本發(fā)明涉及熒光材料領域，尤其涉及一種熒光造影材料及其制備方法與應用。

背景技術：

長久以來，與血管相關的疾病非常常見。以眼底血管為例，臨床上常見諸如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜血管炎、血管阻塞性疾病、脈絡膜血管瘤，急性視網(wǎng)膜壞死、以及各種病因的黃斑病等等。由于眼底血管在眼球內部，用普通的光學技術難以直接觀察病灶。利用眼底血管熒光造影技術，能夠對眼底部的整個血管脈絡組織進行精確成像，以幫助醫(yī)生對病人的病患做出正確的診斷。

現(xiàn)在國際上通用的眼底血管熒光造影術主要是熒光素染色法(fluoresceinfundusangiography，ffa法)。醫(yī)生從病人肘靜脈快速(約5秒)推入20％熒光素鈉水溶液約3ml，在短時間內用熒光檢測儀器對患者眼底血管進行熒光成像拍攝。然而，現(xiàn)有的熒光素染料有許多缺點：(1)熒光素對人體毒副作用大，超過4％病人出現(xiàn)惡心嘔吐反應，0.2％病人現(xiàn)嚴重疼痛癥狀，少數(shù)會有過敏性休克，因而必須進行皮試實驗。(2)熒光素在體內代謝速度比較慢，熒光素注射后出現(xiàn)皮膚、結膜發(fā)黃，尿液呈黃色，該染黃現(xiàn)象持續(xù)24-48小時，代謝主要經(jīng)腎臟及膽道，會造成輕度肝腎功能損傷，相關功能不全者禁用。(3)熒光素法成像時間短，靜脈注射后2分鐘至幾小時，脈絡膜毛細血管中的熒光素會發(fā)生嚴重滲漏，致使周圍組織與鞏膜著色。

因此，現(xiàn)有技術還有待于改進和發(fā)展。

技術實現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種熒光造影材料及其制備方法與應用，旨在解決現(xiàn)有熒光素染色法中，熒光素對人體毒副作用大、熒光素在體內代謝速度比較慢、熒光素法成像時間短的問題。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種熒光造影材料，其中，由類黃酮熒光染料與蛋白質結合而成。

所述的熒光造影材料，其中，所述類黃酮熒光染料的結構通式如下所示：

其中，r1、r2、r3、r4、r5、r6是不同的取代基，r1、r2、r3、r4為h、羥基、羥甲基或二甲胺基，r5和r6為甲基、乙基、丁基或羥丁基。

所述的熒光造影材料，其中，所述蛋白質為人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、轉運蛋白、酪蛋白、卵黃原蛋白、膠質蛋白、血清球蛋白、人血清離心樣本中的一種。

所述的熒光造影材料，其中，所述類黃酮熒光染料與蛋白質的重量比為1:10-1:100000。

一種如上任一所述的熒光造影材料的制備方法，其中，包括：

步驟a、將所述類黃酮熒光染料溶于第一溶劑中，配制成10^-6-10^-2摩爾/升的類黃酮熒光染料母液；

步驟b、將所述蛋白質溶于第二溶劑中，配制成0.01-1000毫克/毫升的蛋白質溶液母液；

步驟c、將1-100微升的所述類黃酮熒光染料母液滴加到1-100毫升的所述蛋白質溶液母液中，并在滴加過程中對所述蛋白質溶液母液施以震蕩或攪拌5-120分鐘，得到熒光造影材料。

所述的熒光造影材料的制備方法，其中，所述步驟a中，所述第一溶劑為甲醇、乙醇、dmso中的一種。

所述的熒光造影材料的制備方法，其中，所述步驟b中，所述第二溶劑為水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液、血清離心上清液中的一種。

所述的熒光造影材料的制備方法，其中，所述步驟a中，所述類黃酮熒光染料的制備方法包括：

步驟a1、將臨羥基苯乙酮和對氨基苯甲醛加入到乙醇中，然后冷卻，逐滴加入氫氧化鈉溶液，攪拌8-12h后，加入到冰水中，再用鹽酸中和，最后于冰箱中靜置過夜，過濾干燥，得到中間體查爾酮；

