本發(fā)明涉及有機(jī)橋接分子技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種具有熒光發(fā)射性質(zhì)的抗體-藥物/探針綴合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多肽、蛋白質(zhì)、抗體與合成聚合物、藥物的共價(jià)偶聯(lián)，增強(qiáng)了其在臨床應(yīng)用過程中的穩(wěn)定性，延長了循環(huán)時(shí)間，具備了特異性靶向的能力，提高了治療效率。多種類型的正交click反應(yīng)被用來構(gòu)筑蛋白質(zhì)/抗體生物偶聯(lián)物，新的設(shè)計(jì)原則的引入，如，模塊化設(shè)計(jì)和溫和的合成方式，進(jìn)一步促進(jìn)了該領(lǐng)域的發(fā)展。在某些情況下，治療負(fù)載(蛋白質(zhì)或藥物)從偶聯(lián)物后期中的釋放，可以進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的活性和治療效率。然而，功能化偶聯(lián)物的偶聯(lián)和釋放過程主要依賴于傳統(tǒng)的非原位技術(shù)，如，體積排除色譜(sec)，凝膠電泳和質(zhì)譜。

另外，抗體定向的光學(xué)分子的成像在醫(yī)學(xué)診斷和治療響應(yīng)評價(jià)中展現(xiàn)出巨大的潛力；也可直接與手術(shù)或內(nèi)窺鏡過程結(jié)合。用熒光探針標(biāo)記的靶向抗體可以在體內(nèi)實(shí)時(shí)高分辨成像，可用于初期的檢測和手術(shù)中殘留癌癥組織的監(jiān)測。然而，一直有熒光的探針也有本質(zhì)的缺陷，如背景干擾和低的信噪比。

抗體-藥物綴合物能夠降低體系毒性和增強(qiáng)偶聯(lián)藥物的治療效率。在抗體-藥物綴合物中連接鍵的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，因?yàn)樗粌H要求能夠?yàn)檎诒嗡幬镌隗w循環(huán)提供充足的穩(wěn)定性，而且在腫瘤細(xì)胞內(nèi)應(yīng)能快速有效地釋放藥物。觸發(fā)性可斷裂連接鍵常被用來連接藥物和抗體。然而，目前偶聯(lián)效率和觸發(fā)后釋放程度的定量大多依賴于非原位技術(shù)，如高效液相色譜、凝膠電泳、體積排除色譜以及質(zhì)譜。目前尚不能實(shí)現(xiàn)對抗體-藥物綴合物在體外和細(xì)胞水平上的釋放過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種具有熒光發(fā)射性質(zhì)的抗體-藥物/探針綴合物及其制備方法和應(yīng)用，能夠通過熒光監(jiān)測的方法原位監(jiān)控綴合過程，并應(yīng)用于治療多肽與抗癌藥物的傳輸。

本發(fā)明提供了一種具有熒光發(fā)射性質(zhì)的抗體-藥物/探針綴合物，具有式i所示結(jié)構(gòu)：

其中，ab為抗體，dp為熒光探針或藥物分子。

本發(fā)明提供了一種具有熒光發(fā)射性質(zhì)的抗體-探針綴合物，具有式ⅱ所示結(jié)構(gòu)：

其中，ab為癌胚抗原單抗或赫賽丁。

本發(fā)明提供了上述抗體-探針綴合物的制備方法，包括以下步驟：

單克隆抗體、含疊氮基元的熒光探針a與雙官能熒光分子b進(jìn)行michael反應(yīng)和點(diǎn)擊反應(yīng)，得到式ⅱ所示抗體-探針綴合物；

其中，所述單克隆抗體為含巰基的癌胚抗原單抗或赫賽丁。

優(yōu)選的，通過熒光發(fā)射強(qiáng)度原位監(jiān)控抗體-探針綴合物的綴合效率。

本發(fā)明提供了上述抗體-探針綴合物或上述制備方法制備的抗體-探針綴合物作為抗原與醌氧化還原酶反應(yīng)指示劑的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種具有熒光發(fā)射性質(zhì)的抗體-藥物綴合物，具有式ⅲ所示結(jié)構(gòu)：

