本發(fā)明屬于hg²⁺和乙酰膽堿酯酶的檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于亞胺連接的熒光納米顆粒，以及以該納米顆粒為熒光探針檢測hg²⁺和乙酰膽堿酯酶。

背景技術(shù)：

汞俗稱水銀，常以液態(tài)存在，是一種重金屬。水銀是一種高毒性和非必需元素，是生態(tài)系統(tǒng)中能完善循環(huán)的唯一的重金屬，通過食物鏈的互補表達將最終傳遞給人體。汞離子可以與稀少的堿基結(jié)合并干擾細胞代謝和功能。此外，汞會破壞人體中樞神經(jīng)組織，如果長期在高汞環(huán)境下活動會導致腦損傷甚至死亡。汞主要以金屬汞、無機汞和有機汞化合物的形式存在于自然界中，hg²⁺污染是一個全球性的環(huán)境問題。

乙酰膽堿酯酶主要存在于膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)肌肉接頭中，通過降解體內(nèi)的乙酰膽堿，終止膜的興奮作用，確保神經(jīng)信號的正常傳導。乙酰膽堿酯酶與一些疾病如阿爾茨海默病、重癥肌無力病等的發(fā)生有密切關(guān)系。乙酰膽堿酯酶在昆蟲抗藥性、環(huán)境監(jiān)測和臨床醫(yī)學等方面都有著較為深入的應用?，F(xiàn)代技術(shù)可利用昆蟲誘變劑，使得殺蟲劑對它們體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶更加敏感，從而減少農(nóng)藥的使用量。此外，利用氨基甲酸酯類農(nóng)藥或者有機磷能夠抑制乙酰膽堿酯酶的催化活性，實現(xiàn)了對氨基甲酸酯類農(nóng)藥或者有機磷的成熟檢測。目前檢測乙酰膽堿酯酶的方法(如ellman方法，熒光分析法，電化學方法和衍射法等)尚有不足，如易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果、檢測靈敏度低、缺乏特異性底物、樣品的背景干擾大、樣品制備程序繁瑣、測量時間長等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)對hg²⁺和乙酰膽堿酯酶檢測的不足，提供一種基于亞胺連接的熒光納米顆粒，以及以該納米顆粒作為熒光探針檢測hg²⁺和乙酰膽堿酯酶的應用。

解決上述問題所采用的基于亞胺連接的熒光納米顆粒由下述方法制備得到：

以無水乙醇為溶劑，將1,3,5-苯三甲醛和3,5-二氨基苯甲酸按摩爾比為1：1～2，在室溫下攪拌反應20～40分鐘，離心分離并用無水乙醇洗滌，固體產(chǎn)物加入n,n-二甲基甲酰胺中室溫回流3～5小時，離心除去n,n-二甲基甲酰胺，再加入無水乙醇中回流1～3小時，離心、洗滌、室溫真空干燥，得到基于亞胺連接的熒光納米顆粒。

本發(fā)明基于亞胺連接的熒光納米顆粒在檢測hg²⁺中的應用，檢測方法如下：

1、將基于亞胺連接的熒光納米顆粒分散于超純水中，配制成2～5μg/ml的熒光納米顆粒分散液，用熒光分光光度計在激發(fā)波長為313nm下檢測分散液在發(fā)射波長為410nm處的熒光強度f0，然后向該分散液中加入hg²⁺標準樣品，常溫孵育30分鐘后震蕩均勻，用熒光分光光度計檢測在發(fā)射波長為410nm處不同濃度hg²⁺對應體系的熒光強度f，繪制f0/f隨hg²⁺濃度變化的標準曲線。