步驟a2、將所述中間體查爾酮溶于四氫呋喃中，然后加入乙醇，并逐滴加入氫氧化鉀溶液，然后冷卻，接著滴加雙氧水溶液，室溫攪拌40-60小時，再用鹽酸中和，最后過濾干燥并重結晶，獲得類黃酮熒光染料。

一種如上任一所述的熒光造影材料的應用，其中，應用于生物熒光成像。

所述的熒光造影材料的應用，其中，所述生物熒光成像為細胞樣本染色、組織染色、血管系統(tǒng)熒光造影中的一種。

有益效果：本發(fā)明提供了一種熒光造影材料，所述熒光造影材料由高熒光量子產率的類黃酮熒光染料與高生物相容性蛋白質內的疏水空腔結合而成，其具有低生物毒性、高熒光量子產率、高熒光穩(wěn)定性、高水溶性以及高生物相容性特點，可應用于細胞染色、組織標記、以及血管熒光成像。

附圖說明

圖1為實施例4中利用fl341-hsa配合物對人體干細胞的染色圖。

圖2為實施例5中利用fl341-hsa配合物對血管內皮組織的染色圖。

圖3為實施例6中利用fl341-hsa配合物對斑馬魚眼部外周血管第一視角的染色圖。

圖4為實施例6中利用fl341-hsa配合物對斑馬魚眼部外周血管第二視角的染色圖。

圖5為實施例6中利用fl341-hsa配合物對斑馬魚眼底血管第一視角的染色圖。

圖6為實施例6中利用fl341-hsa配合物對斑馬魚眼底血管第二視角的染色圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供一種熒光造影材料及其制備方法與應用，為使本發(fā)明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明提供一種熒光造影材料的較佳實施例，其中，由類黃酮熒光染料與蛋白質結合而成。具體地，本發(fā)明所述熒光造影材料是由高熒光量子產率的類黃酮熒光染料與高生物相容性蛋白質內的疏水空腔結合而成的，所述類黃酮熒光染料的結構通式如下所示：

其中，r1、r2、r3、r4、r5、r6是不同的取代基，r1、r2、r3、r4為h、羥基(-oh)、羥甲基(-och3)或二甲胺基(-n(ch3)2)，r5和r6為甲基(-ch3)、乙基(-ch2ch3)、丁基(-ch2ch2ch2ch3)或羥丁基(-ch2ch2ch2ch2oh)。

本發(fā)明利用高熒光量子產率的類黃酮熒光染料與高生物相容性蛋白質內疏水空腔結合，制備得到了具有低生物毒性、高熒光量子產率、高熒光穩(wěn)定性、高水溶性以及高生物相容性的熒光造影材料，所述熒光造影材料可應用于細胞染色、組織標記、以及血管熒光成像。

本發(fā)明還提供了一種如上任一所述的熒光造影材料的制備方法較佳實施例，其中，包括：

步驟a、將所述類黃酮熒光染料溶于第一溶劑中，配制成10^-6-10^-2摩爾/升的類黃酮熒光染料母液；

優(yōu)選地，所述第一溶劑可以為但不限于甲醇、乙醇、dmso等中的一種。

所述步驟a中，所述類黃酮熒光染料的制備方法包括：

步驟a1，制備中間體查爾酮：將50毫摩爾的含不同r1、r2、r3、r4取代基的臨羥基苯乙酮和50毫摩爾的含不同r5、r6取代基的對氨基苯甲醛加入到100-500毫升乙醇中，然后置于冰水浴中冷卻，逐滴加入10-100毫升的20％wt的氫氧化鈉溶液，攪拌8-12h(如10小時)后，倒入到100-1000毫升的冰水中，用濃度為3摩爾/升的稀鹽酸中和，中和完畢后，將反應液置于冰箱中靜置過夜，冰箱溫度設置在0-10℃之間，過夜時間為8-12小時，如10小時，將沉淀過濾干燥，即獲得中間體查爾酮，反應方程式如下：

