一種碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用。金屬氧化物納米顆粒修飾的磁性納米材料特征為在碳納米管（CNTs）上包裹有磁性材料，磁性材料上修飾有金屬氧化物納米顆粒。本發(fā)明的金屬氧化物納米顆粒修飾的磁性納米材料可以對低至1×10-9M級的復(fù)雜肽段混合物中的痕量磷酸化肽段實(shí)現(xiàn)高選擇性富集，方法簡單有效。該材料及制備方法在蛋白質(zhì)組學(xué)翻譯后修飾研究等領(lǐng)域有良好的實(shí)用價值和應(yīng)用前景。
【專利說明】一種碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于先進(jìn)納米復(fù)合材料和生化分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料及制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在原核生物和真核生物的細(xì)胞活動過程中，蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTMs)是最重要的和最普遍的活動之一，而在PTMs中磷酸化幾乎無處不在。它調(diào)控著包括信號傳遞、細(xì)胞繁殖和遷移在內(nèi)的多種重要的細(xì)胞功能，約50%的蛋白質(zhì)在其生命周期中發(fā)生過磷酸化修飾。而人類蛋白中至少存在著10萬個磷酸化位點(diǎn)，蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化能夠改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、活性及其相互間的作用，從而調(diào)節(jié)如細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡等幾乎所有的生命活動，被形象地描述為生理活動的分子開關(guān)。準(zhǔn)確鑒定蛋白質(zhì)中的磷酸化位點(diǎn)對深入理解各種生物過程的機(jī)理、探索重大疾病的生物標(biāo)記物和蛋白藥靶的尋找極為重要。
[0003]因其高靈敏性、高通量、操作簡及可定量分析等優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)磷酸化行為和特性的研究中，質(zhì)譜(MS)分析是一種強(qiáng)有力的研究工具。然而在質(zhì)譜分析中，因磷酸化蛋白的低豐度，其信號經(jīng)常被非磷酸化蛋白信號所覆蓋。因此對復(fù)雜混合樣品中的磷酸化蛋白和磷酸化肽段進(jìn)行選擇性富集，是蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜研究所必需的。為解決這些問題，各種對蛋白和肽段有親和力的物質(zhì)和親和性技術(shù)被廣泛研究，其中最為重要且最為廣泛應(yīng)用的方法是固定金屬離子親和色譜法(IMAC)。在IMAC方法中，主要利用磷酸基團(tuán)對于固定于載體表面金屬離子的親和力對磷酸化的蛋白或肽段進(jìn)行富集分離。最新研究發(fā)現(xiàn)，金屬氧化物納米顆粒,如二氧化鈦(TiO2)/ 二氧化鉿(HfO2)和二氧化鋯(ZrO2)等比傳統(tǒng)的IMAC方法對磷酸化蛋白和磷酸化肽段的富集作用更為理想，因?yàn)槠鋵τ诹姿峄鶊F(tuán)的化學(xué)吸附作用更具有選擇性和可逆性。
[0004]碳納米管(CNTs)首次發(fā)現(xiàn)于1991年，其在多個應(yīng)用領(lǐng)域被大量研究。眾多基于CNTs的納米復(fù)合材料已經(jīng)被報道過，如CNTs的金元素復(fù)合物等等。主要是將CNTs和功能基團(tuán)/功能分子二者的物理化學(xué)性質(zhì)相結(jié)合，是一種良好的功能納米顆粒的載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一在于提供一種碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料。
[0006]本發(fā)明的目的之二在于提供所述碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料的制備方法。
[0007]本發(fā)明的目的之三在于提供所述金碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料的應(yīng)用。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料，在碳納米管CNTs表面覆蓋有超順磁性四氧化三鐵納米顆粒層，所述磁性納米顆粒層表面修飾有金屬氧化物MxOy納米顆粒。