2、按照步驟1的方法檢測待測hg²⁺樣品對的熒光強度f，結(jié)合步驟1中標準曲線的線性方程即可確定待測樣品中hg²⁺的濃度。

上述步驟1中，優(yōu)選將基于亞胺連接的熒光納米顆粒分散于超純水中，配制成3～4μg/ml熒光納米顆粒分散液。

本發(fā)明基于亞胺連接的熒光納米顆粒在檢測乙酰膽堿酯酶中的應用，檢測方法如下：

1、將基于亞胺連接的熒光納米顆粒分散于ph＝7.5的磷酸鹽緩沖液中，配制成2～5μg/ml的熒光納米顆粒分散液，向該分散液中加入hg²⁺標準樣品，使混合體系中hg²⁺的濃度為15～25μmol/l，然后加入碘代硫代乙酰膽堿，使混合體系中碘代硫代乙酰膽堿的濃度與hg²⁺的濃度相同，用熒光分光光度計在激發(fā)波長為313nm下檢測混合體系在發(fā)射波長為410nm處的熒光強度f0，再加入乙酰膽堿酯酶標準樣品，常溫孵育30分鐘后震蕩均勻，用熒光分光光度計檢測在發(fā)射波長為410nm處不同活度乙酰膽堿酯酶對應體系的熒光強度f，繪制(f-f0)/f0隨乙酰膽堿酯酶濃度變化的標準曲線。

2、按照步驟1的方法檢測待測乙酰膽堿酯酶樣品對應的熒光強度f，結(jié)合步驟1中標準曲線的線性方程即可確定待測樣品中乙酰膽堿酯酶的濃度。

上述步驟1中，優(yōu)選將基于亞胺連接的熒光納米顆粒分散于ph＝7.5的磷酸鹽緩沖液中，配制成3～4μg/ml的熒光納米顆粒分散液。

本發(fā)明所用的hg²⁺標準樣品為hgcl2。本發(fā)明以3,5-二氨基苯甲酸和1,3,5-苯三甲醛為單體采用簡單的室溫合成方法制備成基于亞胺連接的熒光納米顆粒，然后以該熒光納米顆粒作為熒光探針檢測hg²⁺和乙酰膽堿酯酶，建立了水體中痕量hg²⁺分析方法，并建立了一種檢測乙酰膽堿酯酶的方法。與其他熒光探針相比，本發(fā)明熒光納米顆粒不僅具有較高的絕對熒光量子產(chǎn)率、均勻的球形粒徑分布，而且具有較好的結(jié)晶度、均勻的孔徑分布和良好的熱穩(wěn)定性能，并且檢測hg²⁺和乙酰膽堿酯酶的選擇性高、準確度高、精密度好。

附圖說明

圖1是基于亞胺連接的熒光納米顆粒的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。

圖2是基于亞胺連接的熒光納米顆粒的紅外光譜圖(a:3,5-二氨基苯甲酸,b:1,3,5-苯三甲醛；c:熒光納米顆粒)。

圖3是基于亞胺連接的熒光納米顆粒的透射電鏡圖。

圖4是基于亞胺連接的熒光納米顆粒的x-射線衍射儀譜圖。

圖5是基于亞胺連接的熒光納米顆粒的氮氣吸附-解析曲線。

圖6是基于亞胺連接的熒光納米顆粒的孔徑分布圖。

圖7是基于亞胺連接的熒光納米顆粒在n2氣氛下的熱重分析曲線圖。

圖8是基于亞胺連接的熒光納米顆粒的熒光強度隨hg²⁺濃度變化的熒光光譜圖。

圖9是基于亞胺連接的熒光納米顆粒的熒光強度比值隨hg²⁺濃度變化的標準曲線。

圖10是基于亞胺連接的熒光納米顆粒的熒光強度比水中共存金屬離子的熒光響應柱狀圖。

圖11是基于亞胺連接的熒光納米顆粒的熒光強度隨乙酰膽堿酯酶活度變化的熒光光譜圖。

圖12是基于亞胺連接的熒光納米顆粒的熒光強度恢復率隨乙酰膽堿酯酶活度變化的標準曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于這些實施例。

實施例1

稱取48.64g(0.30mmol)1,3,5-苯三甲醛和68.47g(0.45mmol)3,5-二氨基苯甲酸，分別溶于20ml無水乙醇中，然后將1,3,5-苯三甲醛的乙醇溶液迅速倒入3,5-二氨基苯甲酸的乙醇溶液中，室溫攪拌反應30min，然后在10000rpm下離心5min，并用無水乙醇洗滌3次，再于20mln,n-二甲基甲酰胺中室溫回流4h，離心除去n,n-二甲基甲酰胺，接著再用無水乙醇回流2h，離心，洗滌，室溫真空干燥12h，得到基于亞胺連接的熒光納米顆粒。