其中，dox為阿霉素，ab為癌胚抗原單抗或赫賽丁。

本發(fā)明提供了上述抗體-藥物綴合物的制備方法，包括以下步驟：

單克隆抗體、含疊氮基元的前藥分子c與雙官能熒光分子b進(jìn)行michael反應(yīng)和點(diǎn)擊反應(yīng)，得到式ⅲ所示抗體-藥物綴合物；

其中，dox為阿霉素，單克隆抗體為含巰基的癌胚抗原單抗或赫賽丁。

優(yōu)選的，通過熒光發(fā)射強(qiáng)度原位監(jiān)控抗體-藥物綴合物的綴合效率。

本發(fā)明提供了上述抗體-藥物綴合物或上述制備方法制備的抗體-藥物綴合物作為熒光指示劑實(shí)時(shí)監(jiān)控藥物釋放的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述抗體-藥物綴合物或上述制備方法制備的抗體-藥物綴合物作為靶向藥物釋放載體的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種具有熒光發(fā)射性質(zhì)的抗體-藥物/探針綴合物，具有式i所示結(jié)構(gòu)。本發(fā)明提供的抗體-藥物/探針綴合物具有自報(bào)告綴合效率特征，其由雙官能度熒光分子橋接抗體與探針/藥物分子，所述的雙官能度熒光分子本身不具有或者僅具有弱的熒光發(fā)射能力，僅當(dāng)抗體-探針/藥物綴合后熒光分子才具有強(qiáng)的熒光發(fā)射，因此能夠通過熒光監(jiān)測的方法原位監(jiān)控綴合過程，并應(yīng)用于治療多肽與抗癌藥物的傳輸。

附圖說明

圖1為實(shí)施例2制備的前藥分子的核磁共振氫譜圖；

圖2為實(shí)施例2制備的前藥分子的電噴霧質(zhì)譜圖；

圖3為實(shí)施例3制備的熒光探針a的核磁共振氫譜圖；

圖4為實(shí)施例3制備的熒光探針a的電噴霧質(zhì)譜圖；

圖5為實(shí)施例4制備抗體-探針綴合物反應(yīng)過程中的熒光變化過程曲線圖；

圖6為實(shí)施例4制備抗體-藥物綴合物反應(yīng)過程中的熒光變化過程曲線圖；

圖7為實(shí)施例4制備的抗體-探針綴合物的酶檢測過程熒光變化過程；

圖8為實(shí)施例4制備的抗體-探針綴合物的細(xì)胞內(nèi)癌胚抗原與醌氧化還原酶檢測；

圖9為實(shí)施例4制備的抗體-藥物綴合物的硝基還原酶觸發(fā)藥物釋放過程熒光變化過程；

圖10為實(shí)施例4制備的抗體-藥物綴合物的含癌胚抗原的細(xì)胞內(nèi)硝基還原酶觸發(fā)藥物釋放過程。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種具有熒光發(fā)射性質(zhì)的抗體-藥物/探針綴合物，具有式i所示結(jié)構(gòu)：

其中，ab為抗體，dp為熒光探針或藥物分子。

本發(fā)明提供的抗體-藥物/探針綴合物具有自報(bào)告綴合效率特征，其由雙官能度熒光分子橋接抗體與探針/藥物分子，所述的雙官能度熒光分子本身不具有或者僅具有弱的熒光發(fā)射能力，僅當(dāng)抗體-探針/藥物綴合后熒光分子才具有強(qiáng)的熒光發(fā)射，因此能夠通過熒光監(jiān)測的方法原位監(jiān)控綴合過程，并應(yīng)用于治療多肽與抗癌藥物的傳輸。

具體的，當(dāng)dp為熒光探針時(shí)，本發(fā)明提供了一種具有熒光發(fā)射性質(zhì)的抗體-探針綴合物，具有式ⅱ所示結(jié)構(gòu)：