優(yōu)選的，上述步驟a1中，乙醇用量為200毫升，氫氧化鈉溶液用量為50毫升，冰水用量為500毫升。

步驟a2，制備類黃酮熒光染料：取10毫摩爾的含不同r1、r2、r3、r4、r5、r6取代基的中間體查爾酮溶于10毫升四氫呋喃，然后加入10-100毫升的乙醇溶液，并逐滴加入5-50毫升的質量分數(shù)為20％的氫氧化鉀溶液，加入完成后將反應液用冰水浴冷卻，接著滴加5-30毫升30％wt的雙氧水溶液，室溫攪拌40-60小時(如48小時)，用濃度為1摩爾/升的稀鹽酸中和，將沉淀過濾干燥后，在劣溶劑中重結晶，獲得類黃酮熒光染料，反應方程式如下：

優(yōu)選的，上述步驟a2中，乙醇用量為50毫升，氫氧化鈉溶液用量為10毫升，雙氧水溶液用量為20毫升。

步驟b、將所述蛋白質溶于第二溶劑中，配制成0.01-1000毫克/毫升的蛋白質溶液母液；

優(yōu)選地，所述第二溶劑可以為但不限于水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液(ph＝7.4)、血清離心上清液等中的一種。

優(yōu)選地，所述蛋白質可以為但不限于人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、轉運蛋白、酪蛋白、卵黃原蛋白、膠質蛋白、血清球蛋白、人血清離心樣本等中的一種。

步驟c、將1-100微升的所述類黃酮熒光染料母液緩慢滴加到1-100毫升的所述蛋白質溶液母液中，并在滴加過程中對所述蛋白質溶液母液施以震蕩或攪拌，震蕩或攪拌的時間為5-120分鐘，得到熒光造影材料。

本發(fā)明還提供了一種如上任一所述熒光造影材料的應用，其中，將所述熒光造影材料應用于生物熒光成像，例如細胞染色、組織標記、以及血管熒光成像等。本發(fā)明所述熒光造影材料置于冰箱中保存，使用時將熒光造影材料緩慢加熱至37度。本發(fā)明方法制備的小分子染料-蛋白質配合物(即所述熒光造影材料)，可以對常見細胞樣本、血管壁組織、生物組織切片、脊椎魚類、以及哺乳動物的血管系統(tǒng)實施熒光造影，熒光造影的染色方式為滴加、涂抹、注射中的一種，詳細的配制流程與染色方式在實施例中闡述。

下面通過實施例對本發(fā)明進行詳細說明。

實施例1

類黃酮染料fl341(結構式如下)的制備步驟如下：

將50毫摩爾的1-乙?；?2-羥基-4,5-二羥甲基苯和50毫摩爾的對二甲氨基苯甲醛加入含200毫升乙醇的反應瓶中，將反應瓶放于冰水浴中冷卻，逐滴加入50毫升的20％wt的氫氧化鈉溶液，攪拌10小時后，倒入500毫升的冰水中，用濃度為3摩爾/升的稀鹽酸中和。中和完畢后，將反應液置于冰箱中靜置過夜，然后將得到的沉淀過濾干燥，即獲得查爾酮粗產物。取10毫摩爾的查爾酮粗產物溶于10毫升四氫呋喃，然后加入50毫升的乙醇溶液，并逐滴加入10毫升的質量分數(shù)為20％的氫氧化鉀溶液，加入完成后將反應液用冰水浴冷卻，接著滴加20毫升30％wt的雙氧水溶液，室溫攪拌48小時，用濃度為1摩爾/升的稀鹽酸中和，將得到的沉淀過濾干燥后，在冰乙醇-正乙烷中重結晶，獲得類黃酮熒光染料fl341，其結構式如下所示。

