本申請要求于2014年4月1日提交的第61/973,795號美國臨時專利申請和于2014年5月9日提交的第61/991,109號美國臨時專利申請的權(quán)益，其全部公開內(nèi)容通過引用并入于此。
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明公開的主題涉及熒光化合物。具體地，本發(fā)明公開的主題涉及氮雜環(huán)丁烷取代的多環(huán)化學(xué)熒光團以及其制備和使用方法。
背景技術(shù)：
：：熒光顯微術(shù)使活細胞內(nèi)的特定分子成像成為可能。這種技術(shù)依賴于明亮、耐光的熒光染料對生物分子的精確標記。遺傳編碼的熒光團如綠色熒光蛋白(GFP)是熒光成像的主要基礎(chǔ)，其允許標記遺傳特異性。然而，這些蛋白質(zhì)染料缺乏許多應(yīng)用例如單分子成像實驗所必需的光穩(wěn)定性。在過去二十年中，已經(jīng)開發(fā)了許多替代的標記策略，其將熒光蛋白的遺傳特異性與小分子熒光團的良好的光物理學(xué)相結(jié)合。引人注目的替代選擇包括FlAsH、酶基自標記標簽(例如SnapTag和HaloTag)、親電子配體-受體對(例如TMPTag和香豆素-PYP)和硫辛酸連接酶變體。自標記標簽允許標記與不同合成熒光團融合的特定蛋白質(zhì)融合物。自標記標簽已使活細胞內(nèi)的許多成像實驗成為可能。盡管化學(xué)染料的總集數(shù)量巨大，但是相對較少的化學(xué)染料表現(xiàn)出細胞內(nèi)標記所需的細胞滲透性。因此，細胞內(nèi)自標記標簽配體的可用調(diào)色板被限制在基于香豆素和羅丹明骨架的經(jīng)典的純中性熒光團，其顯示出膜滲透性和快速標記動力學(xué)，但不具有最佳的亮度和光穩(wěn)定性。先前改進染料性能(例如Cy、AlexaFluor)的工作涉及實質(zhì)性修飾，例如結(jié)構(gòu)剛性化和添加磺酸酯(或鹽)基。通過這些努力得到了高極性、細胞不滲透的染料，其在體外或在細胞外部有用，但與活細胞的細胞內(nèi)應(yīng)用不相容。盡管自標記標簽與羅丹明染料相容，但是對于優(yōu)化這類用于活細胞標記實驗的熒光團沒有進行多少工作。以前的努力集中在增加水溶性以及熒光亮度和光穩(wěn)定性上，這通常是通過顯著的結(jié)構(gòu)修飾實現(xiàn)的。這種染料對于體外和細胞外應(yīng)用起作用，但是極性太高以至于不能順從地進入細胞。因此，仍然需要容易合成并具有改善的亮度和適當?shù)募毎麧B透性的化合物。仍然需要可以在體內(nèi)充當自標記標簽的化合物。技術(shù)實現(xiàn)要素：如在本文中體現(xiàn)和廣泛描述的，本發(fā)明公開的主題一方面涉及用作熒光標記物的化合物、其制備方法、使用所述化合物成像一種或多種可能存在于活細胞中的目標物質(zhì)的方法以及使用所述化合物的試劑盒。在一些實施方案中，本發(fā)明化合物是氮雜環(huán)丁烷-取代的已知熒光標記物的衍生物。在一些實施方案中，本發(fā)明的氮雜環(huán)丁烷取代的化合物相對于其原始母體化合物能夠表現(xiàn)出更大的量子產(chǎn)率。本發(fā)明公開的化合物的實施方案包括下式：其中：每個R獨立地選自鹵素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，所述烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Q選自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；W選自C和N；X選自孤對電子、H、烷基、芳基、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，X任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Y選自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且Z選自H、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)；本發(fā)明公開的實施方案還包括下式的化合物：其中：每個R獨立地選自鹵素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Q選自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；W選自C和N；M選自CR(2)、C(O)、SO2和PO2；L選自O(shè)、S、NR和CN2，其中任選地L和W與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)；U和V獨立地選自H、烷基、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代，或者其中U和V與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)；Y選自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且Z選自H、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)。本發(fā)明公開的主題的實施方案還包括試劑盒。該試劑盒可包括本文所述的任何化合物以及可逆地或不可逆地結(jié)合所述化合物的結(jié)合元件。在一些實施方案中，結(jié)合元件包括蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，試劑盒包括具有下式的化合物：其中：每個R獨立地選自鹵素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Q選自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；W選自C和N；X選自孤對電子、H、烷基、芳基、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，X任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Y選自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且Z選自H、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)；以及還包括可逆地或不可逆地結(jié)合所述化合物的結(jié)合元件。