其中，ab為癌胚抗原單抗或赫賽丁。

本發(fā)明還提供了上述抗體-探針綴合物的制備方法，包括以下步驟：

單克隆抗體、含疊氮基元的熒光探針a與雙官能熒光分子b進(jìn)行michael反應(yīng)和點(diǎn)擊反應(yīng)，得到式ⅱ所示抗體-探針綴合物。

所述單克隆抗體為含巰基的癌胚抗原單抗或赫賽丁。

所述含疊氮基元的熒光探針a如下式a所示：

所述雙官能熒光分子b如下式b所示：

本發(fā)明對上述反應(yīng)的原料配比、反應(yīng)條件并無特殊限定，可以為本領(lǐng)域常規(guī)的michael反應(yīng)和點(diǎn)擊反應(yīng)的配比和條件。

本發(fā)明優(yōu)選的，通過熒光發(fā)射強(qiáng)度原位監(jiān)控抗體-探針綴合物的綴合效率。

本發(fā)明提供的上述抗體-探針綴合物具有醌氧化還原酶作用下的熒光變化，因此可以作為抗原與醌氧化還原酶反應(yīng)指示劑應(yīng)用。

當(dāng)dp為藥物分子時(shí)，本發(fā)明提供了一種具有熒光發(fā)射性質(zhì)的抗體-藥物綴合物，具有式ⅲ所示結(jié)構(gòu)：

其中，dox為阿霉素，ab為癌胚抗原單抗或赫賽丁。

本發(fā)明還提供了上述抗體-藥物綴合物的制備方法，包括以下步驟：

單克隆抗體、含疊氮基元的前藥分子c與雙官能熒光分子b進(jìn)行michael反應(yīng)和點(diǎn)擊反應(yīng)，得到式ⅲ所示抗體-藥物綴合物；

所述單克隆抗體為含巰基的癌胚抗原單抗或赫賽丁。

所述含疊氮基元的前藥分子c如下式c所示：

式c中，dox為阿霉素。

式c中的氨基為阿霉素四氫吡喃環(huán)上的氨基。

所述雙官能熒光分子b如下式b所示：

本發(fā)明對上述反應(yīng)的原料配比、反應(yīng)條件并無特殊限定，可以為本領(lǐng)域常規(guī)的michael反應(yīng)和點(diǎn)擊反應(yīng)的配比和條件。

本發(fā)明優(yōu)選的，通過熒光發(fā)射強(qiáng)度原位監(jiān)控抗體-藥物綴合物的綴合效率。

本發(fā)明提供的上述抗體-藥物綴合物具有硝基還原酶作用下的原藥阿霉素釋放，因此可以作為熒光指示劑實(shí)時(shí)監(jiān)控藥物釋放，或者作為靶向藥物釋放載體。

為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的具有熒光發(fā)射性質(zhì)的抗體-藥物/探針綴合物及其制備方法和應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)描述。

雙官能熒光分子b的合成路線如下：

實(shí)施例1c1的合成

4-溴水楊醛(1；3.11g,15.4mmol),pd(pph3)2cl2(0.22g,0.31mmol),pph3(0.061g,0.23mmol),無水四氫呋喃(50ml)加入到含有磁力攪拌子的反應(yīng)燒瓶中，用干燥的氮?dú)夤钠鹋輰Ψ磻?yīng)體系脫氣30min，然后新蒸的干燥et3n(3.05g,30.0mmol)和三甲基乙炔基硅(1.67g,17.0mmol)在氮?dú)夥諊录尤?，溶液變成橙色。攪?0min后將助催化劑cui(0.088g,0.46mmol)在氮?dú)夥諊录尤氲椒磻?yīng)體系，溶液變成暗棕色。室溫下攪拌過夜，然后移除溶劑得到暗棕色固體，將其溶解到正戊烷中過濾得到黃色溶液。旋除所有溶劑，最后，正己烷中兩次重結(jié)晶得到黃色晶體2(2.96g,收率:88.2％,>95％hplc純度)。

