫液；

(b)使所述第一洗脫液經(jīng)受疏水相互作用色譜(HIC)以產(chǎn)生第二洗脫液。

陰離子交換色譜(AEX)的第一步驟可以采用選自包含以下或由以下組成的組的AEX柱或樹脂完成：Q Sepharose(如Q Sepharose Fast Flow、Q Sepharose XL、大珠子Q Sepharose、高效Q sepharose和Q sepharose XL)、DEAE Sephadex A-25、DEAE Sephadex A-50、QAE Sephadex A-25、QAE Sephadex A-50、Sourse 15Q、Sourse 30Q、Resourse Q、Capto Q、Capto DEAE、Mono Q、Toyopearl Super Q、Toyopearl DEAE、Toyopearl QAE、Toyopearl Q、Toyopearl GigaCap Q；TSKgel SuperQ、TSKgel DEAE、Fractogel EMD TMAE、Fractogel EMD TMAE HiCap、Fractogel EMD DEAE、Fractogel EMD DMAE、Macroprep High Q、Macro-prep-DEAE、Unosphere Q、Nuvia Q、POROS HQ、POROS PI、DEAE Ceramic HyperD和Q Ceramic HyperD；DEAE Sepharose Fast Flow和ANX Sepharose 4Fast Flow。

有利地，所述AEX樹脂或柱對應(yīng)于Q Sepharose或DEAE Sepharose，和更優(yōu)選地對應(yīng)于如Q Sepharose的強(qiáng)陰離子交換劑。

現(xiàn)在，所述步驟a)通常以一定數(shù)量的步驟實(shí)施，所述一定數(shù)量的步驟包括所述柱或樹脂的平衡、樣品的探索(scouting)和洗脫。在上樣之后和洗脫之前可包括一個或多個洗滌步驟。

根據(jù)制造商的說明可簡單地實(shí)施平衡步驟。

如發(fā)明人所確定的，所述探索步驟采用NaCl緩沖液來完成。作為一個實(shí)例，所述探索緩沖液包含0.5M至1.5M NaCl，優(yōu)選地包含0.75M至1.25M NaCl，和最優(yōu)選地包含1M NaCl。

所述探索步驟優(yōu)選地在采用超濾盒的濃縮和滲濾的培養(yǎng)上清液上實(shí)現(xiàn)。

陰離子交換色譜(AEX)的制造商建議采用比所述待純化蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)少至少一個pH單位的pH。

意外地，雖然RLI1(SEQ ID NO:16)或RLI2(SEQ ID NO:17)具有將近5.5的電點(diǎn)，發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)了所述步驟a)必須在pH等于或大于7.0，優(yōu)選地等于或大于7.5下實(shí)施。

所述陰離子交換色譜(AEX)的洗脫步驟在采用1至0M NaCl，優(yōu)選地0.75至0M NaCl的鹽水緩沖液的梯度中實(shí)現(xiàn)。

疏水相互作用色譜(HIC)的步驟b)可以采用選自包含以下或由以下組成的組的HIC柱或樹脂完成：Phenyl Sepharose、Butyl Sepharose、Octyl Sepharose、ToyoPearl Hexyl-650、ToyoPearl Ether-650、Hydrocell C3、Hydreocell Phenyl 1500或Hydrocell C4 1500。

有利地，所述HIC樹脂或柱對應(yīng)于Phenyl Sepharose。

如同對于步驟a)，所述步驟b)通常包括一定數(shù)量的步驟，所述一定數(shù)量的步驟包括所述柱或樹脂的平衡、樣品的上樣和洗脫。在上樣之后和洗脫之前可包括一個或多個洗滌步驟。

再次，根據(jù)制造商的說明可簡單地實(shí)施平衡步驟。

對于所述探索步驟，所述緩沖溶液包含銨鹽，如硫酸銨或醋酸銨，優(yōu)選地包含硫酸銨。例如，所述探索緩沖液包含0.75M至2.5M硫酸銨，優(yōu)選地包含1M至2M硫酸銨，和最優(yōu)選地包含1.5M至2M硫酸銨。

所述探索步驟是關(guān)鍵的。在發(fā)明人認(rèn)識到的經(jīng)驗(yàn)中，所有的純化都得到了可變量的綴合物，該綴合物主要是聚集的形式。

意外地，發(fā)明人通過將自步驟a)獲得的第一洗脫液與探索緩沖液直接在所述色譜柱或樹脂上，更尤其是直接在所述色譜柱或樹脂的混合室內(nèi)混合成功地獲得了單體形式的綴合物。

所述洗脫步驟在采用2至0M硫酸銨，優(yōu)選地1.5M至0M硫酸銨的鹽水緩沖液的梯度中實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明的方法可包括一個或多個進(jìn)一步的步驟。

作為一個實(shí)例，所述本發(fā)明的方法可包括使所述第二洗脫液經(jīng)受尺寸排阻色譜(SEC)以產(chǎn)生第三洗脫液的步驟。

所述尺寸排阻色譜(SEC)的步驟可通過采用如Superdex 200或Superdex 75的SEC柱完成。

作為另一個實(shí)例，本發(fā)明的方法還可包括使所述第二洗脫液經(jīng)受另一個陰離子交換色譜(AEX)以產(chǎn)生第三洗脫液的步驟。

所述陰離子交換色譜的步驟可按照前述完成。

在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將獲得的綴合物用于制備藥劑的步驟。

術(shù)語“綴合物”以其在本領(lǐng)域中的一般含義使用，是指共價或非共價復(fù)合物，優(yōu)選地是指共價復(fù)合物，且最優(yōu)選地是指融合蛋白。

