專利名稱：利用解鏈特征圖譜檢測多重?zé)晒鈖cr產(chǎn)物的方法及產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，涉及一種利用解鏈特征圖譜檢測多重?zé)晒釶CR產(chǎn) 物的方法及其產(chǎn)品，該方法可以在一個熒光定量PCR反應(yīng)中同時檢測多個熒光PCR擴(kuò) 增的基因產(chǎn)物。更具體的說，該方法利用不同目的基因片段在解鏈過程中生成的不同的 解鏈特征圖譜，運(yùn)用熒光定量PCR方法，針對多個基因同時進(jìn)行檢測。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)發(fā)明至今已近20年了，在這 期間技術(shù)得到了不斷的發(fā)展，近年來出現(xiàn)的實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR) 技術(shù)實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn) 確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具。
所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信 號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 在實時熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用(l)在卯 年代早期，TaqDNA多聚酶的5'核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針， 因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。(2)此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使在一密閉的 反應(yīng)管中能實時地監(jiān)測反應(yīng)全過程。這兩個發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化 發(fā)展導(dǎo)致real-time Q-PCR方法在研究工作中的運(yùn)用。
目前實時熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)方法主要有五種，分別是DNA結(jié)合染 色，水解探針，分子信標(biāo)，熒光標(biāo)記引物，雜交探針。它們又可分為擴(kuò)增序列特異和非 特異的檢測兩大類。
熒光定量PCR技術(shù)融合了 PCR和DNA探針雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，直接探測PCR過程 中熒光信號的變化，使PCR的擴(kuò)增及其分析在同一封閉的系統(tǒng)下完成，具有特異性好、 靈敏度高(是常規(guī)PCR的100倍以上)、假陽性低、操作簡單、交叉污染機(jī)會少、不污 染環(huán)境(不需要使用EB)等優(yōu)點(diǎn)，因此其應(yīng)用范圍很廣泛，包括mRNA表達(dá)的研究、 DNA拷貝數(shù)的檢測、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的測定等。目前研究的熱點(diǎn)有
1.1微小殘留病變的檢測 腫瘤疾病尤其是血液的惡性腫瘤常伴有特異性基因的易位，這種易位往往可以作為監(jiān)測臨床治療效果的一種腫瘤標(biāo)志。雖然在過去的幾十年 里治療方案的改進(jìn)已大大地延長了病人的生存期，但是緩解期的病人仍存在復(fù)發(fā)的危險 性。因此微小殘留病變(MRD)的檢測對于進(jìn)一步調(diào)整治療方案是至關(guān)重要的。熒光定 量PCR的應(yīng)用正成為檢測腫瘤微小殘留分子標(biāo)志的一種必備的研究工具。通過對腫瘤融 合基因的定量測定能指導(dǎo)臨床對病人實行個體化的治療。急性粒細(xì)胞性白血病(AML) 最常見的染色體異常是交互易位t(8; 21)(q22; q22)，在這易位中，AML-1轉(zhuǎn)錄因子基因 和8號染色體的MTG8基因發(fā)生融合，致使正常的AML-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控受到影響，這可能是 白血病的病因。目前的研究證明用熒光定量PCR來檢測融合基因有助于對這些病人的 MRD進(jìn)行定量，其作為預(yù)后的指標(biāo)或?qū)χ委煼桨傅脑u估是有價值的。同樣的方法也被用 于定量其它的易位融合基因水平，如慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)的BCR-ABL融合基 因；急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)的白血病特異的TEL-AML1融合基因；濾泡狀淋巴 瘤(FL)的染色體易位t(14;18)(q32;q21)和bcl-2重排等。許多研究都在很大程度上受益 于熒光定量PCR方法的應(yīng)用，隨著技術(shù)的發(fā)展，熒光定量PCR的運(yùn)用將不斷地擴(kuò)大。
