核殼結構量子點的制備方法、靶向腫瘤標志物gpc-3的熒光納米探針及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于納米材料制備技術領域，具體涉及一種核殼結構量子點的制備方法、靶向腫瘤標志物GPC-3的熒光納米探針及其制備方法，以ZnS為殼層，設計合成一系列具有核殼結構的熒光量子點，通過物理吸附表現(xiàn)偶聯(lián)抗體GC33后，制成靶向肝癌細胞標志物的熒光納米探針(GC-QDs )，可用于生物標記以及藥物載體系統(tǒng)。
【背景技術】
[0002]量子點(quantum dots ；QDs)是由I1-VI和II1-V族元素組成的納米顆粒，具有優(yōu)良的熒光性質，相比普通的有機熒光染料，熒光量子點具有寬的激發(fā)波長范圍和窄而對稱的發(fā)射波長范圍、熒光產(chǎn)率高且穩(wěn)定性好、熒光壽命長等諸多優(yōu)點，可作為一種理想的熒光探針及載體材料，研究細胞定位、信號傳導、細胞內(nèi)分子的運動和迀移等過程?？蓱玫椒肿映上?、無損傷在線監(jiān)測、治療以及預后觀察等生物醫(yī)學領域。
[0003]將兩種不同的發(fā)光材料構成核殼結構的量子點之后，具有改善量子點的發(fā)光性質；實現(xiàn)雙波長檢測(特別是在近紅外區(qū))；降低量子點的生物毒性等特點，更有利于在生物醫(yī)學領域的應用。目前，核殼結構量子點的合成多采用三辛基膦(TOP)或磷酸三丁酯(TBP)等危險試劑，比如中國發(fā)明專利CN103361066A公開的一種一步法合成CdSe/CdS核殼結構量子點的制備方法，包括如下步驟:(1)將鎘前軀體與油酸、十八烯混合，置于反應容器中；
(2)在氬氣氛圍中，或氮氣氛圍中將鎘、油酸和十八烯的混合液加熱至鎘前軀體完全溶解，降至室溫；(3)向反應容器中加入油胺和三辛基氧化膦(Τ0Ρ0)，在氬氣氛圍中將溶液加熱至150~320°C ； (4)注入三辛基膦化合物前驅體，反應10秒至5分鐘；(5)加入由乙基黃原酸鎘與硬脂酸鎘組成的Cd前軀體，保持溫度10分鐘至50分鐘后，得到由CdS包覆的核殼量子點。本發(fā)明中使用了三辛基膦為反應介質。
[0004]又如中國發(fā)明專利CN101319138A公開了一種CdS及CdS/ZnS核殼型量子點的制備方法，其權利要求6中有述:所述的選用鋅鹽作為包殼用Zn前體，(TMS) 2S作為包殼用S前體，形成ZnS殼前體溶液，具體為:將鋅鹽和(TMS) 2S溶解在膦化合物和液體石蠟的混合溶液中，膦化合物和液體石錯的混合體積比為1:3，使Zn前體的摩爾濃度為25-200毫摩爾/升，S前體的摩爾濃度為25-200毫摩爾/升，超聲形成ZnS殼前體溶液，其中:所述鋅鹽是硬脂酸鋅、乙酸鋅或草酸鋅，所述膦化合物是三正辛基膦、三正丁基膦、三本基膦或十四烷基磷酸。
[0005]再如中國發(fā)明專利CN104745193A公開了一種熒光磁性納米復合材料及其制備方法，權利要求8的技術方案為:所述ZnSe-ZnS核殼量子點的制備方法包括以下步驟:稱取
0.32-0.42g硬脂酸鋅溶于甲苯中，通氮氣，加熱到50~70°C，然后冷卻至室溫，得到Zn前體溶液；將16~24mg的S粉溶于三正辛基膦中，通氮氣，加熱到80~100°C，制得S前體溶液；在氮氣保護下，加入已經(jīng)準備好的ZnSe QDs溶液，且控制ZnSe =ZnS為1: (0.5-3),同時加入正庚烷、三正辛基氧化膦和十六烷基胺；混合溶液加入攪拌至180~200°C，直到正庚烷完全揮發(fā)為止；然后一邊攪拌一邊將已經(jīng)制得的Zn前體溶液和S前體溶液緩慢加入，保持溫度在180~200°C，反應至少lh，然后用甲醇洗滌純化，沉淀真空干燥后得ZnSe-ZnS核殼量子點。
[0006]上述兩份發(fā)明專利中制備以ZnS為殼層的核殼結構量子點時選用了三正辛基膦為反應介質。而在合成核殼結構量子點時使用三辛基膦(TOP)或磷酸三丁酯(TBP)等危險試劑，既不安全又不環(huán)保。由于Zn的無毒無害特性，以ZnS為殼層的核殼結構量子點在生物醫(yī)藥領域的應用已被研究，可用于生物標記和檢測，以及合成熒光納米探針等。
[0007]將兩種不同類型的量子點結合成具有核殼結構的納米復合物之后，通過減少內(nèi)核量子點的表面缺陷，有利于限制其電子處于空穴核區(qū)，使核殼型量子點較單核型具有更好的化學穩(wěn)定性和光學特性，還能改善原有量子點的細胞毒性。目前，核殼結構的量子點主要集中在量子點形狀的改變、金屬摻雜等優(yōu)化量子點發(fā)光性質的研究，如何通過表面修飾提高量子點的靶向性，得到高效、低毒、熒光性好的多功能納米探針是目前亟需解決的問題。