術(shù)語“白細(xì)胞介素15”為其在本領(lǐng)域的一般含義，是指具有與IL-2的結(jié)構(gòu)相似性的細(xì)胞因子(GRABSTEIN等,Science,vol.264(5161),p:965-968,1994)。這種細(xì)胞因子也被稱為IL-15、IL15或MGC9721。這種細(xì)胞因子和IL-2共享許多生物活性，且發(fā)現(xiàn)它們結(jié)合相同的促紅細(xì)胞生成素受體亞基。因此，IL-15和IL-12可以競爭相同的受體，從而負(fù)調(diào)節(jié)彼此的活性。已經(jīng)證實(shí)，IL-15調(diào)節(jié)T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活化和增殖，且證明CD8+記憶細(xì)胞的數(shù)量由這種細(xì)胞因子和IL-2之間的平衡來控制。如實(shí)施例中所公開的，IL-15的活性可以通過測定其對kit225細(xì)胞系的增殖誘導(dǎo)來測量(HORI等,Blood,vol.70(4),p:1069-72,1987)。

對于kit225細(xì)胞系的增殖誘導(dǎo)，所述IL-15或其衍生物具有人白細(xì)胞介素-15的活性的至少10％，優(yōu)選地至少25％，更優(yōu)選地至少50％。

所述白細(xì)胞介素15為哺乳動物白細(xì)胞介素15，優(yōu)選地為靈長類動物白細(xì)胞介素15，更優(yōu)選地為人白細(xì)胞介素15。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以簡單地識別哺乳動物白細(xì)胞介素15。作為一個實(shí)例，可以引用源自野豬(Sus scrofa)(登錄號：ABF82250)、褐家鼠(Rattus norvegicus)(登錄號：NP_037261)、小家鼠(Mus masculus)(登錄號：NP_032383)、牛(Bos Taurus)(登錄號：NP_776515)、家兔(Oryctolagus cuniculus)(登錄號：NP_001075685)、綿羊(Ovies aries)(登錄號：NP_001009734)、家貓(Felis catus)(登錄號：NP_001009207)、食蟹猴(Macaca fascicularis)(登錄號：BAA19149)、智人(登錄號：NP_000576)、恒河猴(Macaca Mulatta)(登錄號：NP_001038196)、土撥鼠(Cavia porcellus)(登錄號：NP_001166300)或綠猴(Chlorocebus sabaeus)(登錄號：ACI289)的白細(xì)胞介素15。

本文所用術(shù)語“哺乳動物白細(xì)胞介素15”是指共有序列SEQ ID NO:1。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以簡單地識別靈長類動物白細(xì)胞介素15。作為一個實(shí)例，可以引用源自野豬(登錄號：ABF82250)、家兔(登錄號：NP_001075685)、食蟹猴(登錄號：BAA19149)、智人(登錄號：NP_000576)、恒河猴(登錄號：NP_001038196)或綠猴(登錄號：ACI289)的白細(xì)胞介素15。

本文所用術(shù)語“靈長類動物白細(xì)胞介素15”是指共有序列SEQ ID NO:2。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以簡單地識別人白細(xì)胞介素15，且所述人白細(xì)胞介素15是指氨基酸序列SEQ ID NO:3。

本文所用術(shù)語“白細(xì)胞介素15的衍生物”是指與選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少92.5％(即對應(yīng)于約10個氨基酸置換)、優(yōu)選地至少96％(即對應(yīng)于約5個氨基酸置換)、更優(yōu)選地至少98.5％(即對應(yīng)于約2個氨基酸置換)或至少99％(即對應(yīng)于約1個氨基酸置換)同一性百分?jǐn)?shù)的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其自身的知識及本專利申請的教導(dǎo)可以簡單地識別這類衍生物。作為這類衍生物的一個實(shí)例，可以引用國際專利申請PCT WO 2009/135031中描述的那些。還應(yīng)當(dāng)理解的是天然的氨基酸可以被化學(xué)修飾的氨基酸替換。通常，這種化學(xué)修飾的氨基酸增加多肽的半衰期。

本文所用術(shù)語兩個氨基酸序列之間的“同一性百分?jǐn)?shù)”是指通過待進(jìn)行比較的兩個序列的最佳比對獲得的所述兩個序列之間相同氨基酸的百分?jǐn)?shù)，這一百分?jǐn)?shù)是純粹統(tǒng)計學(xué)意義的且兩個序列之間的差異被隨機(jī)地分布于氨基酸序列中。本文所用“最佳比對”或“最優(yōu)比對”是指所確定的同一性百分?jǐn)?shù)(參見下文)最高的比對。兩個氨基酸序列之間的序列比較通常是通過比較事先已經(jīng)根據(jù)最佳比對來比對過的序列而實(shí)現(xiàn)的；這一比較在片段比較中實(shí)現(xiàn)，以便識別和比較局部區(qū)域的相似性。除通過手動方式之外，實(shí)施比較的最佳序列比對可以通過采用由SMITH和WATERMAN開發(fā)的全局同源算法(Ad.App.Math.,vol.2,p:482,1981)、由NEDDLEMAN和WUNSCH開發(fā)的局部同源算法(J.Mol.Biol.,vol.48,p:443,1970)、由PEARSON和LIPMAN開發(fā)的相似法(Proc.Natl.Acd.Sci.USA,vol.85,p:2444,1988)、使用這種算法的計算機(jī)軟件(Wisconsin Genetics軟件包中的GAP、BESTFIT、BLAST P、BLAST N、FASTA、TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI USA)、MUSCIE多重比對算法(Edgar,Robert C.,Nucleic Acids Research,vol.32,p:1792,2004)來實(shí)現(xiàn)。為了獲得最佳的局部比對，可以優(yōu)選使用具有BLOSUM 62矩陣的BLAST軟件。兩個氨基酸序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)是通過比較最佳比對的兩個序列確定的，所述氨基酸序列能夠包含相對于參考序列的添加或缺失，以便得到兩個序列之間的最佳比對。通過以下方法來計算同一性百分?jǐn)?shù)：確定兩個序列中相同位點(diǎn)的數(shù)量，用該數(shù)量除以比較的位點(diǎn)的總數(shù)，然后所得結(jié)果乘以100，從而得到兩個序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)。