1.2細(xì)胞因子的表達(dá)分析 細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)蛋白，它通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)(包括淋巴 細(xì)胞活化、增殖、分化、生存和凋亡)在免疫系統(tǒng)中起著核心作用。許多不同類型的細(xì) 胞都能分泌這種低分子量的蛋白質(zhì)，其中包括淋巴細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi) 皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。細(xì)胞因子可被分為不同的組；白介素(IL-l IL-23)，干擾素(IFN-a， IFNl等)，集落刺激因子(CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)，腫瘤生長因子(TGF-(3等) 和化學(xué)因子(MCP-1， MIP-1等)。為了闡明在許多炎癥反應(yīng)，自身免疫性疾病和器官 移植排異中的免疫致病途徑，細(xì)胞因子mRNA表達(dá)譜的可靠定量是很重要的。盡管被檢 樣本中細(xì)胞因子含量往往極低，然而real-time反轉(zhuǎn)靈PCR(RT-PCR)以其高敏感性和準(zhǔn) 確性在細(xì)胞因子的定量中越來越受到青睞。
1.3腫瘤耐藥基因表達(dá)的研究 對化療藥物的耐藥是治療腫瘤病人的主要障礙。由 于耐藥限制了許多腫瘤的成功治療，因此研究腫瘤細(xì)胞對耐藥機(jī)制就變得十分重要。目 前研究中發(fā)現(xiàn)主要的耐藥機(jī)制有ATP結(jié)合盒基因超家族(ATP-binding cassette superfamily)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的耐藥，這些蛋白包括MDR-1基因編碼的P-糖蛋白
(P-gp)，多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)，肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)，乳腺癌耐藥蛋白(BCRP) 等；酶介導(dǎo)的耐藥，包括拓?fù)鋵?dǎo)構(gòu)酶(Topo)，谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶
(GST)，蛋白激酶C (PKC)，脫氧胞嘧啶核苷激酶(deoxycytidine kinase)等，凋亡基因介導(dǎo)的耐藥，如bcl-2家族，p53基因，c-myc等。多藥耐藥(MDR)是多因素，多 種機(jī)制共同作用的結(jié)果。real-time反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)是了解腫瘤耐藥，指導(dǎo)臨床治 療策略的有用手段，它能觀測用藥前后及復(fù)發(fā)時腫瘤細(xì)胞的耐藥基因mRNA表達(dá)變化， 從而及時調(diào)整治療方案和評價疾病的預(yù)后。
1.4病毒感染的定量監(jiān)測 擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展使得對病毒的定性或定量檢測的能力 隨之提高，也使研究病毒的負(fù)荷和疾病進(jìn)展的關(guān)系成為可能。熒光定量PCR是主要被運(yùn) 用于科研和診斷領(lǐng)域的擴(kuò)增技術(shù)，它不僅能對病毒定性，而且由于其實驗的批間和批內(nèi) 差異小，重復(fù)性好，因此能方便、快速、靈敏、準(zhǔn)確地定量病毒DNA或RNA的序列， 更重要的是從中可以動態(tài)地研究在整個病程中潛在病毒的復(fù)活或持續(xù)，從而使臨床醫(yī)生 和病毒學(xué)家能檢測臨床的變化，如抗病毒治療的效果，耐藥變異的出現(xiàn)等。目前運(yùn)用較 多的是在器官移值中對使用免疫抑制劑的病人用Real-time Q-PCR來定量測定CMV感 染。研究表明在骨髓移植的病人中用熒光定量PCR檢測CMV感染比傳統(tǒng)的pp65抗原試 驗更敏感，抗CMV藥物治療能使血中的病毒含量下降，熒光定量PCR對于快速定量骨 移植病人的CMV感染和監(jiān)測CMV復(fù)活是一個有用的工具。
1.5基因表達(dá)研究 由于TaqMan系統(tǒng)及熒光探針的應(yīng)用，對mRNA的檢測顯得較 以前常用的方法如Northern印跡、RT-PCR定量法要方便、快速、準(zhǔn)確得多。為了探測 骨髓基質(zhì)血小板生成因子(TPO)在巨核細(xì)胞生成過程中的作用以及血小板生成因子在 特發(fā)性血小板減少性紫瘢(ITP)、再生障礙性貧血(AA)和特發(fā)性血小板多癥(ET) 等疾病過程中的病理生理意義，日本Hirayama等用TaqMan EZ RT-PCR試劑盒在 ABI7700反應(yīng)系統(tǒng)測定了正常人和ITP、 AA、 ET病人的骨髓基質(zhì)細(xì)胞TPO mRNA水平， 又用ELISA方法測定了骨髓和末梢血的TPO濃度。結(jié)果顯示ITP和AA病人TPO mRNA 水平明顯升高，而ET病人的TPO mRNA水平則正常，經(jīng)類固醇治療后ITP病人TPO mRNA水平下降；骨髓TPO的濃度與其mRNA水平有相關(guān)性；在正常人和ITP病人， TPO mRNA表達(dá)水平與巨核細(xì)胞計數(shù)也有相關(guān)性。這個實驗對闡明TPO的作用提供了 依據(jù)。日本Shimokawa等也用FQ-PCR技術(shù)對鼠成肌細(xì)胞系C2C12中肌肉調(diào)節(jié)因子的表 達(dá)水平及動態(tài)變化進(jìn)行了研究。