[0009]所述金屬氧化物MxOy為二氧化鈦、二氧化鉿或二氧化鋯。
[0010]一種碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料的制備方法，包括以下步驟:
(1)將碳納米管CNTs分散到濃硝酸中，30?50°C下反應(yīng)3?5小時進(jìn)行預(yù)處理，然后過濾、洗滌、干燥備用；
(2)向檸檬酸鈉、醋酸鈉和聚乙二醇的乙二醇溶液中，加入預(yù)處理過的CNTs和三氯化鐵六水合物FeCl3.6Η20攪拌下超生反應(yīng)I?2小時后，在高壓反應(yīng)器中150?250°C下反應(yīng)10?15小時，獲得超順磁性碳納米管材料MagCNTs ；
(3)將磁性碳納米管材料MagCNTs在異丙醇中經(jīng)超聲處理后,加入二乙胺和異丙醇鈦，在高壓釜中200°C下反應(yīng)5小時，離心分離、清洗干燥后再在400°C下進(jìn)行退火反應(yīng)2h，獲得碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料。
[0011]一種碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料應(yīng)用于對磷酸化蛋白和肽段的富集，包括以下步驟:
(1)將蛋白溶于NH4HCO3水溶液中，加入胰蛋白酶，370C下酶解16小時，將蛋白酶解液用50%乙腈和0.1%三氟乙酸混合而成的緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度；
(2)取碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料的懸濁液，用50%乙腈和0.1%三氟乙酸混合而成的緩沖液洗滌后加入到稀釋后的蛋白酶解液，在25°C下混旋5?10分鐘,用磁鐵分離去除上清液,而后利用緩沖液洗滌，除去上清液后加入0.4M氨水，在25°C下混旋2分鐘，將磷酸化肽段洗脫下來。
[0012]本發(fā)明將金屬氧化物修飾于磁性納米材料表面。首先將碳納米管CNTs表面用超順磁性物質(zhì)Fe3O4進(jìn)行包裹形成磁球，然后將金屬氧化物修飾于磁球表面，形成金屬氧化物納米顆粒修飾的超順磁性納米材料。
[0013]有益效果:本發(fā)明的金屬氧化物納米顆粒修飾的超順磁性納米材料，作為微吸附齊U，比表面積大，且因其對于磷酸集團(tuán)的選擇性吸附，可對低至1X10_9M級的復(fù)雜肽段混合物中的痕量磷酸化肽段實(shí)現(xiàn)高選擇性富集，方法簡單有效，該材料及制備方法在蛋白質(zhì)組學(xué)翻譯后修飾研究等領(lǐng)域有良好的實(shí)用價值和應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是本發(fā)明具體實(shí)施例碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料MagCNTsOTiO2的合成示意圖。
[0015]圖2是本發(fā)明具體實(shí)施例碳納米管CNTs經(jīng)超順磁性物質(zhì)Fe3O4包裹后的透射電鏡(TEM)0
[0016]圖3是本發(fā)明具體實(shí)施例碳納米管CNTs經(jīng)超順磁性物質(zhì)Fe3O4包裹后的掃描電鏡(SEM)0
[0017]圖4是本發(fā)明具體實(shí)施例二氧化鈦TiO2納米顆粒修飾的超順磁性納米材料MagCNTsiTiO2 的掃描電鏡 SEM。
[0018]圖5是本發(fā)明具體實(shí)施例二氧化鈦TiO2納米顆粒修飾的超順磁性納米材料MagCNTsiTiO2復(fù)合物的透射電鏡(TEM)圖譜。
[0019]圖6是本發(fā)明具體實(shí)施例二氧化鈦TiO2納米顆粒修飾的超順磁性納米材料MagCNTsiTiO2復(fù)合物的能量色散X射線衍射(EDX)圖譜。
[0020]圖7是本發(fā)明具體實(shí)施例二氧化鈦TiO2納米顆粒修飾的超順磁性納米材料MagCNTsiTiO2復(fù)合物的廣角X射線衍射(WADX)圖譜。
[0021]圖8是本發(fā)明具體實(shí)施例β -酪蛋白酶解液未經(jīng)MagCNT@Ti02富集前的肽段的MALD1-TOF MS 圖。
[0022]圖9是本發(fā)明具體實(shí)施例濃度為1x10_6M的β -酪蛋白酶解液經(jīng)MagCNTOTiO2富集后的肽段的MALD1-TOF MS圖。