¹hnmr(cdcl3,δ,ppm,tms):11.0(s,1h,苯-oh),9.87(s,1h,-cho),7.48(d,j＝8.4hz,1h,芳香氫),7.07(m,2h,芳香氫),0.26(s,9h,-si(ch3)3)。

將2(2.85g,13.1mmol)溶于干燥的thf(40ml)中，然后加入20ml含有koh(0.74g,13.2mmol)的meoh溶液，反應(yīng)體系在室溫下攪拌過夜，然后旋發(fā)移除所有溶劑，殘存物重新分散在水中，加入1.0ml乙酸并用3x200ml氯仿萃取。合并有機(jī)相并用無水硫酸鎂干燥，過濾后移除所有溶劑得到棕色固體，正己烷中重結(jié)晶兩次得到黃色固體3(1.02g,收率:53.2％,>95％hplc純度)。

¹hnmr(cdcl3,δ,ppm,tms):11.0(s,1h,苯-oh),9.89(s,1h,-cho),7.52(d,j＝8.4hz,1h,芳香氫),7.12(m,2h,芳香氫),3.29(s,1h,-c≡ch)。

將苯磺酰氯(2.51g,14.3mmol),et3n(2.15g,21.3mmol)和n-乙酰甘氨酸(0.88g,7.5mmol)溶于thf并在室溫下攪拌過夜。移除不溶性鹽后，化合物3(1.02g,7.0mmol)添加到反應(yīng)體系中并在80℃攪拌10h，然后冷卻到0℃，得到沉淀4(1.09g,收率:68.5％,>95％hplc純度)。

¹hnmr(cdcl3,δ,ppm,tms):9.80(s,1h,-co-nh-),8.57(s,1h,芳香氫),7.67(d,j＝8.4hz,1h,芳香氫),7.35(m,2h,芳香氫),4.40(s,1h,-c≡ch),2.14(s,3h,-coch3)。

化合物4(1.09g,4.8mmol),二甲氨基吡啶(0.11g,0.96mmol),(boc)2o(2.11g,9.8mmol)溶解在40mlthf中，反應(yīng)體系在70℃攪拌4h，然后冷卻至室溫，添加meoh(10ml)和nh2nh2·h2o(0.96g,19.2mmol)，反應(yīng)體系再攪拌4h。加入ch2cl2，然后反應(yīng)混合物用1mhcl溶液水洗，收集有機(jī)相并用無水mgso4干燥。過濾除掉不溶性的mgso4，所有溶劑都用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)移除，殘存物溶解到ch2cl2(40ml)和tfa(10ml)的混合溶劑中，攪拌2h后用nahco3溶液水洗，有機(jī)相用mgso4干燥，濾除mgso4后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉溶劑得到目標(biāo)產(chǎn)物5(0.76g)，立刻用于合成c1，具體如下：

化合物5(0.76g,4.1mmol)和馬來酸酐(2.01g,20.5mmol)溶解在100ml丙酮中，回流過夜，冷卻到0℃得到黃色固體沉淀。上述黃色固體沉淀(1.03g)和一水合對甲苯磺酸(154mg)溶解在30ml甲醇中回流過夜，冷卻到0℃得到粗產(chǎn)物黃色沉淀，用etoac/dcm(v/v＝1/2)作為洗脫劑通過柱層析進(jìn)一步純化，得到黃色固體c1(480mg,收率:39.4％,>95％hplc純度)。

¹hnmr(d6-dmso,δ,ppm,tms):10.28(s,1h,-conh-),8.65(s,1h,芳香氫),7.73(d,j＝8.1hz,1h,芳香氫),7.49(s,1h,芳香氫),7.38(s,1h,芳香氫),6.74(d,j＝9.3hz,1h,-nhcoch＝ch-),6.51(d,j＝8.7hz,1h,-ch＝ch-coo-),4.43(s,1h,-c≡ch),3.66(s,3h,-coo-ch3)。