1.6免疫組份分析對免疫T細(xì)胞群體V-p組份進(jìn)行分析是研究健康和疾病免疫應(yīng) 答反應(yīng)的重要手段，可通過流式細(xì)胞法或RFQ-PCR法來進(jìn)行。流式細(xì)胞法是通過對細(xì)胞 群體進(jìn)行直接而方便的V-p表達(dá)方面的研究，但需要一整套單克隆抗體和大量細(xì)胞來進(jìn)行染色分析，而且人類v-p特異性抗體尚不完備，因此該方法有許多不便之處。如果用 FQ-PCR方法，即不需要大量細(xì)胞，引物設(shè)計也很方便，而且已有多種定量方法，包括錨 式PCR法、半定量PCR法、競爭性PCR法等，但都因PCR產(chǎn)物的后處理過程需凝膠電 泳、EB染色和光密度測量等既費(fèi)時，又降低了準(zhǔn)確性，還增加了污染機(jī)會，使得FQ-PCR 的應(yīng)用受到限制。1997年Lang等用FQ-PCR技術(shù)進(jìn)行實驗，從而避免了這些問題，他們 在反應(yīng)系統(tǒng)中引入熒光探針，將下游引物與探針固定，然后，針對不同的v-p成份，選 用特異的上游引物進(jìn)行擴(kuò)增，再對反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光信號進(jìn)行處理，即可獲得各個成份 的數(shù)據(jù)。
1.7基因突變及多態(tài)性的研究 美國Ibrahim等1997用FQ-PCR技術(shù)對正常痘病毒 多態(tài)性進(jìn)行了研究。他們采用一對可與正常痘病毒血凝素基因的某一 DNA片段結(jié)合的引 物，并設(shè)計兩個有單核苷酸差異的寡核苷酸探針，用熒光標(biāo)記后進(jìn)行實驗，順利地把有 此單核苷酸差異的兩個痘病毒株進(jìn)行鑒定。該技術(shù)也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的單核
苷酸變異多態(tài)的研究。
1.8其他方面 日本Isono利用FQ-PCR進(jìn)行葉綠體成熟度與其基因組拷貝數(shù)關(guān)系 的研究。他們以核基因Cab作為內(nèi)參照，進(jìn)行葉綠體基因rbcl拷貝數(shù)測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子 葉出現(xiàn)以后，葉綠體基因拷貝數(shù)顯著增加，進(jìn)而把葉綠體的基因拷貝數(shù)增加與光誘導(dǎo)的 葉綠體成熟過程聯(lián)系起來。1998年美國ffiggins等還建立起一套用熒光探針檢測鼠疫纖 溶酶原激活基因(pla)的實驗方法。
但是，在熒光定量PCR技術(shù)中，無論是相對定量還是標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方法仍存在一些 PCR定量方法均有的問題有待解決。在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量中，標(biāo)準(zhǔn)品的制備是一個必不可少 的過程。目前由于無一統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各個實驗室所用的生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品各不相同，致 使實驗結(jié)果缺乏可比性。此外，用熒光定量PCR來研究mRNA時，受到不同RNA樣本 存在不同的逆轉(zhuǎn)錄(RT)效率的限制。在相對定量中，其前提是假設(shè)內(nèi)源控制物不受實 驗條件的影響的，合理地選擇合適的不受實驗條件影響的內(nèi)源控制物也是實驗結(jié)果可靠 與否的關(guān)鍵。另外，與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，熒光定量PCR的不足之處是(1)由于 運(yùn)用了封閉的檢測，減少了擴(kuò)增后電泳的檢測步驟，因此也就不能監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的大小； (2)需要用不同的熒光素來標(biāo)記不同的探針，而Real-timePCR中熒光的發(fā)射光譜是很 難實現(xiàn)對不同熒光探針的區(qū)分，因此相對地限制了熒光定量PCR的對多個基因檢測的應(yīng) 用能力；(3)目前熒光定量PCR實驗成本比較高，從而也限制了其廣泛的應(yīng)用。針對熒光定量PCR的優(yōu)缺點(diǎn)，近年來又發(fā)展了多重?zé)晒釶CR技術(shù)。多重?zé)晒釶CR 是在同一反應(yīng)體系中加入多個引物對和探針，同時檢測多個目的基因的方法，該方法可 以方便的進(jìn)行一管多檢，從而達(dá)到省時省力的目的。但是，多重?zé)晒釶CR技術(shù)仍然需要 引入探針，并且需要雜交過程，存在檢測成本高、操作繁瑣、檢測基因數(shù)目有限的缺點(diǎn)， 已經(jīng)不能適應(yīng)針對同一待檢樣品中同時檢測多個目的基因的需求。
因此，目前需要一種能結(jié)合多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，同時又不需要探針的快 速PCR檢測法，以適應(yīng)目前分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域的多基因的快速鑒定的需要。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，基于目前的熒光定量PCR分析多基因領(lǐng)域的迫切要求， 發(fā)明人根據(jù)在熒光定量PCR的引物擴(kuò)增目的基因過程中所產(chǎn)生的解鏈特征圖譜(strands dissociation characteristic spectrum, SDCS或dissociation characteristic spectrum, DCS), 與 陽性對照基因的解鏈特征圖譜進(jìn)行對比，以得出在單一體系中同時檢測多個基因而不需 要探針的技術(shù)。