優(yōu)選地，所述白細(xì)胞介素15的衍生物是IL-15激動劑或超激動劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠簡單地識別IL-15-激動劑或IL-15-超激動劑。作為IL-15-激動劑或IL-15-超激動劑的一個實(shí)例，可以引用國際專利申請WO2005/085282或ZHU等(J.Immunol.,vol.183(6),p:3598-607,2009)中公開的那些。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述IL-15激動劑或超激動劑選自包含以下或由以下組成的組：L45D、L45E、S51D、L52D、N72D、N72E、N72A、N72S、N72Y和N72P(參考人IL-15的序列，SEQ ID NO:3)。

本文所用術(shù)語“IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域”具有其在本領(lǐng)域的一般含義，是指起始于IL-15Rα的信號肽之后的第一個半胱氨酸殘基(C1)，并終止于所述信號肽之后的第四個半胱氨酸殘基(C4)的結(jié)構(gòu)域。對應(yīng)于IL-15Rα的胞外區(qū)域的一部分的所述sushi結(jié)構(gòu)域是其結(jié)合至IL-15所必需的(WEI等,J.Immunol.,vol.167(1),p:277-282,2001)。

所述IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域或其衍生物具有人IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域?qū)θ税准?xì)胞介素-15的結(jié)合活性的至少10％，優(yōu)選至少25％，更優(yōu)選至少50％。所述結(jié)合活性可以通過WEI等公開的方法(上述提及，2001)簡單地確定。

所述IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域?yàn)椴溉閯游颕L-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地為靈長類動物IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域，更優(yōu)選地為人IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可簡單地識別哺乳動物IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域。作為一個實(shí)例，可以引用源自褐家鼠(登錄號：XP_002728555)、小家鼠(登錄號：EDL08026)、牛(登錄號：XP_002692113)、家兔(登錄號：XP_002723298)、食蟹猴(登錄號：ACI42785)、豚尾猴(Macaca nemestrina)(登錄號：ACI42783)、智人(登錄號：CAI41801)、恒河猴(Macaca Mulatta)(登錄號：NP_001166315)、蘇門答臘猩猩(Pongo abelii)(登錄號：XP_002820541)、白頸白眉猴(Cercocebus torquatus)(登錄號：ACI42784)、普通狨(Callithrix jacchus)(登錄號：XP_002750073)或豚鼠(Cavia porcellus)(登錄號：NP_001166314)的IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域。

本文所用術(shù)語“哺乳動物IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域”是指共有序列SEQ ID NO:4。

優(yōu)選地，包含哺乳動物IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的多肽是指共有序列SEQ ID NO:5。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可簡單地識別靈長類動物IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域。作為一個實(shí)例，可以引用來自家兔、食蟹猴、豚尾猴、智人、恒河猴、蘇門答臘猩猩、白頸白眉猴或普通狨的IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域。

本文所用術(shù)語“靈長類動物IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域”指共有序列SEQ ID NO:6。

優(yōu)選地，包含靈長類動物IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的多肽是指共有序列SEQ ID NO:7。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可簡單地識別人IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域，并且所述人IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域是指氨基酸序列SEQ ID NO:8。

優(yōu)選地，包含人IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的多肽是指SEQ ID NO:9。

本文所用術(shù)語“IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域的衍生物”是指與選自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少92％(即對應(yīng)于約5個氨基酸置換)、優(yōu)選地至少96％(即對應(yīng)于約2個氨基酸置換)、更優(yōu)選地至少98％(即對應(yīng)于約1個氨基酸置換)同一性百分?jǐn)?shù)的氨基酸序列。這類衍生物包含L-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域的四個半胱氨酸殘基，且本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其自身的一般知識及本專利申請的教導(dǎo)可以簡單地識別這類衍生物。還應(yīng)當(dāng)理解的是天然的氨基酸可以被化學(xué)修飾的氨基酸替換。通常，這種化學(xué)修飾的氨基酸能夠增加多肽的半衰期。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述綴合物包含(ii)包含IL-15Rα的sushi和鉸鏈結(jié)構(gòu)域或其衍生物的氨基酸序列的多肽。

所述IL-15Rα鉸鏈結(jié)構(gòu)域定義為開始于sushi結(jié)構(gòu)域后的第一個氨基酸殘基并終止于第一個糖基化潛在位點(diǎn)前的最后一個氨基酸殘基的氨基酸序列。在人IL-15Rα中，所述絞鏈區(qū)的氨基酸序列由十四個氨基酸組成，所述十四個氨基酸位于該IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域之后，位于相對于所述sushi結(jié)構(gòu)域的C末端位置，即所述IL-15Rα絞鏈區(qū)開始于所述(C4)半胱氨酸殘基后的第一個氨基酸且終止于第十四個氨基酸(以標(biāo)準(zhǔn)的“從N-末端到C-末端”方向計數(shù))。