發(fā)明人采用pels55型熒光分光光度計、紅外光譜儀、透射電子顯微鏡、粉末x-射線衍射儀、物理吸附儀、熱重分析儀對所得熒光納米顆粒進行表征，結(jié)果見圖1～7。由圖1可見，所得熒光納米顆粒有兩個最大激發(fā)波長分別為225nm和313nm。圖2中，曲線a上3435cm^-1和3353cm^-1處的兩個尖峰為-nh2的吸收峰，曲線b上1695cm^-1處為芳香醛中-cho的吸收峰，曲線c中-nh2和-cho的吸收峰消失，而在1627cm^-1處出現(xiàn)了-c＝n-的吸收峰、1702cm^-1處存在-c＝o-的吸收峰，表明所得熒光納米顆粒依然存在單體3,5-二氨基苯甲酸中的羧基。由圖3可見，所得熒光納米顆粒呈球形，其粒徑約為3nm，且粒徑較均一。圖4中，2θ在小角度2.4°時有一個非常強的衍射峰，說明熒光納米顆粒有很好的結(jié)晶度。由圖5和圖6可見，所得熒光納米顆粒的bet比表面積為50.93m2·g^-1、langmuir比表面積為88.36m2·g^-1，孔容量為0.03cm3·g^-1，孔徑尺寸分布在1.00～1.25nm，更多的集中在1.08nm處，并且孔徑分別比較均一。由圖7可見，在100℃以下時，所得熒光納米顆粒有輕微的質(zhì)量損失，這主要是由于材料表面吸附的水分子，當溫度繼續(xù)升高至約380℃時，材料開始分解損失質(zhì)量，由此證明所得熒光納米顆粒在低于380℃的溫度下不會分解，可以穩(wěn)定存在，其熱穩(wěn)定性能良好。

實施例2

實施例1中基于亞胺連接的熒光納米顆粒在檢測hg²⁺中的應用，具體方法如下：

1、將0.0034mg基于亞胺連接的熒光納米顆粒分散于1ml超純水中，配制成3.4μg/ml的熒光納米顆粒分散液；分別取50μl熒光納米顆粒分散液于試管中，隨后分別加入100μl不同濃度的hg²⁺水溶液，用超純水定容至250μl，并混合均勻，使得最終混合溶液中hg²⁺的濃度分別為0、0.08、0.40、0.64、0.80、1.60、4.00、6.40、8.00、16.00和24.00μmol/l，然后常溫孵育30min后震蕩均勻，用pels55熒光分光光度計(熒光條件：激發(fā)波長為313nm、發(fā)射光譜的范圍為340～550nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度分別為5nm、10nm)檢測不同濃度hg²⁺對應體系的熒光光譜和在發(fā)射波長為410nm處不同濃度hg²⁺對應體系的熒光強度f(其中hg²⁺濃度為0時對應體系的熒光強度記為f0)，結(jié)果見圖8，并繪制f0/f隨hg²⁺濃度(chg2+)變化的標準曲線，見圖9。

由圖8～9可見，在相同的檢測條件下，熒光納米顆粒對hg²⁺有明顯的熒光響應，在hg²⁺濃度為0～24.00μmol/l時，熒光強度比值f0/f與hg²⁺濃度(chg2+)呈線性關(guān)系，線性方程為：

y＝0.9894+0.09109x

式中y為f0/f，x為hg²⁺濃度，相關(guān)系數(shù)r²＝0.9932，由相關(guān)系數(shù)可見，熒光強度比值與hg²⁺濃度的線性關(guān)系很好。經(jīng)測試，該熒光納米顆粒對hg²⁺的檢出限為0.030μmol/l。

2、按照步驟1的方法采用pels55熒光分光光度計檢測待測hg²⁺樣品的熒光光譜，根據(jù)待測樣品的熒光強度f，結(jié)合步驟1中標準曲線的線性方程即可確定待測樣品中hg²⁺的濃度。

