本發(fā)明涉及細(xì)胞示蹤技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種制備甘露糖偶聯(lián)近紅外量子點(diǎn)的方法。

背景技術(shù)：

免疫細(xì)胞示蹤標(biāo)記在生物醫(yī)學(xué)研究中非常有意義，甘露糖受體蛋白廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞，甘露糖偶聯(lián)的量子點(diǎn)是一種非常好的免疫細(xì)胞熒光標(biāo)記材料。

作為一種用于生物熒光標(biāo)記的納米粒子，量子點(diǎn)的光學(xué)穩(wěn)定性大大優(yōu)于有機(jī)熒光染料或熒光蛋白，在連續(xù)光激發(fā)下可以保持穩(wěn)定的發(fā)光亮度和高量子效率。量子點(diǎn)具有寬的吸收光譜及窄的熒光發(fā)射光譜，可以通過(guò)改變其尺寸或組成調(diào)節(jié)其發(fā)光光譜。單波長(zhǎng)可以同時(shí)激發(fā)具有不同發(fā)光譜帶的量子點(diǎn)，使得多路復(fù)用技術(shù)(multiplexing)成為可能。其生物穩(wěn)定性、生物相容性及其與生物體系的相互作用可以通過(guò)改變表面性質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)。這些特點(diǎn)使得量子點(diǎn)納米粒子在生物熒光標(biāo)記的應(yīng)用上具有有機(jī)熒光分子或熒光蛋白無(wú)法實(shí)現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)。有望在將來(lái)成為新一代的生物熒光標(biāo)記材料并用于包括細(xì)胞標(biāo)記及示蹤、蛋白質(zhì)印跡(westernblot)、流式細(xì)胞計(jì)、酶聯(lián)免疫吸附、基因芯片、分子成像等生物應(yīng)用。

目前全世界在制備量子點(diǎn)的方式上常見(jiàn)的有：

1.通過(guò)有機(jī)金屬合成。但含鎘的量子點(diǎn)具有較大的毒性，且使用該種方式合成得到的量子點(diǎn)具有疏水性，需要與水溶性分子的相互作用轉(zhuǎn)化為親水的納米粒子才能用于生物應(yīng)用。

2.糖修飾的量子點(diǎn)。其通常采用的方法是，功能化的糖分子通過(guò)螯合作用包覆于量子點(diǎn)表面，或生物素(biotin)偶聯(lián)的糖分子與鏈霉親和素(streptavdin)偶聯(lián)的量子點(diǎn)結(jié)合，或通過(guò)疏水相互作用的功能化。但這些方法得到的產(chǎn)物或者穩(wěn)定性差，或者步驟復(fù)雜，重復(fù)性差，不宜工業(yè)化。

因此，針對(duì)以上缺陷，需要對(duì)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)以上缺陷，本發(fā)明提供一種制備甘露糖偶聯(lián)近紅外量子點(diǎn)的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一步，制備酰亞胺功能化甘露糖。

首先，將2-溴代甘露糖乙酯及硫脲溶于無(wú)水丙酮，氬氣保護(hù)下加熱至丙酮回流，反應(yīng)20分鐘；冷卻反應(yīng)物至室溫得到白色結(jié)晶；過(guò)濾反應(yīng)液收集晶體，得到產(chǎn)物2-硫代異脲基甘露糖乙酯溴化氫。

其次，將2-硫代異脲基甘露糖乙酯溴化氫，氯乙氰溶于丙酮和水的混合溶液；在反應(yīng)液中加入碳酸鉀及亞硫酸鈉，室溫下反應(yīng)30分鐘后加入冰水，攪拌2小時(shí)；收集沉淀水洗；粗產(chǎn)物硅膠柱層析分離提純，得到產(chǎn)物2-硫代乙氰基甘露糖乙酯。

最后，將2-硫代乙氰基甘露糖乙酯溶于無(wú)水甲醇，向反應(yīng)液中加入甲醇鈉溶液，氬氣保護(hù)下室溫反應(yīng)20小時(shí)，得到酰亞胺功能化甘露糖。

第二步，制備胺基功能化近紅外量子點(diǎn)。

首先，制備疏水的氨基近紅外銅銦硒/硫化鋅量子點(diǎn)：

將氯化亞銅、氯化銦、硒脲、十八烯及三辛基膦的混合物超聲30分鐘，加入油胺及十二烷基硫醇，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)無(wú)水無(wú)氧操作后加熱至50-60攝氏度，攪拌10小時(shí)后得到無(wú)色透明的反應(yīng)液；