所述IL-15Rα的sushi和鉸鏈結(jié)構(gòu)域?yàn)椴溉閯游颕L-15Rα的sushi和鉸鏈結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地為靈長類動物IL-15Rα的sushi和鉸鏈結(jié)構(gòu)域，更優(yōu)選地為人IL-15Rα的sushi和鉸鏈結(jié)構(gòu)域。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可簡單地識別哺乳動物IL-15Rα的sushi和鉸鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。本文所用術(shù)語“哺乳動物IL-15Rα的sushi和鉸鏈結(jié)構(gòu)域”是指共有序列SEQ ID NO:10。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可簡單地識別靈長類動物IL-15Rα的sushi和鉸鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。本文所用術(shù)語“靈長類動物IL-15Rα的sushi和鉸鏈結(jié)構(gòu)域”是指共有序列SEQ ID NO:11。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可簡單地識別人IL-15Rα的sushi和鉸鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。本文所用術(shù)語“人IL-15Rα的sushi和鉸鏈結(jié)構(gòu)域”是指共有序列SEQ ID NO:12。

本文所用術(shù)語“IL-15Rα的sushi和鉸鏈結(jié)構(gòu)域的衍生物”是指與選自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少93％(即對應(yīng)于約5個氨基酸置換)、優(yōu)選地至少97％(即對應(yīng)于約2個氨基酸置換)、更優(yōu)選地至少98％(即對應(yīng)于約1個氨基酸置換)同一性百分?jǐn)?shù)的氨基酸序列。這類衍生物包含IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域的四個半胱氨酸殘基，且本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其自身的一般知識及本專利申請的教導(dǎo)可以簡單地識別這類衍生物。還應(yīng)當(dāng)理解的是天然的氨基酸可以被化學(xué)修飾的氨基酸替換。通常，這種化學(xué)修飾的氨基酸能夠增加多肽的半衰期。

綴合物的多肽a)和多肽b)都可以是非共價連接的，例如在專利US 8,124,084 B2中公開的復(fù)合物中?？赏ㄟ^提供合適量的多肽a)，提供合適量的多肽b)，在合適的pH和離子條件下混合這兩種多肽足以允許復(fù)合物(即綴合物)形成的持續(xù)時間，并可選地濃縮或純化所述復(fù)合物，簡單地獲得所述綴合物或復(fù)合物。例如，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法采用肽合成儀；通過在細(xì)胞或細(xì)胞提取物中分別表達(dá)每種多肽，然后分離和純化所述多肽，可形成所述復(fù)合物(即綴合物)的多肽?？蛇x地，通過在相同細(xì)胞或細(xì)胞提取物中表達(dá)多肽i)和多肽ii)，然后例如采用色譜技術(shù)，例如具有針對淋巴因子部分、淋巴因子受體部分或復(fù)合物的抗體的親和色譜，分離和純化該復(fù)合物，可形成本發(fā)明的治療性多肽復(fù)合物。

綴合物的多肽a)和多肽b)還可以是采用雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑或在融合蛋白中共價連接的。

所述綴合物的多肽a)和多肽b)可以是糖基化的或非糖基化的。事實(shí)上，發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)糖基化的RLI或非糖基化的RLI都具有相同的體外特異性活性。不過，所述綴合物的多肽a)和多肽b)優(yōu)選為糖基化的。

雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，如使用它們的方法，并且所述雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑包括例如N-琥珀酰亞胺基(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞胺基(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯、亞氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(如鹽酸二甲基己二酰亞胺)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酸亞胺)、醛(例如戊二醛)、雙-疊氮化合物(例如雙(對-疊氮基苯甲?；?己二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對重氮苯甲?；?乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。

術(shù)語“融合蛋白”指通過連接最初編碼單獨(dú)的蛋白質(zhì)的兩個或更多個基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。其也被稱為嵌合蛋白。這種融合基因的翻譯產(chǎn)生具有衍生自每種初始蛋白的功能特性的單一多肽。通過應(yīng)用于生物學(xué)研究或治療的DNA重組技術(shù)人工產(chǎn)生重組融合蛋白。重組融合蛋白是通過融合基因的遺傳工程化產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。這通常涉及從編碼第一個蛋白質(zhì)的cDNA序列中移除終止密碼子，然后通過連接PCR或重疊延伸PCR在框架中附加第二個蛋白質(zhì)的cDNA序列。然后，由細(xì)胞將該DNA序列表達(dá)為單一蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)可以工程化為包括兩種初始蛋白質(zhì)的全序列或任一個初始蛋白質(zhì)序列的僅一部分。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述綴合物為融合蛋白。

白細(xì)胞介素15或其衍生物的氨基酸序列可以位于相對于IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域或其衍生物的氨基酸序列的C-末端或N-末端位置。優(yōu)選地，白細(xì)胞介素15或其衍生物的氨基酸序列位于相對于IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域或其衍生物的氨基酸序列的C-末端位置。

白細(xì)胞介素15或其衍生物的氨基酸序列與IL-15Rα的sushi結(jié)構(gòu)域或其衍生物的氨基酸序列可被“連接子”氨基酸序列隔開。所述“連接子”氨基酸序列可以具有足以確保融合蛋白形成合適的二級和三級結(jié)構(gòu)的長度。

在不顯著影響融合蛋白生物活性的情況下，連接子氨基酸序列的長度可以變化。通常，所述連接子氨基酸序列包含至少1個、但是少于30個氨基酸，如5-30個氨基酸的連接子，優(yōu)選10-30個氨基酸的連接子，更優(yōu)選15-30個氨基酸的連接子，進(jìn)一步優(yōu)選15-25個氨基酸的連接子，最優(yōu)選18-22個氨基酸的連接子。

優(yōu)選的連接子氨基酸序列是那些允許所述綴合物采用合適構(gòu)象(即允許通過IL-15Rβ/γ信號傳導(dǎo)通路的合適的信號傳導(dǎo)活動的構(gòu)象)的序列。