因此，本發(fā)明的第一個目的是提供一種利用解鏈特征圖譜以檢測多重?zé)晒舛縋CR 產(chǎn)物的試劑盒，其中包括待測基因模板，陽性對照基因，目的基因N的引物對，能結(jié) 合DNA雙鏈而不結(jié)合單鏈的熒光染料、PCR反應(yīng)緩沖液，其中反應(yīng)緩沖液含有MgCh、 dNTPs、DNA擴(kuò)增聚合酶，引物濃度范圍為50-5000nM，目的基因N為2-10個目的基因， 優(yōu)選2-7個，更優(yōu)選3-5個。
在一個實施方案中，所述的熒光染料是能結(jié)合DNA雙鏈而不結(jié)合單鏈的熒光染料， 優(yōu)選是Beyond Green I熒光染料。
在另一個實施方案中，如果需要，還包含用于擴(kuò)增內(nèi)參基因(即內(nèi)源性的參照基因) 的引物。其中，內(nèi)參基因優(yōu)選微管蛋白基因、肌動蛋白基因、糖酵解酶系基因或核糖體 蛋白基因。
在一個具體實施方案中，所述的待測基因模板可以是來自同一基因組的模板，也可
以是來自多個基因組的模板，優(yōu)選來自2-3個基因組的模板。
在另一個具體實施方案中，如果需要，所述的試劑盒還包含產(chǎn)品說明書。 在另一個具體實施方案中，如果涉及cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物，則反應(yīng)緩沖液含有MgCh、
dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶。本發(fā)明的第二個目的是提供一種利用上述試劑盒，通過解鏈特征圖譜檢測熒光定量 PCR反應(yīng)產(chǎn)物的方法，包括
(1) 根據(jù)待測的多個目的基因序列分別設(shè)計多對引物；
(2) 配制包含雙鏈DNA特異性的熒光染料的多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增的反應(yīng)體系；
(3) 在反應(yīng)體系中，用步驟(l)的多對引物同時分別擴(kuò)增多個目的基因，擴(kuò)增同時設(shè)立 陽性對照；
(4) 記錄待測樣本和陽性對照熒光定量PCR的解鏈特征圖譜，并通過相互比較以判 斷待測樣本中的目的基因；
其中，所述的解鏈特征圖譜是PCR反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液從6(TC緩慢升溫至100°C， 升溫速率為0.2 °C/s ,每升高0.2 'C連續(xù)記錄熒光值的變化，最終將溫度的變化與熒光 值的變化求負(fù)倒數(shù)(-dF/dT)后對溫度作圖，可得到擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈特征圖譜，其中所述的 熒光值表示每50%量的DNA雙鏈發(fā)生解鏈后所測定的熒光讀數(shù)值；和
其中判定標(biāo)準(zhǔn)為將待測基因的解鏈特征圖譜與陽性樣本的解鏈特征圖譜作比較， 根據(jù)特征峰判定待測基因是否是陽性樣本所對應(yīng)的目的基因產(chǎn)物。
在一個方案中，其中所述的熒光值表示每50%量的DNA雙鏈發(fā)生解鏈后所測定的熒 光讀數(shù)值；所述的判斷標(biāo)準(zhǔn)為檢測陽性對照樣本，調(diào)整每組引物(目的基因和/或內(nèi)參 基因的引物)在多重PCR反應(yīng)中的濃度，使每個待測基因在熒光定量PCR反應(yīng)的解鏈 特征圖譜中的峰高與內(nèi)參的峰高基本一致，以該引物濃度進(jìn)行待測樣品的多重?zé)晒饨德?PCR擴(kuò)增，將所得的解鏈特征圖譜與陽性樣本的解鏈特征圖譜作比較，出現(xiàn)了哪個特征 峰就判定為存在陽性樣本所對應(yīng)的目的基因產(chǎn)物。
在一個具體實施方案中，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件優(yōu)選是95'C預(yù)變性5min，然后95'C， 30s; 64°C， 30s; 68°C， 30s， 35個循環(huán)。
在另一個具體實施方案中，所述的染料是能結(jié)合DNA雙鏈而不結(jié)合單鏈的熒光染 料，優(yōu)選是l x Beyond Green I (1: IO，OOO)(購自毅新興業(yè)(北京)科技有限公司，產(chǎn)品 目錄號BY-FG-01)。
在另一個具體實施方案中，該熒光的激發(fā)光源優(yōu)選為96個綠色發(fā)光二極管(LED)， 激發(fā)范圍是470-505nm，熒光檢測器采用光電倍增管(PMT)，靈敏度極高。
在另一個具體實施方案中，多重?zé)晒饨德銹CR擴(kuò)增基因序列的反應(yīng)體系為 待測物 模板 0.5^1正向引物 IN 反向引物
正向引物 1^1 反向引物
正向引物 1^1 反向引物
反應(yīng)緩沖液 11.25pl 水 補(bǔ)足至25或50^1
其中，弓l物濃度范圍為50-5000nM，目的基因N為2-10個目的基因，優(yōu)選2-7個， 更優(yōu)選3-5個。其中當(dāng)N》3時，反應(yīng)體系為50nl (甚至10(HU)。
在另一個具體實施方案中，所述的目的基因選自轉(zhuǎn)基因生物(GMO)中的基因(如經(jīng) 濟(jì)作物中的轉(zhuǎn)基因、食品中的轉(zhuǎn)基因)、經(jīng)濟(jì)作物或食品中的多致病菌基因、細(xì)胞因子 基因、表達(dá)的mRNA、抗藥或耐藥基因、多SNP、疾病或病毒的多個特征基因等等。其 中，目的基因可以是來自同一基因組，也可以來自不同的基因組。