¹³cnmr(cdcl3,δ,ppmtms):167.5,164.2,157.6,149.9,131.9,129.7,128.8,128.6,125.3,124.0,123.1,120.7,119.2,83.8,83.0,52.1。

rp-hplc分析:4.4min(流動(dòng)相:meoh/h2ov/v4/1)。

esi-ms:m/zcalc.forc16h12no5:298.06[m+h]⁺；found:298.0705。

實(shí)施例2前藥分子(dox-pnb-n3)的合成

合成路線如下：

化合物10(4.16g,20.0mmol)和net3(3.22g,31.9mmol)加入到100ml干的dcm中，冷卻至0℃，4-硝基氯甲酸苯酚酯(6.12g,30.4mmol,20mldcm溶液)逐滴加入，在0℃反應(yīng)12h。過濾后溶液用水洗，有機(jī)相用無水mgso4干燥，濾除mgso4后旋發(fā)得到粗產(chǎn)物，利用etoac/pe(v/v＝1:8)作為洗脫劑通過柱層析進(jìn)一步純化，得到白色粉末11(3.82g,收率:51.2％,純度>95％，puritybyhplc)。

¹hnmr(cdcl3,δ,ppm,tms):8.29(t,4h,芳香氫),7.64(d,2h,芳香氫),7.38(d,2h,芳香氫),5.74(m,1h,>ch-ch2n3),3.5～3.8(m,2h,>ch-ch2n3)。

化合物11(186mg,0.5mmol)，dox-hcl(58mg,0.1mmol)和net3(120mg,1.18mmol)溶解在干的dmf(10ml)中，室溫下攪拌24h，抽濾除去鹽后，旋發(fā)掉溶劑得到粗產(chǎn)物，利用chcl3/meoh(v/v＝100:0到90:10)作為洗脫劑通過柱層析進(jìn)一步純化，得到紅色粉末dox-pnb-n3(43mg,收率:55.3％,純度>95％puritybyhplc)。

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.6～8.2(寬峰,5h,芳烴氫),7.42(d,2h,芳烴氫),5.95(m,1h,>ch-ch2n3),5.49(d,2h,>ch-oh&c-oh),5.31(s,1h,-ch2oh),4.92(m,2h,>ch-o-ch<),4.62(d,2h,-ch2oh),4.15(m,1h,>ch-oh),3.95(s,3h,-och3),3.5～3.9(m,3h,>ch-ch2n3&>ch-nhco-),2.8～3.1(m,1h,>chch3),1.6～2.2(m,4h,-ch2-),1.12(d,3h,>chch3)。其核磁共振氫譜圖見圖1所示。

rp-hplc分析:3.7min(流動(dòng)相:meoh/h2ov/v1/3)。

esi-ms:m/zcalc.forc36h36n5o15:778.21[m+h]⁺；found:778.2109。其電噴霧質(zhì)譜圖見圖2所示。

實(shí)施例3熒光探針a(qnam-n3)的合成

合成路線如下：

q3pa(0.51g,2.0mmol)和三乙胺(0.61g,6.0mmol)溶解在60ml的二氯甲烷中，將混合物降溫到0℃，然后緩慢滴加氯甲酸異丁酯(0.31g,2.2mmol)，反應(yīng)1小時(shí)后，加入nam-n3(0.49g,1.75mmol)。反應(yīng)體系在0℃下繼續(xù)反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，通過抽濾除去所有的無機(jī)鹽，旋蒸除去所有的溶劑后得到粗產(chǎn)物。純產(chǎn)物通過柱色譜分離(使用乙酸乙酯/正己烷(v/v＝1/5)為流動(dòng)相)得到。

