本發(fā)明涉及硫酸化纖維素水合物膜(sulfatedcellulosemembrane)、其制備方法和該膜作為病毒純化用吸附膜的用途。

背景技術：
流感(流感病毒)是由流感病毒引發(fā)的上下呼吸道的高度傳染性急性感染。流感作為世界性流行病而發(fā)生，特別是在冬季的月份，然而個別的病毒也可引發(fā)大流行。當前控制流感爆發(fā)的策略是基于預防性疫苗結(jié)合例如神經(jīng)氨酸酶抑制劑等抗病毒治療。大部分季節(jié)性人類流感疫苗是失活三價裂解病毒粒體(trivalentsplitvirion)疫苗。這些由病毒抗原，三種不同流感病毒亞型的包膜糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(HA)組成。各種抗原用去污劑(例如CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)或吐溫20(聚山梨醇酯20))通過膜增溶而從純化的病毒顆粒獲得。在傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法中，流感病毒在溫育的雞蛋中生產(chǎn)。除了此方法的有限擴展性和與之相關聯(lián)的問題以外，在雞蛋中生產(chǎn)個別大流行流感病毒(例如H5N1)有系統(tǒng)性困難而難以滿足全球市場增長的需求。最后，對雞蛋白質(zhì)的變態(tài)反應問題也使得在生物反應器中使用哺乳動物細胞的生產(chǎn)方法建立了若干年。在細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)病毒之后，需要從污染物(例如宿主細胞蛋白質(zhì)、DNA)中分離病毒，以便病毒可進一步以其純化形式使用。此外，從非感染性分子或顆粒分離感染性物質(zhì)是有利的。在生物藥物生產(chǎn)過程中，脫氧核糖核酸(DNA)和從宿主細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的其它蛋白質(zhì)作為副產(chǎn)物出現(xiàn)。這通常當作污染物，并且必須在處理時從終產(chǎn)物中除去。在病毒的生產(chǎn)中，宿主細胞或病毒自身的DNA片段也被釋放，這些必須被除去。通過色譜純化在固相上吸附病毒，在病毒純化特別是在處理規(guī)模中有重要意義。其特征在于分子結(jié)合至吸附器材料(離子交換器、疏水或親水吸附劑)，且之后可在后續(xù)步驟中以純化形式洗脫。在此情況中，吸附過程可逆地進行是重要的，以便獲得高產(chǎn)率?？蛇M行簡單富集或者分離成兩種以上的目標物質(zhì)，其中后一種情況可選擇性地影響吸附或解吸或二者。用于此目標的色譜介質(zhì)的主要缺點是其相對低的選擇性，和溶液中存在的污染物(DNA片段和宿主細胞蛋白質(zhì))也可結(jié)合至吸附器材料，以至于需要長的處理展開時間，以便確定最優(yōu)結(jié)合和洗脫條件(pH、離子強度和緩沖系統(tǒng)的選擇)。親和色譜提供增加的選擇性。從現(xiàn)有技術可知硫酸化纖維素基質(zhì)對流感病毒和肝素結(jié)合蛋白的選擇性增加。EP0053473A1公開了具有肝素樣效果的纖維素硫酸鹽(cellulosesulfatesalt)供用作抗凝劑。為了充分的高抗凝效果，與生理條件下的所需高長期穩(wěn)定性一起，纖維素的硫酸化程度(在吡喃糖單元的C2、C3和C6原子上OH基團被硫酸系基團(sulfategroup)取代的程度)在0.8至2.6之間。纖維素硫酸鹽可通過三種不同方法獲得：通過在胺的存在下與氯磺酸反應，通過與例如二甲基甲酰胺可用作酰胺的SO3-酰胺復合物反應，或通過與例如吡啶可用作胺的SO3-酰胺復合物反應。在述及的后一變型中，纖維素與SO3-吡啶復合物在室溫下反應30至35分鐘，并隨后以NaOH中和。EP1698641A1公開了纖維素硫酸鹽作為治療活性成分用于例如特應性濕疹等皮膚疾病。纖維素硫酸鹽的特征在于對透明質(zhì)酸酶的抑制效果，并具有基于纖維素硫酸鹽總重量為6.5至19.0重量％的硫酸系基(sulfate)含量。在制備中，結(jié)晶纖維素首先在例如吡啶、二甲基亞砜或二甲基甲酰胺等溶劑中預溶脹。