還在一個具體實施方案中，所述的目的基因是大鼠視網(wǎng)膜組織中SAP97和 alpha-CaMKII基因，所述的內(nèi)參基因是大鼠P-actin基因，所述的引物分別是SAP97-F/R、 CaMKII-F/R: GGACGGGTTGATGGTCAGCAT、 Rat actin beta-F/R。
還在另一個具體實施方案中，所述的目的基因是玉米Maximizer 176中的外源基因 crylA(b)( 75bp)、玉米BTll中的外源基因crylA(b)(75bp)、玉米MON810中的外源基因 P-35S和hsp70 intron的聯(lián)合片段(280bp)，所述的引物分別是玉米Maximizer 176-F/R、玉 米BtllF/R、玉米MON810-F/R。
目的基因l 目的基因2 目的基因N
定義
術(shù)語"熒光值"表示每50%的DNA雙鏈發(fā)生解鏈后所測定的熒光讀數(shù)值，該熒光優(yōu)選 的激發(fā)光源為96個綠色發(fā)光二極管(LED)，激發(fā)范圍是470-505nm,熒光檢測器采用 光電倍增管(PMT)，靈敏度極高。
術(shù)語"解鏈特征圖譜，，(strands dissociation characteristic spectrum, SDCS或dissociation characteristic spectrum, DCS),表示當(dāng)每升高0.2 。C記錄熒光值，最終將溫度的變化與熒光 值的變化求負(fù)倒數(shù)后對溫度作圖。由于不同目的基因具有特征性解鏈熒光值溫度，因此只要這些溫度之間具有一定溫度差(例如大于3-30°C，優(yōu)選大于3-l(TC，更優(yōu)選3-5'C)， 就能得到該目的基因的特征峰值。將多個目的基因同時進(jìn)行檢測，則得到區(qū)分度或置信 度好的峰值圖。
術(shù)語"熒光染料"是一種非特異性的結(jié)合于雙鏈DNA小溝的染料，最大吸收波長約為 497nm，最大發(fā)射波長約為520nm。該熒光染料，與雜交探針比較，不需要設(shè)計特定的 序列，其檢測原理是熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。在PCR反 應(yīng)體系中加入過量熒光染料，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不 摻入鏈中的染料分子熒光信號極弱，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同 步。因此，本發(fā)明可使用已有的熒光染料，例如1 x Beyond Green I ( 1: 10,000)(毅 新興業(yè)(北京)科技有限公司，產(chǎn)品目錄號BY-FG-01)。
術(shù)語"內(nèi)參基因"，又名內(nèi)源性的參照基因，其和引物的作用在于檢測多個目的基 因(N為2-10，優(yōu)選3-5)時，通過內(nèi)參基因及其引物消除體系中的背景或噪音，以確定 目的基因的引物具體濃度。 一旦已經(jīng)確定了待測基因數(shù)目和引物的合適濃度后，反應(yīng)體 系中可不包括內(nèi)參基因的引物。 一般而言，內(nèi)參基因選自與目的基因具有相同基因組來 源的持家基因(house-keepinggene)，由于內(nèi)參基因與目的基因都來自同一總基因組，因此 目的基因的擴(kuò)增模板也是內(nèi)參基因的模板。另外，如果內(nèi)參基因與目的基因分屬于不同 的基因組，但因為內(nèi)參基因?qū)儆谒屑?xì)胞中均要表達(dá)的一類基因，其產(chǎn)物是對維持細(xì)胞 基本生命活動所必需的基因(如微管蛋白基因、肌動蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖 體蛋白基因等)，因此，來自不同基因組的目的基因的擴(kuò)增模板，同樣也可作為內(nèi)參基 因的模板。通過將內(nèi)參基因與目的基因同時進(jìn)行平行擴(kuò)增，以消除反應(yīng)的抑制劑和確保 樣品中靶基因的成功擴(kuò)增；另外，在定量分析中，內(nèi)參基因也可用來估計樣品中耙基因 的總量，因此其作用在于確定體系中的引物濃度、估計靶基因總量、優(yōu)化反應(yīng)條件。
有益效果
與傳統(tǒng)的多重?zé)晒舛縋CR相比，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于同時檢測多個基因過程中無 需設(shè)計多個探針，通過利用不同目的基因片段的序列不同因而其擴(kuò)增的解鏈特征圖譜不 同這個特性，通過比較待測樣本與陽性標(biāo)本的解鏈特征圖譜來判斷待測基因的有無。本 發(fā)明具有操作簡便、重復(fù)性高、交叉污染少等優(yōu)點(diǎn)。
相比于傳統(tǒng)的方法，本發(fā)明具有成本低(無需合成多個探針)、耗時短(可在一次反應(yīng)中檢測2-10個基因)、結(jié)果分析簡單便捷(只需對照陽性樣本的解鏈特征圖譜即可 判斷目的基因的有無)、應(yīng)用領(lǐng)域極其廣泛的優(yōu)點(diǎn)。
因此，本發(fā)明可檢測轉(zhuǎn)基因生物(GMO)中的基因(轉(zhuǎn)入經(jīng)濟(jì)作物中或轉(zhuǎn)基因食品中 的篩選基因、標(biāo)記基因)、經(jīng)濟(jì)作物或食品中的多致病菌基因、細(xì)胞因子基因、表達(dá)的 mRNA、抗藥或耐藥基因、多SNP、疾病或病毒的多個特征基因等等。相比于傳統(tǒng)的方 法，具有成本低(無需合成多個探針)、耗時短(可在一次反應(yīng)中檢測2-10個基因)、 結(jié)果分析簡單便捷(只需對照陽性樣本的解鏈特征圖譜即可判斷目的基因的有無)、應(yīng) 用領(lǐng)域極其廣泛的優(yōu)點(diǎn)。今后必將在疾病檢測和各種病原檢測中得到更加廣泛的應(yīng)用。