¹hnmr(cdcl3,δ,ppm):8.37(d,1h,芳烴氫),8.22(d,1h,芳烴氫),7.92(d,1h,芳烴氫),7.24(t,1h,芳烴氫),7.04(broad,1h,-conh-),6.29(d,1h,芳烴氫),3.81(t,2h,-ch2-ch2n3),3.47(t,2h,-ch2n3),2.82(m,9h,醌-(ch3)3),1.95(s,2h,-ch2-conh-),1.38(s,6h,>c(ch3)2)，其核磁共振氫譜圖見圖3。

rp-hplc分析:10.7min(流動(dòng)相:meoh/h2ov/v7/3)。

esi-ms:m/zcalc.forc28h28n5o5:514.20[m+h]⁺；found:514.22，其電噴霧質(zhì)譜圖見圖4。

實(shí)施例4通過雙官能熒光分子b介導(dǎo)的anti-cea抗體和dox-pnb-n3或qnam-n3的熒光綴合物

二硫蘇糖醇(dtt,154mg,100μmol)溶解在磷酸緩沖液(pbs)中(10ml,ph8.0,50mm)，然后取10μl上述溶液(含0.1μmoldtt)添加到含有anti-cea抗體的(acea,1mg)pbs(1ml,ph8.0,50mm)溶液中去，在37℃攪拌30min，產(chǎn)物通過超濾純化(離心-0.5,微孔,截留分子量10kda)，使用之前要將其重新溶解到pbs中(2.0mg/ml,ph7.0,50mm)，利用5,5’-二巰基(2-硝基苯甲酸)(dntb)作為探針確定巰基含量，每個(gè)抗體分子中巰基數(shù)約為4。

10μl雙官能熒光分子b的dmso溶液(0.5μmolc1)，10μldox-pnb-n3(0.5μmol)或qnam-n3溶液(0.5μmol)和cuso4/na-抗壞血酸鹽(1/5摩爾比)添加到acea溶液中(0.2mg,in180μlpbs,ph7.0)，溫度保持在25℃，共軛合過程利用熒光原位監(jiān)測，共培養(yǎng)6h后，共軛物利用超濾進(jìn)一步純化(amiconultra-0.5,millipore,截留分子量10kda)，得到抗體-探針綴合物或抗體-藥物綴合物。

在反應(yīng)過程中，通過熒光發(fā)射強(qiáng)度監(jiān)控嵌段共聚物的綴合效率，結(jié)果見圖5和圖6，其中，圖5為制備抗體-探針綴合物反應(yīng)過程中的熒光變化過程曲線圖，圖6為制備抗體-藥物綴合物反應(yīng)過程中的熒光變化過程曲線圖。

圖7為實(shí)施例4制備的抗體-探針綴合物的酶檢測過程熒光變化過程；qnam-c1-acea抗體-探針綴合物用nadph/nqo1在水體系中培養(yǎng)，觀察到nam發(fā)射強(qiáng)度(～530nm)顯著的增加，并伴隨著c1在～435nm發(fā)射強(qiáng)度的大幅下降。在約1小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，觀察到約20倍fret比率(兩發(fā)射峰強(qiáng)度比值)的變化(見插圖)。上述結(jié)果表明，c1香豆素連接鍵和酶促產(chǎn)生的nam殘基之間的有效的fret過程的發(fā)生。在qnam-c1-acea偶聯(lián)體與nqo1作用后fret比率的突變(～20倍)，表明抗體-探針綴合物可用于檢測nqo1酶濃度。