[0023]圖10是本發(fā)明具體實(shí)施例濃度為1χ10_8Μ的β -酪蛋白酶解液經(jīng)MagCNTOTiO2富集后的肽段的MALD1-TOF M圖。
[0024]圖11是本發(fā)明具體實(shí)施例濃度為1χ10_9Μ的β -酪蛋白酶解液經(jīng)MagCNTOTiO2富集后的肽段的MALD1-TOF MS圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0026]以金屬氧化物是二氧化鈦為例，本發(fā)明的碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料的制備過程如下。
[0027]1、碳納米管(CNTs)預(yù)處理:
將300mg碳納米管(CNTs)材料分散到30?40ml濃硝酸中，30_50°C下攪拌反應(yīng)3?5小時；過濾，用清水洗滌5次；45?60°C下減壓干燥后備用。
[0028]2、MagCNTs磁納米顆粒的制備:
在40ml乙二醇中依次加入0.20g檸檬酸鈉、5.0g醋酸鈉和0.5g聚乙二醇，攪拌；加入300mg預(yù)處理過的碳納米管(CNTs)和810mg FeCl3.6Η20。攪拌下超生反應(yīng)I?2小時。將混合物置于高壓反應(yīng)器中150-250°C下繼續(xù)反應(yīng)10?15小時。離心獲得MagCNTs。
[0029]3、MagCNTsOTiO2磁納米顆粒的制備:
將30mg磁性材料包裹的碳納米管(MagCNTs)加入到50ml異丙醇中，超聲攪拌0.5小時，得混懸液；加入0.02ml 二乙胺，繼續(xù)攪拌反應(yīng)5分鐘；加入0.5ml異丙醇鈦，繼續(xù)攪拌反應(yīng)5分鐘；將混合物轉(zhuǎn)入高壓釜中，加熱到200°C，繼續(xù)反應(yīng)5小時。降至室溫，離心獲得固體物，用乙醇沖洗；600C下干燥2小時；在400°C下，退火反應(yīng)2小時(1.(TC /小時)，得MagCNTsOTiO2。
[0030]MagCNTsOTiO2磁性納米材料的合成示意圖見圖1。
[0031]材料的表征:
UMagCNTs粒徑表征:
利用透射電鏡(TEM)和掃描電鏡(SEM)對MagCNTs磁納米顆粒進(jìn)行了表征，表征圖見圖2和圖3。從圖中可以看出碳納米管(CNTs)被直徑約為200nm的球形顆粒有序的進(jìn)行了修飾，且該修飾主要發(fā)生在CNTs的兩端，因兩端羧基的密度最高。
2、MagCNTsOTiO2 粒徑表征:利用透射電鏡(TEM)和掃描電鏡(SEM)對MagCNTsOTiO2磁納米顆粒進(jìn)行了表征，表征圖見圖4和圖5。從圖中可以看出數(shù)量眾多的微小TiO2納米顆粒附著在MagCNTs顆粒上，有效增大了 MagCNTsOTiO2的表面積，且沒有發(fā)現(xiàn)粒徑大的顆粒，說明二氧化鈦納米顆粒的團(tuán)聚被有效地進(jìn)行了抑制。從TEM中可以看出每一 MagCNTs顆粒均被一層TiO2納米顆粒均勻的覆蓋。另外，可以看出MagCNTsOTiO2復(fù)合物分散良好，無明顯團(tuán)聚，有利于將其應(yīng)用于微量物質(zhì)富集。
[0032]3、Fe，C，Ti 和 O 元素表征:
利用能量色散X射線衍射譜(EDX)對得到的MagCNTsOTiO2復(fù)合物進(jìn)行了分析，見圖6。從圖中可以看到Fe, C, Ti和氧元素的存在。進(jìn)一步說明了 TiO2成功對MagCNTs磁性顆粒進(jìn)行了修飾。
[0033]4、TiOjPFe3O4 表征:
利用廣角X射線衍射譜(WADX)對得到的MagCNTsOTiO2復(fù)合物進(jìn)行了分析，見圖7。從圖中可以看到TiO2和Fe3O4的特征衍射峰。寬衍射峰信號意味著二氧化鈦相的粒徑極小。另外，位于26.1度處的峰為002面的衍射，表明碳納米管(CNTs)結(jié)構(gòu)在整個合成過程中被很好地保留下來。
[0034]WAXD的結(jié)果與SEM，TEM和EDX的結(jié)果一致。
[0035]將MagCNTsIgTiO2應(yīng)用于對磷酸化蛋白和肽段的富集:用濃度為1x10_6M的β -酪蛋白(β -casein)胰蛋白酶酶解液考察碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料MagCNTsOTiO2的富集靈敏度。
[0036]樣品準(zhǔn)備:
β-酪蛋白25mM NH4HCOjK溶液中(pH=8.3)，加入適量的胰蛋白酶(1:50，w/w)，在37°C下酶解16小時。將酪蛋白酶解液用緩沖液(50%乙腈，0.1%三氟乙酸)稀釋至適當(dāng)濃度，這里稀釋到酪蛋白酶解液的濃度為1χ10-6Μ，備用。