所得的混合物添加至選自氯磺酸、哌啶-硫酸復合物、SO3-吡啶復合物、SO3-三甲胺復合物或硫酸酐-二甲基甲酰胺復合物的組的硫酸化試劑，其中優(yōu)選較后述及的復合物。上文述及的兩篇文獻EP0053473A1和EP1698641A1都沒有公開任何用于純化病毒的色譜分離材料。此類分離材料作為凝膠可商購，并用于上述分子和病毒的純化。用于純化病毒的這些介質(zhì)的使用常常提供對病毒的低結(jié)合能力和低病毒收率。病毒的大小可達500nm，并因此孔徑在30至400nm范圍的微粒色譜凝膠不太合適。通常，那么病毒僅可結(jié)合至顆粒的外表面，這解釋了低結(jié)合能力。由纖維素、葡聚糖或瓊脂糖組成的色譜凝膠的硫酸化以及用于純化流感病毒的這些硫酸化凝膠的使用是現(xiàn)有技術中已知的。通過實例的方式，RD298025A公開了可通過在65至70℃下以氯磺酸-吡啶復合物將“CellulofineGH-25”、“SepharoseCL-6B”或“SephadexG-50”硫酸化，接著以NaOH中和，并用磷酸鹽緩沖鹽溶液洗滌而制備的親和色譜凝膠。此凝膠適合用于純化例如乙肝抗原，HIV-1和HIV-3病毒，SV40-T抗原，凝血因子7、8、9和11，核酸聚合酶，干擾素或溶菌酶等蛋白質(zhì)。EP0171086A2記述了基于瓊脂糖、葡聚糖或纖維素，用吡啶中的氯磺酸或無水硫酸在65至70℃下硫酸化(部分)結(jié)晶多糖凝膠的方法。多糖凝膠的硫酸化程度通常在0.1至40％之間，其中纖維素凝膠的硫酸化程度特別地在0.1至5％之間。源于雞胚細胞培養(yǎng)物的流感病毒或抗原可用硫酸化纖維素凝膠純化。WO2008/039136A1公開了多孔多糖基質(zhì)，優(yōu)選來自瓊脂糖，500kDa葡聚糖“延伸劑(extender)”分子與之結(jié)合，其中硫酸系基團依次結(jié)合至葡聚糖分子作為配體，用于純化病毒。基質(zhì)用于從DNA污染物分離病毒，優(yōu)選流感病毒，其中病毒最初吸附在基質(zhì)上，并隨后以合適的緩沖液洗脫。為制備前述基質(zhì)，在硫酸化“延伸劑”分子固定在多糖基質(zhì)上之前，硫酸系配體首先結(jié)合至“延伸劑”分子。EP0171771A2公開了從EP0171086A2中得知的硫酸化纖維素凝膠用于從雞胚細胞培養(yǎng)物純化狂犬病病毒的用途。EP0173268A2公開了從EP0171086A2中得知的硫酸化纖維素凝膠用于純化從哺乳動物細胞培養(yǎng)裂解物獲得的、作為HSV-1和HSV-2型單純皰疹病毒成分的糖蛋白gA和gB的用途。糖蛋白gA和gB在陰離子或非離子表面活性劑的存在下純化。EP0171765A2公開了純化日本腦炎病毒用于疫苗生產(chǎn)的方法，其中使用了從EP0171086A2中得知的硫酸化纖維素凝膠。所有前述文件公開了由微粒多孔凝膠顆粒構成的色譜分離介質(zhì)。為此，截留分子量(molecularweightcut-off,MWCO)小于107Da的多糖凝膠用作硫酸化反應用的基材。病毒，例如R.W.HRuigrok等人在J.Gen.Virol.(1984),65,799-802中記述的直徑大于100nm且分子量(MW)大于108Da的流感病毒，僅可有限程度地穿透記述的多孔分離材料的孔，此情況下僅可利用這些分離材料的部分結(jié)合能力。與微粒吸附劑相反，吸附膜具有對病毒完全可接近的實質(zhì)上更大的孔。此外，它們提供通過利用兩種主要表面之間的液壓差而以介質(zhì)強行灌注的可能性，由此獲得可在高流量下起效快得多的對流遷移，而不是在濃度梯度的方向上吸附劑向吸附劑內(nèi)部的純擴散遷移。由此可避免微粒吸附劑另外的固有缺點，即由下列事實構成的所謂的“擴散限制”：當吸附劑粒徑增加且吸附劑的摩爾質(zhì)量增加時，建立吸附平衡所需的時間顯著增加，這轉(zhuǎn)化為動力學的劣化。因此，在例如流感病毒的純化中，用色譜凝膠通常僅獲得低流速?；诶w維素的硫酸化膜吸附器已通過硫酸化纖維素水合物膜成功地生產(chǎn)，其中硫酸化通常通過在適合反應的溶劑中纖維素膜與路易斯堿-SO3復合物的反應而發(fā)生。與常規(guī)的硫酸化多糖凝膠相比，硫酸化膜吸附器具有下列優(yōu)點：-與微粒分離材料中的擴散“流”相對的對流流動-可能更高的流速-對配體更好的可接近性和對病毒更高的結(jié)合能力-更簡單的擴展性，即，從低體積膜吸附器增加規(guī)模至大體積膜吸附器。