圖1-5:檢測大鼠視網(wǎng)膜組織中SAP97和alpha-CaMKII基因的解鏈特征圖譜，其中X軸 表示解鏈溫度，Y軸表示熒光值，特征峰值表示對應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度。 圖6:用于驗證多重?zé)晒釶CR的解鏈特征圖譜的凝膠電泳結(jié)果，其中泳道1-5為Yl-Y5 反應(yīng)體系，泳道M (Marker)為分辯率為lOObp的分子量標(biāo)記(自上向下依次是600bp、 500bp、 400bp、 300bp、 200bp、 100bp)。
圖7:檢測轉(zhuǎn)基因玉米Maximizer176、 BTll、 MON810中外源基因或標(biāo)記基因的解鏈特 征圖譜，其中X軸表示解鏈溫度，Y軸表示熒光值，特征峰值表示對應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈 溫度。
具體實施例方式
現(xiàn)在僅用參考下面非限制性的實施例的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明。但是應(yīng)當(dāng)理解，下 面的實施例僅僅是作為例證的，不應(yīng)以任何方式當(dāng)作對上述本發(fā)明總體的限制。
實施例一 檢測大鼠視網(wǎng)膜組織中SAP97和alpha-CaMKII基因的表達(dá)
實驗材料所用的熒光染料購自lx BEYOND Green I ( 1:10,000 )(毅新興業(yè)(北京)
科技有限公司)；反應(yīng)緩沖液(內(nèi)含MgCh、 dNTPs、 DNA高保真擴(kuò)增聚合酶等)。
實驗步驟
(一)、根據(jù)《分子克隆實驗指南》第3版(薩姆布魯克著，金冬雁譯，科學(xué)出版社)的方法以從大鼠視網(wǎng)膜組織中提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后生成的cDNA為模版。其中，為了優(yōu)化 反應(yīng)條件，以大鼠P-actin為內(nèi)參基因。
(二) 、設(shè)計引物信息
SAP97-F: CCCTCCACACCACAGGCAAAT SAP97-R: GCAGCTGCTCCTCCCGTGATAAT CaMKII-F: GGCCTGTGGCGTCATCCTGTAT CaMKII-R: GGACGGGTTGATGGTCAGCAT 內(nèi)參基因(Rat actin beta) F: 5-cacccgcgagtacaaccttc-3 內(nèi)參基因(Rat actin beta) R: 5-cccatacccaccatcacacc陽3
(三) 反應(yīng)體系參見表1，其中設(shè)計5個內(nèi)參引物的濃度梯度Yl-Y5，從中選取最適引物組。
表l:反應(yīng)體系
待測基因Y10U)Y寧)Y30tl)Y，)Y5⑨
cDNA模板0.50.50.50.50.5
SAP97正向引物11110
反向引物11110
CaMKII正向引物11110
反向引物11110
內(nèi)參正向引物0.250.50.7511
反向引物0.250.50.7511
反應(yīng)緩沖液11.2511.2511.2511.2511.25
水補(bǔ)齊至總量2525252525
(四)、反應(yīng)條件為
95 。C 5min
(95°C 30s64。C 30s 68°C30sPlate read) 35cycles 60°C-100'C每升高0.2 1:記錄一次熒光值生成的解鏈特征圖譜。(五)、實驗結(jié)果及分析
1、 熒光PCR結(jié)果分析
1) 圖1所示，Yl內(nèi)參引物終濃度為50nM，其他引物為200nM，解鏈特征圖譜出三個 峰。其中84。C表示SAP97的解鏈特征峰，86.6。C為alpha-CaMKII解鏈特征峰，91.8°C 為內(nèi)參基因大鼠l3-actin的解鏈特征峰(下同)，這三個峰值95%置信區(qū)間無重疊， 特征峰清晰，并且內(nèi)參引物優(yōu)勢不明顯。
2) 圖2所示，Y2內(nèi)參引物終濃度為100nM，其他引物為200nM，解鏈特征圖譜出三 個峰，三個峰值95%置信區(qū)間無重疊，特征峰清晰，但內(nèi)參引物峰占優(yōu)勢，較為不 適宜采用該檢測體系。
3) 圖3所示，Y3內(nèi)參引物終濃度為150nM,其他引物為200nM,解鏈特征圖譜出三 個峰，但內(nèi)參引物峰占優(yōu)勢，并且84'C的峰值已經(jīng)不明顯，已經(jīng)不適合采用該檢測 體系。
4) 圖4所示，Y4內(nèi)參引物終濃度為200nM,其他引物為200nM，解鏈特征圖譜只有 內(nèi)參基因大鼠P-actin的91.8'C峰值的較為明顯，并且待測基因SAP97和CaMKII置 信區(qū)間重疊，無特征峰，這表明內(nèi)參占絕對優(yōu)勢，己經(jīng)不適合采用該檢測體系。
5) 圖5所示，Y5只有內(nèi)參基因大鼠p-actin及其引物，這清晰顯示91.8'C峰值為內(nèi)參基 因的特征峰。Y5用于作為內(nèi)參對照，并驗證cDNA。
因此，從上確定最適合的反應(yīng)體系為Y1。
2、 電泳檢測結(jié)果分析