最合適的連接子氨基酸序列(1)將采用柔性延伸構(gòu)象，(2)不會顯示出發(fā)展有序二級結(jié)構(gòu)的傾向，所述有序二級結(jié)構(gòu)可與融合蛋白的功能結(jié)構(gòu)域相互作用，和(3)將具有最小的疏水性或帶電特性，所述疏水性或帶電特性可促進(jìn)與功能蛋白結(jié)構(gòu)域的相互作用。

優(yōu)選地，所述連接子氨基酸序列包含選自包含Gly(G)、Asn(N)、Ser(S)、Thr(T)、Ala(A)、Leu(L)和Gln(Q)的組的近中性氨基酸，最優(yōu)選地，所述連接子氨基酸序列包含選自包含Gly(G)、Asn(N)和Ser(S)的組的近中性氨基酸。

連接子序列的實(shí)例描述于美國專利No.5,073,627和No.5,108,910中。

更特別地適用于本發(fā)明的示例性柔性連接子包括由SEQ ID NO:13(SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ)、SEQ ID NO:14(SGGSGGGGSGGGSGG GGSGG)或SEQ ID NO:15(SGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ)的序列編碼的那些連接子。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述綴合物為具有序列SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的融合蛋白。

第二方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，該組合物包含最終與藥學(xué)上可接受的媒介物(carrier)結(jié)合的所述單體綴合物。

表述“藥學(xué)上可接受的”是指這樣的分子實(shí)體和組合物：其是生理可耐受的，并且當(dāng)給藥于人時通常不產(chǎn)生過敏反應(yīng)或類似的不良反應(yīng)，例如反胃、頭暈等。優(yōu)選地，本文所用表述“藥學(xué)上可接受的”指聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或在美國藥典或其它普遍認(rèn)可的用于動物、更特別是用于人類的藥典中列出的。

術(shù)語“媒介物”指與化合物一起給藥的溶劑、助劑、賦形劑或溶媒。這樣的藥物媒介物可以為無菌液體，比如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的油，比如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。

優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物(combination)的給藥途徑為腸胃外的；本文所用術(shù)語“腸胃外的”包含靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、直腸、陰道或腹腔給藥。因此，藥物組合物含有對于旨在被注射的劑型為藥學(xué)上可接受的溶媒。特別地，這些可以是等滲的、無菌的鹽水溶液(磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉，氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等，或這些鹽的混合物)，或干的、尤其是冷凍干燥的組合物，其根據(jù)情形加入無菌水或生理鹽水時，允許構(gòu)成可注射的溶液。合適的藥物媒介物描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”。

在所有這些給藥途徑中，靜脈內(nèi)給藥是最優(yōu)選的。

所述綴合物可以溶解在緩沖液或水中，或者包含在乳液、微乳液、水凝膠(例如基于PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的水凝膠)、微球、納米球、微粒、納米粒(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)微粒(例如，聚乳酸(PLA)；聚(丙交酯-共-乙醇酸)(PLGA)；聚谷氨酸酯微球、納米球、微粒或納米顆粒)、脂質(zhì)體或其它蓋侖制劑中。在所有情形中，制劑必須是注射可接受程度的無菌和流體的。制劑必須在制備和貯存條件下穩(wěn)定，并且必須防止例如細(xì)菌和真菌的微生物的污染作用而防腐。

分散體也可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油中制備。在一般的儲存和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物生長。

所述綴合物可以以中性或鹽形式配制到組合物中。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成)，所述酸加成鹽是與例如鹽酸或磷酸的無機(jī)酸或例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有機(jī)酸形成的。與游離羧基形成的鹽也可以來源于無機(jī)堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、或氫氧化鐵，以及來源于有機(jī)堿，例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等。

所述媒介物還可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、它們合適的混合物及植物油的溶劑或分散介質(zhì)。本發(fā)明的綴合物也可以被修飾，例如被聚乙二醇化，以提高其生物可分布性(biodisponibility)。

例如，通過使用包衣(例如卵磷脂)，在分散體的情況下通過維持所需的粒徑和通過使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。通過多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，可以實(shí)現(xiàn)防止微生物的作用。在許多情況下，優(yōu)選地包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。

可注射組合物的延長吸收可以通過在組合物中使用延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁、明膠、多元醇、增長半衰期的共價和非共價制劑實(shí)現(xiàn)。

肽不穩(wěn)定或降解的原因有許多，包括水解和變性。疏水性相互作用可引起分子集合到一起(即聚集)?？梢约尤敕€(wěn)定劑從而減少或防止這類問題。

穩(wěn)定劑包括環(huán)糊精及其衍生物(參見美國專利No.5,730,969)。還可加入合適的防腐劑如蔗糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖、葡聚糖和甘油以穩(wěn)定最終制劑。可將選自離子型和非離子型表面活性劑、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-半乳糖醛酸、海藻糖、葡聚糖、羥乙基淀粉、及其混合物的穩(wěn)定劑添加至所述制劑中。堿金屬鹽或氯化鎂的添加可以穩(wěn)定肽。所述肽還可通過使其與選自葡聚糖、硫酸軟骨素、淀粉、糖原、糊精和海藻酸鹽的糖接觸而被穩(wěn)定。其它可添加的糖包括單糖、二糖、糖醇及它們的混合物(例如，葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、木糖醇)。多元醇可穩(wěn)定肽，且是可與水混溶的或水溶性的。合適的多元醇可以是多羥基醇、單糖和二糖，包括甘露醇、甘油、乙二醇、丙二醇、三甲基二醇、乙烯基吡咯烷酮、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖及它們的聚合物。各種賦形劑也可穩(wěn)定肽，包括血清白蛋白、氨基酸、肝素、脂肪酸和磷脂、表面活性劑、金屬、多元醇、還原劑、金屬螯合劑、聚乙烯吡咯烷酮、水解明膠和硫酸銨。