[0037]磷酸化肽段的富集:
取含20 μ g Fe3O4OTiO2磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料的懸濁液(10 μ L，2 μ g/μ L)，用緩沖液(50%乙腈，0.1%三氟乙酸)洗滌三次，去除緩沖液后加入到200 μ L稀釋后的β -酪蛋白酶解液，在25°C下混旋5~10分鐘，用磁鐵分離去除上清液，而后利用緩沖液(50%乙腈，0.1%三氟乙酸)洗滌三次。除去上清液后加入IOyL洗脫液(0.4M氨水)，在25°C下混旋2分鐘，將磷酸化肽段洗脫下來，以備基體輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALD1-T0F-MS)檢測分析。
[0038]利用二氧化鈦(TiO2)修飾的磁性納米材料MagCNTsOTiO2進(jìn)行磷酸化肽段富集后，經(jīng)基體輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALD1-T0FMS)分析的質(zhì)譜圖見圖8和圖9。圖8為未經(jīng)處理過的酶解液，從圖中可以看出，只有未磷酸化的肽段信號，而看不到磷酸化肽段的信號；圖9為經(jīng)過MagCNTsOTiO2富集后的圖譜，可以檢測出眾多磷酸化肽段的信號，而無未磷酸化肽段的信號。說明該材料對于磷酸化肽段的具有優(yōu)秀的選擇性富集效果。
[0039]為研究MagCNTsOTiO2對磷酸化肽段的選擇性富集極限和靈敏度，分別用1χ10_8Μ和1χ10_9Μ的酪蛋白(β-casein)胰蛋白酶酶解液進(jìn)行了富集能力考查。見圖10和圖
11。從圖中可以看出，即使β-casein酶解液的濃度低至1χ10_9Μ時,仍可檢測到磷酸化肽段，說明材料MagCNTsOTiO2對于磷酸化肽段有很高的富集效率。
[0040]本具體實(shí)施例采用的是二氧化鈦?zhàn)鳛樾揎棿判约{米顆粒層表面的金屬氧化物是， 金屬氧化物還可以采用二氧化鉿或二氧化鋯。
【權(quán)利要求】
1.一種碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料，其特征在于:在碳納米管CNTs表面覆蓋有超順磁性四氧化三鐵納米顆粒層，所述磁性納米顆粒層表面修飾有金屬氧化物MxOy納米顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料，其特征在于:所述金屬氧化物MxOy為二氧化鈦、二氧化鉿或二氧化鋯。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的任一種超順磁性納米復(fù)合材料的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將碳納米管CNTs分散到濃硝酸中，30?50°C下反應(yīng)3?5小時進(jìn)行預(yù)處理，然后過濾、洗滌、干燥備用； (2)向檸檬酸鈉、醋酸鈉和聚乙二醇的乙二醇溶液中，加入預(yù)處理過的CNTs和三氯化鐵六水合物FeCl3.6Η20攪拌下超生反應(yīng)I?2小時后，在高壓反應(yīng)器中150?250°C下反應(yīng)10?15小時，獲得超順磁性碳納米管材料MagCNTs ； (3)將磁性碳納米管材料MagCNTs在異丙醇中經(jīng)超聲處理后,加入二乙胺和異丙醇鈦，在高壓釜中200°C下反應(yīng)5小時，離心分離、清洗干燥后再在400°C下進(jìn)行退火反應(yīng)2h，獲得碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的任一種超順磁性納米復(fù)合材料應(yīng)用于對磷酸化蛋白和肽段的富集，其特征在于包括以下步驟: (1)將蛋白溶于NH4HCO3水溶液中，加入胰蛋白酶，37°C下酶解16小時，將蛋白酶解液用50%乙腈和0.1%三氟乙酸混合而成的緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度； (2)取碳納米管包覆金屬氧化物晶體的超順磁性納米復(fù)合材料的懸濁液，用50%乙腈和0.1%三氟乙酸混合而成的緩沖液洗滌后加入到稀釋后的蛋白酶解液，在25°C下混旋5?10分鐘,用磁鐵分離去除上清液,而后利用緩沖液洗滌，除去上清液后加入0.4M氨水，在25°C下混旋2分鐘，將磷酸化肽段洗脫下來。
【文檔編號】B01D15/08GK103559970SQ201310473851
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】曲峰, 鄧春暉, 尚春慶 申請人:蘇州英芮誠生化科技有限公司