將上述PCR產(chǎn)物，按照常規(guī)方法進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。其中泳道1-5為表1中的 Yl-Y5反應(yīng)體系，泳道M(Marker)為分辯率100bp的分子量標(biāo)記(自上向下依次是600bp、 500bp、 400bp、 300bp、 200bp、 100bp)， SAP97是227bp、大鼠p-actin是207bp 、 CaMKII 是181bp，因此中間條帶為內(nèi)參大鼠|3-actin。 如圖6所示
1) Yl泳道內(nèi)三條待測基因清晰可見，分別為227bp的SAP97、 207bp的大鼠p-actin、 181bp的CaMKII。電泳結(jié)果表明使用Yl體系進(jìn)行多重?zé)晒釶CR，能夠有效檢測出 待測基因SAP97、 CaMKII和內(nèi)參基因大鼠(3-actin。
2) Y2泳道內(nèi)，內(nèi)參基因占優(yōu)勢，并且CaMKII已經(jīng)不明顯，內(nèi)參抑制作用開始增強(qiáng)。3) Y3泳道內(nèi)，內(nèi)參基因占優(yōu)勢，并且CaMKII和SAP97不明顯，表明內(nèi)參抑制作用更 為增強(qiáng)，該體系已經(jīng)不適合用于檢測。
4) Y4泳道內(nèi)，內(nèi)參基因占絕對優(yōu)勢，并且沒有CaMKII和SAP97，表明該體系已經(jīng)不 適合用于檢測。
5) Y5泳道為內(nèi)參對照泳道，只有內(nèi)參引物，做對比，驗證cDNA。
因此，作為熒光PCR的結(jié)果驗證，電泳結(jié)果分析證實通過解鏈特征圖譜所確定的 Yl體系中的引物濃度比例為最適引物濃度。
實施例二轉(zhuǎn)基因玉米Maximizer176、 BTll、 MON810的檢測
為了檢測玉米中是否含有外源的轉(zhuǎn)基因，使用本方法對多種玉米種屬的外源標(biāo)記基 因或篩選基因同時進(jìn)行多重?zé)晒釶CR檢測。
實驗材料所用的熒光染料購自1 x BEYOND Green I ( 1:10,000 )(毅新興業(yè)(北 京)科技有限公司)；反應(yīng)緩沖液(內(nèi)含MgCl 2、 dNTPs、 1.5U AmpliTaq Gold DNA polymerase、 0.3U的AmpEraseUNG酶等)。
(一) 、基因組DNA的提取
基因組DNA用cetyltrimethy lammonium bromide的方法從O.lg植物組織中分離得 至!j; DNA濃度用Gene-Quant RNA/DNA Calculator ( Amersh咖Pharmacia Biotech Europe GmbH， Freiburg, Germany )測得，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和EB染色與已知的 lambda phage標(biāo)準(zhǔn)品比較而進(jìn)一步確認(rèn)。
(二) 、設(shè)計引物信息
玉米Maximizer 176-f: GTG GAC AGC CTG GAC GAG AT 玉米Maximizer 176-r: TGC TGA AGC CAC TGC GGA AC 用于擴(kuò)增外源的目的基因crylA(b)，共75bp。
玉米Btl 1 -f: TCC TTG TCC TTG ACA CAG TTT CTG 玉米Btll-r: GATGTC ACTAGTCCGAGAACGAA 用于擴(kuò)增外源的目的基因crylA(b)，共75bp。由于上述兩端引物擴(kuò)增crylA(b)基因的不同序列，因此解鏈特征圖譜不同于玉米 Maximizer 176的外源的目的基因crylA(b)。
玉米MON810-f: TGA TGT GAT ATC TCC ACT GACG 玉米MON810-r: CGG CAA GTA ATC AGC ACA G
用于擴(kuò)增外源的目的基因P-35S和hsp70 intron兩個基因連接的一段，共280bp。 (三)、反應(yīng)體系參見表2:
表2反應(yīng)體系
待測基因引物Oil)
玉米Maximizer的crylA(b)正向引物(150nM)2
反向引物(150nM)2
玉米Btll的crylA(b)正向引物(50nM)2
反向引物(50nM)2
玉米MON810的P-35S和hsp70 intron正向引物(200nM)2
反向引物(150nM)2
反應(yīng)緩沖液33
水補(bǔ)齊至總量50
(四) 、反應(yīng)條件為
95 。C 5min
(95°C 30s64°C 30s 68。C30sPlate read) 35cycles 60°C-100°C每升高0.2 1:記錄一次熒光值生成的解鏈特征圖譜。
(五) 、實驗結(jié)果及分析
如圖所示，用Maximizer 176、Btll和MON810特異性PCR體系做三重PCR反應(yīng)， 解鏈特征圖譜出三個峰。其中76.9。C表示MON80的解鏈特征峰，85.2t:表示Btl 1的解 鏈特征峰，88.9'C表示Maximizer176的解鏈特征峰，其相應(yīng)的擴(kuò)增片段的解鏈溫度分別 相差8.3卩、3.7 °C和12 °C, 95%置信區(qū)間無重疊。因此，在表2的適當(dāng)引物濃度下，完全可以清晰的區(qū)分各特異性擴(kuò)增片段的解鏈特征峰，說明這種技術(shù)也可用于三重PCR 反應(yīng)。
綜合實施例l-2，相比于傳統(tǒng)的方法，本發(fā)明具有成本低(無需合成多個探針)、耗 時短(可在一次反應(yīng)中檢測2-10個基因)、結(jié)果分析簡單便捷(只需對照陽性樣本的解 鏈特征圖譜即可判斷目的基因的有無)、應(yīng)用領(lǐng)域極其廣泛的優(yōu)點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種利用解鏈特征圖譜以檢測多重?zé)晒舛縋CR產(chǎn)物的試劑盒，包含待測基因模板、陽性對照基因、目的基因N的引物對、能結(jié)合DNA雙鏈而不結(jié)合單鏈的熒光染料、PCR反應(yīng)緩沖液；其中反應(yīng)緩沖液含有MgCl2、dNTPs、DNA擴(kuò)增聚合酶；目的基因N為2-10個目的基因。