第三方面，本發(fā)明涉及所述藥物組合物在治療受試者的癌癥、感染和/或免疫缺陷障礙中的用途。

本文所用術(shù)語“受試者”是指哺乳動物，比如嚙齒類動物、貓科動物、犬科動物或靈長類動物，最優(yōu)選為人。

在本發(fā)明的上下文中，本文所用術(shù)語“治療”指逆轉(zhuǎn)、減緩、抑制應(yīng)用該術(shù)語的障礙或病癥或這樣的障礙或病癥的一個或多個癥狀的發(fā)展，或預(yù)防所述障礙或病癥或這樣的障礙或病癥的一個或多個癥狀。

本文所用術(shù)語“治療癌癥”是指癌細(xì)胞的生長抑制。優(yōu)選地，所述治療還導(dǎo)致腫瘤生長的消退，即，可測量腫瘤的尺寸的減小。最優(yōu)選地，這種治療導(dǎo)致腫瘤的完全消退。

本文所用術(shù)語“治療感染”是指微生物的復(fù)制/增殖的抑制。

本文所用術(shù)語“治療免疫缺陷障礙”是指NK細(xì)胞和/或T細(xì)胞的誘導(dǎo)。

綴合物的“有效量”是足以誘導(dǎo)腫瘤生長或微生物復(fù)制的消退的量。用于給藥的劑量可作為多種參數(shù)的函數(shù)而采用，特別是作為使用的給藥模式、相關(guān)病理學(xué)或可選地期望的治療持續(xù)時間的函數(shù)而采用。自然地，藥物組合物的形式、給藥途徑、劑量和治療方案自然地取決于將被治療的病癥、疾病的嚴(yán)重程度、受試者的年齡、體重和性別等。下文中提供的有效劑量的范圍不旨在限制本發(fā)明和代表優(yōu)選的劑量范圍。然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解和可確定，可為單獨(dú)的受試者定制優(yōu)選的劑量，而無需過多實(shí)驗(yàn)。

在下文中，參照氨基酸序列、核酸序列和實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明不旨在受實(shí)施例的細(xì)節(jié)的限制。相反，本發(fā)明涉及包括在本文實(shí)施例中未明確提及的、但本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過多努力即可發(fā)現(xiàn)的細(xì)節(jié)的任何實(shí)施方案。

實(shí)施例

1)RLI生產(chǎn)概況分析

采用GENEART在pcDNA3.1質(zhì)粒中克隆編碼RLI1和RLI2的核苷酸序列(SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17)。由POLYSCIENCE獲得40kDa的線性PEI。通過在加熱下在水中溶解PEI，用NaOH中和，并通過0.22μm過濾器過濾來滅菌，制備1mg/mL的儲備溶液。將儲備溶液等分并儲存在-20℃下。采用質(zhì)粒純化試劑盒，根據(jù)制造商的說明(MACHEREY-NAGEL)，并通過0.22μm過濾器過濾來滅菌，純化用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA。

將常規(guī)維持的CHO-S(INVITROGEN)細(xì)胞以1×10⁶細(xì)胞/mL的密度接種在PowerCHO2培養(yǎng)基(LONZA)中，并且在具有5％CO₂的振蕩培養(yǎng)箱(100rpm)中于37℃下培養(yǎng)過夜。為了轉(zhuǎn)染，然后將細(xì)胞在CD-CHO培養(yǎng)基(INVITROGEN)中稀釋至2×10⁶細(xì)胞/mL。以10％的培養(yǎng)體積，使用150mM的NaCl制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將表達(dá)構(gòu)建體DNA(2.5mg/L培養(yǎng)體積)與在NaCl中稀釋的PEI(10mg/L的最終培養(yǎng)體積)混合，并在室溫下孵育10分鐘，之后加到培養(yǎng)物中。在振蕩培養(yǎng)箱(130rpm)中于37℃下培養(yǎng)細(xì)胞5小時，然后用PowerCHO2培養(yǎng)基使培養(yǎng)體積翻倍。轉(zhuǎn)染后5天，收集上清液。

在4℃下，將收集的上清液以3000rpm離心20分鐘，用NaOH平衡在pH為7.8，并通過0.22μm過濾器過濾，然后分析。采用SUPERDEX 2005/150GL，根據(jù)制造商的說明分析RLI表達(dá)模式。該分析采用稀釋的(0.15mg/mL)和未稀釋的樣品。流速為0.2mL/min且流動緩沖液(running buffer)為PBS。通過在215nm處的吸光度監(jiān)測蛋白質(zhì)洗脫。

不同的純化的結(jié)果示于表I和圖1。

表I

結(jié)果表明了色譜圖上兩個明顯峰的存在。第一峰對應(yīng)于尺寸大于2000kDa的聚集體。第二峰對應(yīng)于RLI單體。不過，所述第二峰有時含有可代表RLI的二聚體的肩峰(箭頭所示)。

因此，RLI產(chǎn)品中含有很少部分的聚集體。這一結(jié)論并不讓人驚訝，因?yàn)橐阎谂囵B(yǎng)上清液中IL15本身會在低濃度下聚集。不過，這種聚集是有問題的，因?yàn)樗@得的組合物不能用作藥物組合物。

根據(jù)文獻(xiàn)記載，聚集的原因可以是多種多樣的。如自細(xì)胞培養(yǎng)過程至最后的填充操作都可能發(fā)生這種聚集。這種聚集可能是由于培養(yǎng)基組分(由于宿主細(xì)胞蛋白、RLI濃度或溶解的氧)、純化過程(由于純化技術(shù)(HIC、AEX、Affinity…))、洗脫條件(pH、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)濃度…)、超濾/滲濾過程(剪應(yīng)力、表面濃度)或配方(由于緩沖液(pH、離子強(qiáng)度、賦形劑….))引起的。由于這一多參數(shù)方程，在整個過程中聚集原因的識別是一項(xiàng)很有挑戰(zhàn)性的工作，該項(xiàng)工作并不總是成功的。