將反應(yīng)液冷卻至室溫后加熱至200攝氏度，可見(jiàn)反應(yīng)溶液的顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)辄S色，紅色最終為黑褐色，反應(yīng)溫度至200度后立即終止反應(yīng)并降溫；

向反應(yīng)混合物中加入甲醇/丙酮混合溶劑，沉降的納米粒子經(jīng)過(guò)高速離心分離后溶于無(wú)水氯仿中，用0.22微米的尼龍濾頭過(guò)濾；

銅銦硒量子點(diǎn)的氯仿溶液與十八烯、油胺置于反應(yīng)瓶中，真空條件下除去氯仿，得到疏水的氨基近紅外銅銦硒/硫化鋅量子點(diǎn)。

其次，制備二乙基黃原酸鋅反應(yīng)液：

將二乙基黃原酸鋅與油酸鋅溶于十八烯、三辛基膦及二辛基胺的混合溶液得到鋅溶液并分成兩部分，先將一部分的鋅溶液加入銅銦硒量子點(diǎn)溶液中加熱至190度，反應(yīng)后再將另一部分剩余的鋅溶液加入反應(yīng)溶液中繼續(xù)反應(yīng)；

將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，加入丙酮/甲醇（1/3體積比）沉降納米粒子。離心分離后的納米粒子溶于氯仿中并過(guò)濾，得到的溶液用于配體交換。

再次，合成多齒胺基聚合物配體：

使聚丙烯酸與cdi在有機(jī)溶劑存在下反應(yīng)，加入boc保護(hù)的氨基peg，再加入n,n-二甲基乙二胺和硫辛胺的氯仿溶液進(jìn)一步反應(yīng)，得到的產(chǎn)物用飽和氯化鈉水溶液洗三次后收集有機(jī)相，分離提純得到聚合物配體前體物，使所得聚合物配體前體物與1，3-丙環(huán)酰內(nèi)酯反應(yīng)，和分離提純得到多齒胺基聚合物配體。

最后，將疏水的氨基近紅外銅銦硒/硫化鋅量子點(diǎn)溶于氯仿溶液中，與多齒胺基聚合物配體的水溶液混合，混合物在45度劇烈攪拌半小時(shí)后冷卻靜置，在有機(jī)相中加入乙酸乙酯/正己烷混合溶劑沉淀量子點(diǎn)，干燥有機(jī)溶劑后加入1毫升去離子水溶解納米粒子過(guò)濾，通過(guò)分子量選擇濾膜離心分離提純，除去未反應(yīng)的配體及其他雜質(zhì)，得到親水的胺基功能化近紅外量子點(diǎn)。

第三步，酰亞胺功能化甘露糖與胺基功能化近紅外量子點(diǎn)的偶聯(lián)。

將胺基功能化近紅外量子點(diǎn)的硼酸緩沖溶液中加入酰亞胺功能化甘露糖的水溶液，混合均勻后室溫反應(yīng)20小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)離心透析分離提純后4度保存。

本發(fā)明所述的一種制備甘露糖偶聯(lián)近紅外量子點(diǎn)的方法的有益效果為：

1.能夠?qū)⒘孔狱c(diǎn)轉(zhuǎn)化為水溶、穩(wěn)定、低特異性的納米粒子，同時(shí)引入反應(yīng)官能團(tuán)利于進(jìn)一步的生物修飾，合成的銅-銦-硒近紅外量子點(diǎn)具有毒性小、發(fā)光亮度好、尺寸小、發(fā)光光譜可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，非常適于生物熒光標(biāo)記的應(yīng)用；

2.通過(guò)胺基修飾的量子點(diǎn)與酰亞胺功能化的甘露糖之間的反應(yīng)合成甘露糖功能化的熒光量子點(diǎn)，具有可控性好、產(chǎn)品穩(wěn)定性高、合成路線(xiàn)相對(duì)簡(jiǎn)易的特點(diǎn)；

3.該技術(shù)也可同樣適用于其他糖分子與納米粒子的偶聯(lián)。

下述實(shí)施例更詳盡地說(shuō)明了本發(fā)明。除非另有說(shuō)明，本說(shuō)明書(shū)及專(zhuān)利申請(qǐng)范圍中所記載的分?jǐn)?shù)或百分?jǐn)?shù)均按重量計(jì)。