2. 權(quán)利要求l的試劑盒，其中目的基因N為2-7個，更優(yōu)選3-5個。
3. 權(quán)利要求1或2的試劑盒，其中所述的熒光染料是Beyond Green I熒光染料。
4. 權(quán)利要求3的試劑盒，其中還包含用于擴(kuò)增內(nèi)參基因的引物對，所述的內(nèi)參基因選自 微管蛋白基因、肌動蛋白基因、糖酵解酶系基因或核糖體蛋白基因。
5. 權(quán)利要求3的試劑盒，用于擴(kuò)增cDNA的反應(yīng)緩沖液含有MgCl2、 dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶、 DNA聚合酶。
6. 利用前述的試劑盒，通過解鏈特征圖譜檢測熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物的方法，包括(1) 根據(jù)待測的目的基因序列分別設(shè)計引物；(2) 配制包含雙鏈DNA特異性的熒光染料的多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增的反應(yīng)體系；(3) 在反應(yīng)體系中，用步驟(l)的引物同時分別擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增同時設(shè)立陽性對照;(4) 記錄待測樣本基因和陽性對照的熒光定量PCR的解鏈特征圖譜，并通過相互比 較以判斷待測樣本中的目的基因；其中，所述的解鏈特征圖譜是PCR反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液從6(TC緩慢升溫至IO(TC， 升溫速率為0.2 °C/s ，每升高0.2 'C連續(xù)記錄熒光值的變化，最終將溫度的變化與熒光 值的變化求負(fù)倒數(shù)(-dF/dT)后對溫度作圖，可得到擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈特征圖譜；和判定標(biāo)準(zhǔn)為將待測基因的解鏈特征圖譜與陽性樣本的解鏈特征圖譜作比較，根據(jù) 特征峰判定待測基因是否為陽性樣本所對應(yīng)的目的基因產(chǎn)物。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件優(yōu)選是95'C預(yù)變性5min，然后95'C， 30s; 64。C， 30s; 68°C， 30s， 35個循環(huán)。
8. 權(quán)利要求6或7的方法，其中所述的目的基因選自轉(zhuǎn)基因生物(GMO)中的基因(轉(zhuǎn)入 經(jīng)濟(jì)作物中或轉(zhuǎn)基因食品中的篩選基因、標(biāo)記基因)、經(jīng)濟(jì)作物或食品中的多致病菌基 因、細(xì)胞因子基因、表達(dá)的mRNA、抗藥或耐藥基因、SNP、疾病或病毒的多個特征基 因等等。其中，目的基因可以是來自同一基因組，也可以來自不同的基因組。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述的目的基因是大鼠視網(wǎng)膜組織中SAP97和alpha-CaMKII基因，所述的內(nèi)參基因是大鼠l3-actin基因，所述的引物分別是SAP97-F/R、 CaMKII-F/R: GGACGGGTTGATGGTCAGCAT、 Rat actin beta-F/R。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述的目的基因是玉米Maximizer 176中的外源基因 crylA(b)(75bp)、玉米BT11中的外源基因crylA(b)(75bp)、玉米MON810中的外源基因 P-35S和hsp70in加n的聯(lián)合片段(280bp)，所述的引物分別是玉米Maximizer 176-F/R、玉 米BtllF/R、玉米MON810-F/R。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用不同目的基因片段具有不同的解鏈特征圖譜、通過熒光定量PCR同時檢測多個基因的方法，包括根據(jù)待測的多個目的基因序列分別設(shè)計多對引物；配制包含雙鏈DNA特異性的熒光染料的多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增的反應(yīng)體系；在反應(yīng)體系中，用多對引物同時分別擴(kuò)增多個目的基因，擴(kuò)增同時設(shè)立陽性對照；記錄待測樣本和陽性對照熒光定量PCR的解鏈特征圖譜，并通過將待測基因的解鏈特征圖譜與陽性樣本的解鏈特征圖譜作比較，根據(jù)解鏈特征峰判定待測基因是否是陽性樣本所對應(yīng)的目的基因產(chǎn)物。同時提供利用該方法的檢測試劑盒。本發(fā)明能同時檢測2-10個目的基因，并具有成本低、無需合成探針、耗時短、結(jié)果分析簡單便捷、應(yīng)用領(lǐng)域極其廣泛的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N21/64GK101603094SQ20091015826
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月23日
發(fā)明者晶 任, 李賢禎, 馬慶偉 申請人:毅新興業(yè)(北京)科技有限公司