由于能力是配體密度和可得的結(jié)合表面的函數(shù)，其通常通過減少膜孔徑而增加，但這對于流動和堵塞特性有負面影響。US5,667,684公開了用于從血漿除去HIV病毒的微孔膜，其由例如聚丙烯、聚乙烯或聚偏二氟乙烯等疏水基材構成，其上接枝了丙烯酸烷氧基烷基酯、丙烯酸縮水甘油酯或丙烯酰胺的鏈。硫酸化纖維素通過共價結(jié)合固定在此中間接枝層上，其中例如硫酸化纖維素的游離OH基團與例如接枝鏈的重復單元的環(huán)氧基等官能團反應。HIV病毒主要通過硫酸化纖維素單元除去。US8,173,021B2公開了硫酸化程度(磺?；?在0.5至15％之間的硫酸化、非交聯(lián)纖維素膜的制備方法，其中纖維素膜與氯磺酸-吡啶復合物在40℃以下反應。氯磺酸-吡啶復合物通過在最高0℃下將氯磺酸添加至吡啶，接著在60℃下反應并冷卻至最高40℃而制備。可從非交聯(lián)的再生纖維素膜(例如來自Whatman的RC-55膜)制備的硫酸化纖維素膜在親和色譜中使用，親和色譜用于純化含蛋白質(zhì)病毒片段或用于純化完整病毒顆粒，其后續(xù)用于流感疫苗的生產(chǎn)。L.Opitz等人，BiotechnologyandBioengineering,103(6),2009,1144-1154，公開了通過將強化、非交聯(lián)的纖維素膜與氯磺酸在吡啶中的溶液在37℃下反應12小時而制備硫酸化纖維素膜。16μg硫/每g干燥膜下的硫酸化纖維素膜的硫含量，顯著低于微粒吸附劑Sulfate(≥700μg硫/每g干燥膜)中的硫含量。硫化纖維素膜用于純化三種流感株，即H1N1、H3N2和“B/Malaysia/2506/2004”病毒，其中例如雙鏈DNA或細胞成分等不期望的污染物從生產(chǎn)病毒用的細胞培養(yǎng)液中有效地被除去。在純化用的緩沖液中，當NaCl濃度增加時(150nM對50mM)，膜對病毒的吸附能力降低。與例如S75或C75等陽離子交換膜相比，硫化纖維素膜使得雙鏈DNA的耗減提高，并允許比基于Sulfate色譜柱更高的病毒收率。US2012/0171750A1研究了反應溫度對從Opitz等人的上述文章中得知的硫酸化纖維素基質(zhì)的制備中纖維素基質(zhì)的硫酸化程度、對MVA病毒的吸附能力、和純化MVA病毒制劑被來自細胞培養(yǎng)液的DNA污染的影響。硫酸化中的反應溫度增加時(35、40或45℃)，纖維素基質(zhì)的硫酸化程度從基于纖維素聚合物主鏈重量的5.3重量％增至13重量％，而純化的病毒制劑中DNA分數(shù)從7.4％增至17％，以及純化MVA病毒的收率從66％增至80％。通過硫酸化纖維素基質(zhì)的手段純化病毒制劑可與使用具有苯基、丁基或己基配體的色譜基質(zhì)的疏水相互作用色譜的附加步驟組合。使用從US8,173,021B2已知的方法，盡管使用相對微細的膜(來自Whatman的RC-55膜，孔徑0.45μm)也不能獲得大于15％的硫酸化程度。選擇的孔徑也不利于結(jié)合直徑超過100nm的病毒，因為在病毒吸附時可發(fā)生流動損失和膜的堵塞。

技術實現(xiàn)要素：
因此，本發(fā)明的目標是提供病毒純化，例如流感病毒純化用的膜，該膜一方面具有對欲分離的目標化合物的高選擇性，另一方面使得能在高流速下將例如雙鏈DNA或細胞成分等不期望的污染物從病毒生產(chǎn)用的細胞培養(yǎng)液中有效除去。此目標通過權利要求中表征的主題實現(xiàn)。具體地，本發(fā)明提供硫酸化纖維素水合物膜，其包含具有從膜的一個主表面向另一個主表面延伸的孔的交聯(lián)纖維素水合物基質(zhì)，其中纖維素水合物膜在其內(nèi)外表面上具有硫酸系配體用于吸附物質(zhì)(adsorptivesubstance)的分離。根據(jù)本發(fā)明，硫酸化纖維素水合物膜為吸附膜。吸附膜是指具有從一側(cè)穿透至另一側(cè)的孔的片狀吸附劑。吸附劑為多孔固體，其可經(jīng)稱作配體的表面官能團而接受與流體的特定組分的選擇性結(jié)合。目標物質(zhì)和/或污染物是指根據(jù)本發(fā)明的吸附物(adsorbate)，其也可采取兩種或更多種不同物質(zhì)的形式。吸附物可為單獨分子、締合物(associate)或顆粒，在目標物質(zhì)的情...