附圖說(shuō)明

下面根據(jù)附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明：

圖1為量子點(diǎn)的透射電子顯微鏡分析結(jié)果；

圖2為紫外吸收和熒光發(fā)射光譜；

圖3為甘露醇偶聯(lián)量子點(diǎn)熒光標(biāo)記免疫細(xì)胞的共聚焦熒光顯微鏡圖片；

圖4為酰亞胺功能化甘露糖與胺基功能化近紅外量子點(diǎn)的偶聯(lián)反應(yīng)示意圖；

圖5是甘露醇偶聯(lián)近紅外量子點(diǎn)熒光標(biāo)記免疫細(xì)胞(raw254細(xì)胞)示意圖。

具體實(shí)施方式

第一步，制備酰亞胺功能化甘露糖。

首先，將2-溴代甘露糖乙酯（2克，4.8毫摩爾）及硫脲（0.37克，4.8毫摩爾）溶于無(wú)水丙酮（5毫升），氬氣保護(hù)下加熱至丙酮回流，反應(yīng)20分鐘；冷卻反應(yīng)物至室溫得到白色結(jié)晶；過(guò)濾反應(yīng)液收集晶體，得到產(chǎn)物2-硫代異脲基甘露糖乙酯溴化氫（1.332克，反應(yīng)收率：56%）。

其次，將2-硫代異脲基甘露糖乙酯溴化氫（1克，2毫摩爾），氯乙氰（1毫升，8毫摩爾）溶于丙酮（2.5毫升）和水（2.5毫升）的混合溶液；在反應(yīng)液中加入碳酸鉀（0.3克，2.2毫摩爾）及亞硫酸鈉（0.425克，4毫克），室溫下反應(yīng)30分鐘后加入冰水（2毫升），攪拌2小時(shí)；收集沉淀水洗；粗產(chǎn)物硅膠柱層析分離提純，得到產(chǎn)物2-硫代乙氰基甘露糖乙酯（0.78克，反應(yīng)收率：94%）。

觀(guān)察核磁共振氫譜：

(300mhz,cdcl3,ppm):δ5.46-5.45(d,1h),5.27-5.20(t,1h),5.11-5.06(d,1h),4.71-4.68(d,1h),4.20-4.08(m,2h),4.03-3.98(t,1h),3.66-3.60(d,1h),3.37-3.31(d,1h),2.16(s,3h),2.08(s,3h),2.05(s,3h),1.98(s,3h)。

最后，將2-硫代乙氰基甘露糖乙酯（0.3克，0.74毫摩爾）溶于無(wú)水甲醇（8毫升），向反應(yīng)液中加入0.1m的甲醇鈉溶液（1毫升），氬氣保護(hù)下室溫反應(yīng)20小時(shí)，得到酰亞胺功能化甘露糖，酰亞胺功能化甘露糖溶于水直接用于偶聯(lián)反應(yīng)。

第二步，制備胺基功能化近紅外量子點(diǎn)。

首先，制備疏水的氨基近紅外銅銦硒/硫化鋅量子點(diǎn)：

將氯化亞銅（10毫克），氯化銦（22毫克）以及25毫克的硒脲置于25毫升的三頸反應(yīng)瓶中，加入2.5毫升十八烯，1毫升三辛基膦；

混合物超聲30分鐘后加入1毫升油胺及0.5毫升十二烷基硫醇，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)無(wú)水無(wú)氧操作后加熱至50-60攝氏度，攪拌10小時(shí)后得到無(wú)色透明的反應(yīng)液；

將反應(yīng)液冷卻至室溫后加熱至200攝氏度，可見(jiàn)反應(yīng)溶液的顏色從無(wú)色逐漸變?yōu)辄S色，紅色最終為黑褐色，反應(yīng)溫度至200度后立即終止反應(yīng)并降溫；

向反應(yīng)混合物中加入甲醇/丙酮混合溶劑，沉降的納米粒子經(jīng)過(guò)高速離心分離（10，000rpm）后溶于無(wú)水氯仿中，用0.22微米的尼龍濾頭過(guò)濾；

銅銦硒量子點(diǎn)的氯仿溶液（5毫升）與2毫升十八烯，0.5毫升油胺置于反應(yīng)瓶中，真空條件下除去氯仿，得到疏水的氨基近紅外銅銦硒/硫化鋅量子點(diǎn)。