2)通過分級分析

為了確定純化組分的色譜行為并分析每一洗脫峰的含量，采用SUPERDEX 7510/300GL，根據(jù)制造商的說明分析前述純化的蛋白質(zhì)樣品。該分析采用50μl樣品。流速為1mL/min且流動緩沖液為PBS。通過在215nm處的吸光度監(jiān)測所述蛋白質(zhì)洗脫。

SEC(尺寸排阻色譜)譜圖示于圖2，一些洗脫級分的蛋白質(zhì)印跡分析示于圖3且該純化結(jié)果匯總于表II。

表II

結(jié)果確證了對應(yīng)于色譜柱的排阻限制的第一峰的存在(圖2)。該峰包含RLI蛋白的可溶性聚集體(＞110kDa)，所述聚集體包含糖基化的和非糖基化的RLI蛋白(圖3)。第二峰對應(yīng)于RLI二聚體，第三峰對應(yīng)于與RLI單體對應(yīng)的28.5kDa球狀蛋白(圖2)。毛細(xì)管電泳表明，該第三峰包含糖基化和非糖基化的形式，但是具有輕微偏移(offset)洗脫(圖3)。作為對照，采用自畢赤酵母中純化的蛋白質(zhì)。與預(yù)期相同，糖基化的形式在非糖基化的形式之前被洗脫。

最后，種類分布與前述分析一致，其中低聚體和/或聚集體占49％，單體占51％。

已經(jīng)注意到，貯存溫度，即4℃或-80℃，不會影響RLI的低聚化狀態(tài)。此外，這些結(jié)果還表明，當(dāng)貯存在4℃下時RLI是非常穩(wěn)定的，并且在-80℃下經(jīng)6個循環(huán)的冷凍/解凍后RLI仍然是非常穩(wěn)定的。

采用SEC-MALLS(尺寸排阻色譜-多角度激光光散射聯(lián)用儀)以更好地表征RLI產(chǎn)品的聚集狀態(tài)。這種方法能夠確定包含在所述蛋白質(zhì)樣品中的不同多聚體種類的尺寸分布。通過這種方法，首先采用SEC將不同種類分離并稀釋，然后用MALLS分析。

上述分析采用約35μg的蛋白質(zhì)樣品。根據(jù)制造商的說明，20℃下，SHODEX(kW402.5-4F)上SEC緩沖液(4.3mM Na₂HPO₄、1.4mM KH₂PO₄、2.7mM KCl、137mM NaCl)的流速為0.35mL/min。將INFINITY 1260色譜系統(tǒng)用作HPLC檢測器，將DAW-HELEOS 8+(WYATT TECHNOLOGIES)用作MALLS檢測器并采用OPTILAB-rEX。

圖4示出了RLI產(chǎn)品的SEC-MALLS譜圖的實(shí)例(光散射)。

表III公開了在室溫下進(jìn)行三小時孵育后，兩個RLI批次的不同蛋白峰的分布。

表III

結(jié)果證實(shí)了在多數(shù)樣品中存在對應(yīng)于不同形式的RLI的六種蛋白質(zhì)峰，其中某些占較少的部分。不過，在室溫下孵育3小時后，這些峰的分布無顯著改變。

這些結(jié)果確證了與單體形式相關(guān)的多聚體形式的存在。

3)第一純化步驟

建立第一純化步驟用于在畢赤酵母中生產(chǎn)RLI。在第一澄清步驟中，用0.22μm膜(纖維素)過濾通過在CHO細(xì)胞中進(jìn)行RLI生產(chǎn)獲得的不同的上清液。然后用pH7.5的Tris HCl滲濾這些上清液。然后將硫酸銨(AS＝(NH₄)₂SO₄)溶解于所述滲濾的上清液中，從而獲得對應(yīng)于結(jié)合緩沖液的1.5M的AS終濃度為。然后用獲得的結(jié)合緩沖液探索疏水相互作用色譜柱(Phenyl Sepharose FF)。

然后根據(jù)制造商的說明進(jìn)行洗脫。

與畢赤酵母生產(chǎn)相比，所述第一純化步驟產(chǎn)量非常低且重現(xiàn)性差。

由于一次錯誤的實(shí)驗(yàn)，將陰離子交換色譜(AEX)用在了第一步驟。令人驚奇的是，發(fā)明人觀察到這種特定的色譜能夠獲得非常好的產(chǎn)量。通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明觀察到了這種非常好的產(chǎn)量具有很好的重現(xiàn)性。

DEAE-Sepharose與Q-Sepharose之間的比較實(shí)驗(yàn)表明采用Q Sepharose獲得了最高的產(chǎn)量和用于Q-Sepharose或DEAE-Sepharose上探索的最優(yōu)緩沖液為20mM Tris HCl pH 7.5；1M NaCl。然而，制造商的說明建議在使用探索緩沖溶液時，其pH比待純化蛋白的pI至少小一個單位，而結(jié)果無法預(yù)期地表明在pH等于或大于7.5(Tris HCl緩沖液)(該pH比RLI蛋白高近兩個單位)時獲得了最好的探索。不過，較低的pH導(dǎo)致了非常差的探索，并且從而導(dǎo)致了RLI蛋白純化的產(chǎn)量低且重現(xiàn)性差。

此外，似乎所述HO細(xì)胞的DNA結(jié)合至RLI且所述第一純化步驟之后獲得的洗脫液被該DNA污染。

4)第二純化步驟

為了獲得一種無核苷酸且無內(nèi)毒素的組合物，發(fā)明人啟動了第二輪的純化。

采用疏水相互作用色譜柱(Phenyl Sepharose Butyl Sepharose,OctylSepharose)和20mM TrisHCl pH7.5–2M硫酸銨(AS＝(NH₄)₂SO₄)獲得了最好的結(jié)果。