[0008]GPC-3為膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白，在肝癌組織中特異表達，參與調控多條信號通路，與肝細胞性肝癌(HCC)的發(fā)生發(fā)展密切相關。多因素分析表明:GPC-3表達是一個HCC總生存率的獨立預后因子，血可溶性GPC-3既可用于肝癌診斷又可評估肝癌患者的預后。因此，通過建立高特異性和高靈敏度的GPC-3監(jiān)測方法，可有望實現(xiàn)靶向HCC的準確診斷和及時治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種核殼機構量子點的制備方法、靶向腫瘤標志物GPC-3的熒光納米探針及其制備方法，通過ZnS的殼層修飾降低或者消除了內(nèi)核量子點的生物毒性，使其具有更好的生物安全性；制得的納米探針克服生物組織對熒光干擾的影響，實現(xiàn)對肝癌的原位、活體標記與成像，為熒光量子點的臨床應用提供實驗基礎和理論研究。
[0010]為解決上述技術問題，本發(fā)明的實施例提供一種核殼結構量子點的制備方法，所述核殼結構量子點為ZnO/ZnS，通過共沉淀法將乙酸鋅和乙酸鈉混合液混合加熱、氧化后制得ZnO，然后加入硫代乙酰胺作為S2源，按照S-Zn-S-Zn逐層對其進行ZnS殼層包覆，形成ZnO/ZnS量子點。
[0011]進一步，所述ZnO/ZnS核殼結構量子點的制備方法具體如下:
(1-1)將3~8g乙酸鋅和0.3-1.5g乙酸鈉加入到裝有200mL乙醇的圓底燒瓶中；
(1-2)加熱溶解后，迅速加入1.0 mol/1的氧化鈉乙醇溶液18~50 mL，反應30~60分鐘，冷卻至室溫；
(1-3)在溶液中以0.5-2.0滴/秒的滴速滴加過量乙酸乙酯至有沉淀產(chǎn)生，離心分離出沉淀物，用乙酸乙酯洗滌3~5次，然后把沉淀物重新分散在乙醇中，制得ZnO納米顆粒；(1-4)向ZnO納米顆粒的懸浮液中依次滴加0.2 mol/1的乙酸鋅3~10 ml和等體積的
0.2 mol/1的硫代乙酰胺的乙醇溶液，滴速保持0.5-2.0滴/秒，滴加完成后加熱；
(1-5)按照S-Zn-S-Zn逐層對其進行ZnS殼層包覆，形成ZnO/ZnS量子點，反應4~8小時后終止，再次使用乙酸乙醋沉淀出不同粒徑的ZnO/ZnS核殼納米顆粒，離心分離出ZnO/ZnS核殼結構量子點。
[0012]本發(fā)明還提供一種靶向腫瘤標志物GPC-3的熒光納米探針，以ZnS為殼層的核殼結構的熒光量子點為載體，通過表面修飾單抗GC-33制備得到。
[0013]本發(fā)明還提供一種靶向腫瘤標志物GPC-3的熒光納米探針的制備方法，包括如下步驟:
(2-1)制備以ZnS為殼層的核殼結構量子點；
(2-2)取2~10 ml的以ZnS為殼層的核殼結構量子點溶液超生分散，15000 rpm轉離心30-50 min，加超純水0.5 ml，備用；
(2-3)取5~20 mg的碳化二亞胺(EDC)，1-1Omg N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHSS)加水
1.0 ml溶解；
(2-4)取上述溶液0.3-1.0 ml加入以ZnS為殼層的核殼結構量子點溶液中，定容至
1.0-5.0 ml，37°C搖床反應1~2小時；
(2-5) 15000 rpm高速離心30-50分鐘，棄上清，用pH 8.5的PBS溶液250-1000 μ I
重新溶解；
(2-6)加5~20 μ I的靶向GPC-3的單抗GC-33溶液，37°C的恒溫下，搖床反應2~3小時，將單抗GC-33修飾到以ZnS為殼層的核殼結構量子點的表面；
(2-7)15000 rpm離心30~50分鐘，溶于pH 7.2的PBS溶液中，分離提純得到靶向腫瘤標志物GPC-3的熒光納米探針(GC-QDs)。
[0014]其中，所述步驟(2-1)中的以ZnS為殼層的核殼結構量子點為ZnO/ZnS，其制備步驟如前面所述。
[0015]本發(fā)明的上述技術方案的有益效果如下:
1.本發(fā)明中核殼結構的量子點載體的合成方法避免使用三辛基膦(TOP)或磷酸三丁酯(TBP)等危險試劑，安全、環(huán)保，并且步驟簡單，成本低廉。
[0016]2.本發(fā)明通過改進合成方法和核殼的結構比率等，可制備一系列不同粒徑和結構比例的核殼結構的量子點，實現(xiàn)量子點在可見-近紅外區(qū)內(nèi)實現(xiàn)熒光可調，具有更好的熒光發(fā)光性質，并且通過ZnS的殼層修飾降低或者消除了內(nèi)核量子點的生物毒性，使其具有更好的生物安全性。
[0017]3.本發(fā)明通過將GC-33修飾到量子點的表面制備得到高特異性、高靶向性的納米探針，通過克服生物組織對熒光干擾的影響，實現(xiàn)對肝癌的原位、活體