其次，制備二乙基黃原酸鋅反應(yīng)液：

將30毫克二乙基黃原酸鋅與250毫克油酸鋅溶于1毫升十八烯、1.5毫升三辛基膦及0.5毫升二辛基胺的混合溶液得到鋅溶液并分成兩部分；先將一部分的鋅溶液0.5毫升加入銅銦硒量子點(diǎn)溶液中并加熱至190攝氏度，反應(yīng)后再將另一部分剩余的鋅溶液緩慢滴加至反應(yīng)溶液中繼續(xù)反應(yīng)；

將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，加入丙酮/甲醇(1/3體積比)沉降納米粒子，離心分離后的納米粒子溶于10毫升氯仿中，用0.2微米的濾頭過(guò)濾，得到的溶液用于配體交換。

再次，合成多齒胺基聚合物配體：

將聚丙烯酸溶于無(wú)水四氫呋喃中，向該溶液加入cdi，室溫下反應(yīng)過(guò)夜；

在0-4度攪拌下向該溶液加入n,n-二甲基乙二胺及硫辛胺的氯仿溶液，反應(yīng)12小時(shí)；

得到的產(chǎn)物用飽和氯化鈉水溶液洗三次后收集有機(jī)相，干燥過(guò)濾后蒸干有機(jī)溶劑，得到的聚合物溶于四氫呋喃中經(jīng)體積排除色譜分離，除去小分子量雜質(zhì)；

提純后的聚合物配體前體物溶于無(wú)水氯仿中與1，3-丙環(huán)酰內(nèi)酯在65度反應(yīng)過(guò)夜，得到黃色聚合物沉淀；

過(guò)濾反應(yīng)液收集產(chǎn)物以氯仿洗去未反應(yīng)物；

產(chǎn)物干燥后溶于水及乙醇的混合溶液，加入硼氫化鈉反應(yīng)還原硫辛酸基團(tuán)，得到最終的聚合物配體，蒸去溶劑后溶于去離子水中得到無(wú)色透明溶液；

此時(shí)，合成的聚合物配體并不帶有氨基，若需合成帶氨基的多齒聚合物配體，區(qū)別是在將聚丙烯酸與cdi在有機(jī)溶劑（無(wú)水四氫呋喃）反應(yīng)的過(guò)程中，加入boc保護(hù)的氨基peg（摩爾比例10-25%），最終反應(yīng)結(jié)束后聚合物配體的水/乙醇溶液中加入1摩爾/升的鹽酸溶液室溫下反應(yīng)兩小時(shí)去保護(hù)，然后加入氫氧化鈉的溶液將反應(yīng)液中和至中性。

最后，將氨基近紅外銅銦硒/硫化鋅量子點(diǎn)（6納摩）溶于氯仿（3毫升）的溶液中，與多齒胺基聚合物配體（50毫克）的水溶液（1毫升）混合，混合物在45度劇烈攪拌半小時(shí)后冷卻靜置，在有機(jī)相中加入乙酸乙酯/正己烷混合溶劑沉淀量子點(diǎn)，干燥有機(jī)溶劑后加入1毫升去離子水溶解納米粒子，過(guò)濾（0.2微米濾頭），通過(guò)分子量選擇濾膜離心分離提純，除去未反應(yīng)的配體及其他雜質(zhì)，得到親水的胺基功能化近紅外量子點(diǎn)，4度條件下保存。

第三步，酰亞胺功能化甘露糖與胺基功能化近紅外量子點(diǎn)的偶聯(lián)。

將濃度為0.06微摩爾/毫升的胺基功能化近紅外量子點(diǎn)(6納摩)的硼酸緩沖溶液(200微升，ph8.6)中加入濃度為6微摩爾/毫升的酰亞胺功能化甘露糖的水溶液(274微克，0.6微摩爾，200微升)，二者重量比為1：1，混合均勻后室溫反應(yīng)20小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)離心(6000轉(zhuǎn)/分)透析的方法(mwcofilter,amicon,30kda)分離提純后4度保存。

上述對(duì)實(shí)施例的描述是為了便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠理解和應(yīng)用本案技術(shù)，熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可輕易對(duì)這些實(shí)例做出各種修改，并把在此說(shuō)明的一般原理應(yīng)用到其它實(shí)施例中而不必經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本案不限于以上實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本案的揭示，對(duì)于本案做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本案的保護(hù)范圍內(nèi)。