不過，對于第一步驟純化的經(jīng)驗(yàn)，這些經(jīng)驗(yàn)?zāi)軌蛞苑浅５偷漠a(chǎn)量和重現(xiàn)性獲得RLI蛋白。

偶然地，發(fā)明人觀察到在獲得混合物(即樣品與硫酸銨的混合物)后越快地使其帶電，產(chǎn)量及重現(xiàn)性越好。似乎所述蛋白質(zhì)的鹽穩(wěn)定窗取決于許多參數(shù)，包括影響純化過程的溫度。因此，發(fā)明人將硫酸銨(即以0.75M)與第一洗脫液在疏水相互作用色譜柱上直接混合用于探索步驟。

在洗滌步驟和采用了緩沖溶液A2(20mM Tris HCl,pH 7.5)和緩沖溶液B2(20mM Tris HCl,2M硫酸銨,pH 7.5)之間的梯度的洗脫步驟之后，在梯度的37.5％以非常好的產(chǎn)量和重現(xiàn)性獲得了所述RLI蛋白。糖基化的形式稍晚于非糖基化的形式而被洗脫，并與非糖基化的形式的洗脫窗部分重疊。最后，在具有MWCO 5kDa的超濾盒上將所述樣品濃縮至0.5至1mg/l，并針對PBS緩沖液滲濾。

最后，通過本發(fā)明人的純化過程獲得的結(jié)果顯示，獲得的RLI蛋白純度大于98％，其中無可檢測的內(nèi)毒素、熱choc蛋白或殘留的DNA。此外，對獲得的組合物的分析表明超過90％的所述RLI蛋白處于滿足其在藥物組合物中使用的單體形式。

5)獲得的藥物組合物的增殖活性

為了測定所述純化蛋白的白細(xì)胞介素-15的增殖活性，通過[³H]胸苷摻入測量Kit 225和32Dβ細(xì)胞對ICK對所述蛋白的增殖反應(yīng)。

將細(xì)胞維持在培養(yǎng)基中3天，洗滌兩次，然后使Kit 225和32Dβ在不含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中分別挨餓24小時或4小時。然后，按10⁴個細(xì)胞/孔以100μl接種在多孔培養(yǎng)板中，并在補(bǔ)充濃度漸增的若干RLI CHO樣品的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。人rIL-15和源自桿狀病毒和源自畢赤酵母的RLI用作對照。

將細(xì)胞用0.5μCi/孔的[³H]胸苷脈沖處理16h，收獲至玻璃纖維過濾器上，并測定細(xì)胞相關(guān)的放射性。

圖5和圖6顯示了分別用濃度漸增的rIL-15、源自桿狀病毒的RLI、源自畢赤酵母的RLI和源自若干CHO生產(chǎn)的RLI純化形式培養(yǎng)的Kit 225和32Dβ細(xì)胞的[³H]胸苷摻入。

結(jié)果表明采用本發(fā)明的純化方法純化的RLI蛋白的生物活性具有與部分純化的RLI蛋白可媲美的活性。因此，本發(fā)明的純化方法不會改變RLI的生物活性。

6)獲得的藥物組合物在體內(nèi)模型中在小鼠中的生物活性

在第0天和第1天，向自Harlan實(shí)驗(yàn)室獲得的C57BL/6小鼠腹腔內(nèi)(i.p)注射100μL的PBS(作為陰性對照)、源自桿狀病毒的RLI(2μg/小鼠)、源自畢赤酵母的RLI(2μg/小鼠)和自CHO生產(chǎn)中純化的RLI(2μg/小鼠)。每組采用5只小鼠。

在第4天將小鼠通過頸椎脫臼法處死并取出脾臟。在100μm-細(xì)胞濾網(wǎng)(strainer)上，用注射器的背面將脾臟分離成單細(xì)胞懸浮液。然后采用ACK溶液(銨-氯-鉀)將血細(xì)胞裂解。在完全培養(yǎng)基中洗滌脾細(xì)胞兩次并采用Kova載玻片進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)。采用如下抗體：抗-CD3、CD4、CD8、NKp46和Fixable Aqua將兩百萬脾細(xì)胞染色從而篩選活細(xì)胞。然后，根據(jù)制造商的說明使脾細(xì)胞透化(EBIOSCIENCE POXP3透化緩沖液)，并用抗-FoxP3和Ki67使其染色。采用同種型的Ki67來識別陽性細(xì)胞。在FACSCANTO II流式細(xì)胞儀上迅速獲得染色的細(xì)胞，并采用FLOWJO SOFTWARE(TREE STAR)進(jìn)行分析。NK細(xì)胞為CD3陰性NKp46陽性細(xì)胞。

圖7代表增殖的NK細(xì)胞、CD8⁺T細(xì)胞、Foxp3⁺CD4⁺T細(xì)胞和Foxp3^-CD4⁺T細(xì)胞的比例。

圖7顯示了每組NK細(xì)胞與NK細(xì)胞絕對數(shù)的比率。

圖7還顯示了與總的NK細(xì)胞和增殖的NK細(xì)胞的絕對數(shù)相比，增殖的NK細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

結(jié)果表明，與在桿狀病毒中生產(chǎn)的RLI相比，在畢赤酵母中生產(chǎn)的RLI具有差的體內(nèi)活性。令人滿意的是，在CHO中生產(chǎn)的RLI和通過本發(fā)明的方法純化的RLI對NK細(xì)胞顯示出了非常好的體內(nèi)活性。