發(fā)明人按照實施例1的方法進行了選擇性試驗和實際樣品分析，具體試驗情況如下：

1、選擇性試驗

按照實施例1步驟1的方法分別檢測基于亞胺連接的熒光納米顆粒對水中存在物質(zhì)的熒光響應情況(其中所測試的金屬離子的濃度為hg²⁺濃度的50倍)，結(jié)果見圖10。由圖10可以看出，該熒光納米顆粒對hg²⁺的熒光響應大于水中存在的其他金屬離子，說明本發(fā)明基于亞胺連接的熒光納米顆?？垢蓴_能力很強。

2、樣品分析

實驗采用自來水和湖水作為實際樣品進行分析。自來水由陜西師范大學提供，湖水取自于陜西師范大學昆明湖。用0.22μm的水系纖維濾頭將自來水和湖水分別過濾，之后加入一定量的hg²⁺作為實際樣品，然后分別取一定量的實際樣品和一定量的熒光納米顆粒分散液，室溫孵育30min后震蕩均勻，用pels55熒光分光光度計檢測體系的熒光光譜，按照實施例1中的線性方程計算體系中hg²⁺的濃度，根據(jù)加標量和測定值計算加標回收率，結(jié)果如表1所示。

表1加標回收率(n＝5)

由表1可知，本發(fā)明熒光納米顆粒對兩種樣品3個濃度梯度的hg²⁺加標的加標回收率在91.7％～106.3％，而且標準偏差均低于7.86％，說明該方法的準確度較高、精密度較好。由此可見，本發(fā)明基于亞胺連接的熒光納米顆粒檢測hg²⁺的方法可用于檢測實際樣品，在環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域具有潛在的應用價值。

實施例3

1、將0.0034mg基于亞胺連接的熒光納米顆粒分散于1mlph值為7.5的磷酸鹽緩沖液中，配制成3.4μg/ml的熒光納米顆粒分散液；分別取50μl熒光納米顆粒分散液于試管中，隨后加入50μl100.00μmol/l的hg²⁺水溶液和50μl100.00μmol/l的碘代硫代乙酰膽堿水溶液，并分別加入50μl不同活度的乙酰膽堿酯酶水溶液，用50μlph值為7.5的磷酸鹽緩沖液定容至250μl，混合均勻，使混合溶液中乙酰膽堿酯酶的活度分別為0、1.33、6.67、13.33、33.33、40.00、46.67、53.33mu/ml，然后常溫孵育30min后震蕩均勻，用pels55熒光分光光度計檢測(熒光條件：激發(fā)波長為313nm、發(fā)射光譜的范圍為340～550nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度分別為5nm、10nm)混合溶液的熒光光譜和在發(fā)射波長為410nm處不同活度乙酰膽堿酯酶對應體系的熒光強度f(其中乙酰膽堿酯酶活度為0時對應體系的熒光強度記為f0)，結(jié)果見圖11和12。

由圖11可見，未加入乙酰膽堿酯酶時，hg²⁺可以猝滅熒光納米顆粒，因而其熒光強度最小，而加入不同活度的乙酰膽堿酯酶后，熒光納米顆粒的熒光發(fā)生了不同程度的恢復，其熒光強度恢復率((f-f0)/f0)與乙酰膽堿酯酶(ache)的活度呈線性關(guān)系(見圖12)，線性方程為

y＝42.43+1.141x

式中y為熒光強度恢復率，x為乙酰膽堿酯酶活度，相關(guān)系數(shù)r²＝0.9721，由相關(guān)系數(shù)可見，熒光強度恢復率與乙酰膽堿酯酶活性的線性關(guān)系較好。經(jīng)測試，該熒光納米顆粒對乙酰膽堿酯酶的檢出限為0.45mu/ml。由此可見，本發(fā)明基于亞胺連接的熒光納米顆粒檢測乙酰膽堿酯酶的方法可利用巰基和hg²⁺的結(jié)合在檢測巰基化合物方面具有潛在的應用價值。