實施例2

類黃酮染料fl339的制備步驟如下：

將50毫摩爾的1-乙?；?2-羥基-6-羥甲基苯和50毫摩爾的對二乙氨基苯甲醛加入到含250毫升乙醇的反應瓶中，將反應瓶放于冰水浴中冷卻，逐滴加入40毫升的20％wt的氫氧化鈉溶液，攪拌12小時后，倒入400毫升的冰水中，用濃度為3摩爾/升的稀鹽酸中和。中和完畢后，將反應液置于冰箱中靜置過夜，將沉淀過濾干燥，即獲得查爾酮粗產物。取10毫摩爾的查爾酮粗產物溶于10毫升四氫呋喃，然后加入40毫升的乙醇溶液，并逐滴加入15毫升的質量分數(shù)為20％的氫氧化鉀溶液，加入完成后將反應液用冰水浴冷卻，接著滴加20毫升30％wt的雙氧水溶液，室溫攪拌48小時，用濃度為1摩爾/升的稀鹽酸中和，將沉淀過濾干燥后，在冰乙醇中重結晶，獲得類黃酮熒光染料fl339，其結構式如下所示。

實施例3

fl341-hsa配合物熒光造影材料的制備步驟如下：

將3.41毫克類黃酮染料fl341溶于10毫升乙醇，均勻攪拌至完全溶解，配制成10^-3摩爾/升的fl341類黃酮熒光染料母液；將100毫克人血清白蛋白(hsa)溶于10毫升磷酸鹽緩沖溶液(ph＝7.4)中，加熱37攝氏度，均勻攪拌至完全溶解，配制得10毫克/毫升的hsa蛋白質溶液母液；將100微升的fl341類黃酮熒光染料母液緩慢滴入至10毫升的hsa蛋白質溶液母液中，均勻攪拌為20分鐘，直至溶液至較透明，制備得fl341-hsa配合物熒光造影材料。

實施例4

利用fl341-hsa配合物進行細胞染色。

將100微升的fl341-hsa配合物熒光造影材料溶液滴入1ml人體干細胞培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15分鐘后，用pbs水溶液清洗細胞3次。如圖1所示，由熒光顯微鏡可以觀察到，人體干細胞被熒光染料成功染色。

實施例5

利用fl341-hsa配合物進行組織染色。

將培養(yǎng)好的血管內皮組織，用pbs緩沖溶液清洗3次，然后置于培養(yǎng)皿中，將200微升的fl341-hsa配合物熒光造影材料溶液滴入培養(yǎng)皿，培養(yǎng)20分鐘后，再用pbs水溶液清洗細胞3次。如圖2所示，由熒光顯微鏡可以觀察到，血管內皮組織被熒光染料成功染色。

實施例6

利用fl341-hsa配合物對斑馬魚眼底血管進行熒光成像。

將3dpf的斑馬魚用agarose水凝膠側位固定于培養(yǎng)皿上，利用微注射技術，將20微升的fl341-hsa配合物熒光造影材料溶液注射入斑馬魚卵黃囊的血管區(qū)，注射速率小于10微升/分鐘，注射完成后，將載有斑馬魚培養(yǎng)皿置于28攝氏度的恒溫水中，直至水凝膠完全溶解。等待約10分鐘后，將斑馬魚取出，對斑馬魚眼底血管實施激光共聚焦熒光成像。如圖3-6所示，斑馬魚眼外環(huán)血管以及眼底血管，皆呈現(xiàn)明亮的熒光，而其他組織的熒光強度非常弱，證明該配合物能夠選擇性的對血管系統(tǒng)染色。

綜上所述，本發(fā)明提供的一種熒光造影材料及其制備方法與應用，所述熒光造影材料是小分子染料和高生物相容性蛋白質構成的配合物，其中小分子染料為高熒光量子產率的類黃酮熒光染料，其與高生物相容性蛋白質內的疏水空腔結合；本發(fā)明利用類黃酮熒光染料的低生物毒性，解決了現(xiàn)有的熒光素染色法對人體產生較嚴重副作用的問題，同時利用類黃酮熒光染料的高熒光量子產率、高熒光穩(wěn)定性和高生物相容性蛋白質的高水溶性、高生物相容性，使得本發(fā)明的熒光造影材料能夠很好地應用于臨床。

應當理解的是，本發(fā)明的應用不限于上述的舉例，對本領域普通技術人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權利要求的保護范圍。