圖8為實(shí)施例4制備的抗體-探針綴合物的細(xì)胞內(nèi)癌胚抗原與醌氧化還原酶檢測；上述qnam-c1-acea綴合物的特征促使進(jìn)一步探究基于細(xì)胞cea濃度和nqo1濃度/活性區(qū)分幾種癌細(xì)胞的可能性。將活的hepg2細(xì)胞(缺少cea，缺少nqo1)、ls180細(xì)胞(cea正常，缺少nqo1)和ht29細(xì)胞(cea正常，nqo1正常)與qnam-c1-acea抗體-探針綴合物共培養(yǎng)。共培養(yǎng)后，cea正常和noq1缺乏的ls180細(xì)胞共聚焦激光掃描顯微鏡(clsm)圖像顯示在細(xì)胞內(nèi)存在c1香豆素的間斷藍(lán)色發(fā)光點(diǎn)和極少的nam綠色發(fā)射信號(hào)。這些結(jié)果表明qnam-c1-acea能顯著的被細(xì)胞攝取和其具有胞內(nèi)穩(wěn)定性，這是由于胞質(zhì)中缺乏nqo1。對于存在cea和nqo1的結(jié)腸癌細(xì)胞(ht29)，綠色通道nam發(fā)射明顯增強(qiáng)，幾乎能與c1香豆素連接鍵的藍(lán)色通道發(fā)射共定位。注意后者的強(qiáng)度由于fret過程發(fā)生被顯著減小。然而，用qnam-c1-acea處理缺乏cea和nqo1的hepg2細(xì)胞顯示了非常低的藍(lán)色和綠色發(fā)射。由于nqo1酶主要位于特定類型癌細(xì)胞的胞質(zhì)中，以上結(jié)果表明，qnam-c1-acea偶聯(lián)體-探針只能以“and”邏輯門型方式顯示強(qiáng)烈的綠色通道發(fā)射(即需要cea和nqo1同時(shí)存在)。

圖9為實(shí)施例4制備的抗體-藥物綴合物的硝基還原酶觸發(fā)藥物釋放過程熒光變化過程；當(dāng)用硝基還原酶/還原型輔酶ⅱ共培養(yǎng)dox-c1-acea，偶聯(lián)的阿霉素藥物隨著時(shí)間線性持續(xù)釋放。阿霉素的釋放過程伴隨著c1連接鍵在435nm處發(fā)射的顯著增強(qiáng)和阿霉素在590nm處發(fā)射的明顯降低，這清楚地表明藥物-抗體偶聯(lián)體的斷裂和fret過程破壞。

實(shí)施例5胞內(nèi)細(xì)胞成像

ht29orhepg2細(xì)胞(～10⁵)培養(yǎng)液鋪展在35mm玻璃底培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜，然后dox-c1-acea與細(xì)胞在37℃共培養(yǎng)24h，細(xì)胞用pbs(3×1ml)和dmem培養(yǎng)液沖洗，細(xì)胞熒光成像需要在leicasp5共聚焦顯微鏡下進(jìn)行。樣品中含有的c1基團(tuán)激發(fā)在405nm，吖啶橙激發(fā)在488nm，dox激發(fā)在543nm。

圖10為實(shí)施例4制備的抗體-藥物綴合物的含癌胚抗原的細(xì)胞內(nèi)硝基還原酶觸發(fā)藥物釋放過程。當(dāng)用dox-c1-acea偶聯(lián)體與含有cea的ht29細(xì)胞在正常氧含量下培養(yǎng)時(shí)，共聚焦顯微鏡觀察到在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有間斷的強(qiáng)c1綠色發(fā)射，和阿霉素的紅色圓點(diǎn)發(fā)射，而且藍(lán)色/綠色發(fā)射能彼此共定位。與此相對的是，對于缺乏cea的hepg2細(xì)胞c1香豆素連接鍵的藍(lán)色熒光強(qiáng)度僅僅是ht29中的22％。若用dox-c1-acea在缺氧條件下與ht29共培養(yǎng)4小時(shí)，明顯的阿霉素紅色發(fā)射能與吖啶橙染色的細(xì)胞核很好的共定位。除此之外，非連續(xù)的c1-acea殘基的藍(lán)色發(fā)射只共定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。以上結(jié)果表示某些癌細(xì)胞(如ht29)表面的cea抗原有助于dox-c1-acea偶聯(lián)體的細(xì)胞攝取，并且在缺氧環(huán)境中胞內(nèi)很容易酶觸發(fā)阿霉素的釋放，這能聯(lián)系上固體瘤組織的微環(huán)境。

由上述實(shí)施例可知，藥物-抗體綴合物與探針-抗體綴合物可以通過連接分子c1構(gòu)建，并通過熒光的方法原位監(jiān)控綴合效率。

以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。