在試劑盒的一些實施方案中，試劑盒包括具有下式的化合物：其中：每個R獨立地選自鹵素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Q選自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；W選自C和N；M選自CR(2)、C(O)、SO2和PO2；L選自O(shè)、S、NR和CN2，其中任選地L和W與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)；U和V獨立地選自H、烷基、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代，或者其中U和V與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)；Y選自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且Z選自H、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)；以及還包括可逆地或不可逆地結(jié)合所述化合物的結(jié)合元件。本發(fā)明公開的主題的實施方案還包括用于成像、測量和/或檢測目標物質(zhì)的方法。在一些實施方案中，所述方法可包括將疑似或已知具有目標物質(zhì)的樣品與本文所述的任何化合物接觸，然后檢測來自化合物的發(fā)射光，所述發(fā)射光指示目標物質(zhì)的存在。在一些實施方案中，所述方法包括使樣品與選擇性結(jié)合目標物質(zhì)的化合物接觸，所述化合物具有以下化學(xué)式：其中：每個R獨立地選自鹵素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Q選自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；W選自C和N；X選自孤對電子、H、烷基、芳基、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，X任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Y選自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且Z選自H、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)；以及檢測來自所述化合物的發(fā)射光，所述發(fā)射光指示所述目標物質(zhì)的存在。在一些實施方案中，所述方法包括使樣品與具有下式的化合物接觸：其中：每個R獨立地選自鹵素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Q選自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；W選自C和N；M選自CR(2)、C(O)、SO2和PO2；L選自O(shè)、S、NR和CN2，其中任選地L和W與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)；U和V獨立地選自H、烷基、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代，或者其中U和V與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)；Y選自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且Z選自H、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)；以及檢測來自所述化合物的發(fā)射光，所述發(fā)射光指示所述目標物質(zhì)的存在。對于本發(fā)明的另外的優(yōu)點，一部分將在下面的描述中闡述，一部分將從描述中顯而易見地或者可以通過本發(fā)明的實施得知。本發(fā)明的優(yōu)點將通過在所附權(quán)利要求中特別指出的要素和組合來實現(xiàn)和獲得。應(yīng)當理解，前面的一般性描述和以下詳細描述都僅用于示例和解釋，而不是對所要求保護的本發(fā)明的限制。附圖說明在所附權(quán)利要求中具體闡述了本發(fā)明的主題的新特征。通過參考以下詳細描述將更好的理解本發(fā)明公開的主題的特征和優(yōu)點，所述詳細描述提出了使用本發(fā)明的原理的示例性實施方案及其附圖，其中：圖1為顯示分子內(nèi)扭轉(zhuǎn)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)過程的Jabloński圖。圖2為顯示四甲基羅丹明和JF549的歸一化吸收(abs)和熒光發(fā)射(fl)光譜的曲線圖。圖3為四甲基羅丹明和JF549的歸一化吸光度-介電常數(shù)(εr)圖。圖4為來自表達HaloTag-H2B并用JF549-HaloTag配體孵育的經(jīng)洗滌的活HeLa細胞的細胞核的共焦最大投影圖像；比例尺＝5μm。圖5為顯示用JF549-HaloTag配體或四甲基羅丹明-HaloTag配體標記的HaloTag-H2B分子間在亮度(n>4000)和軌跡長度(n>500)方面的比較的箱須圖，其中十字形指示平均值，須線跨越10-90百分位數(shù)。圖6為表達HaloTag-H2B的并采用JF549-HaloTag配體標記的固定U2OS細胞的dSTORM熒光顯微圖像。平均定位誤差為17.2nm，中值定位誤差為14.1nm；比例尺＝5μm。圖7為表達HaloTag-H2B并采用TMR-HaloTag配體標記的固定U2OS細胞的dSTORM和寬場(插圖)熒光顯微圖像。平均定位誤差為19.2nm，中值定位誤差為17.0nm；比例尺＝5μm。圖8顯示了采用JF549-HaloTag配體(圖6)和TMR-HaloTag配體(圖7)的成像實驗的定位誤差歸一化分布。圖9為表達HaloTag-H2B并采用JF549-HaloTag配體標記的活HeLa細胞的細胞核的dSTORM熒光顯微圖像；比例尺＝5μm。圖10為表達HaloTag-H2B并采用JF646-HaloTag配體標記的固定U2OS細胞核的dSTORM熒光顯微圖像。平均定位誤差為11.1nm，中值定位誤差為8.4nm；比例尺＝5μm。圖11為表達HaloTag-H2B并采用SiTMR-HaloTag配體標記的固定U2OS細胞的dSTORM熒光顯微圖像。平均定位誤差為11.9nm，中值定位誤差為9.0nm；比例尺＝5μm。圖12為顯示了使用JF646-HaloTag配體(圖10)和SiTMR-HaloTag配體(圖11)的成像實驗的定位誤差歸一化分布。圖13為表達HaloTag-微管蛋白并采用JF646-HaloTag配體標記的活HeLa細胞的寬場熒光顯微鏡圖像。圖14為表達HaloTag-微管蛋白并采用JF646-HaloTag配體標記的活HeLa細胞的dSTORM顯微圖像。平均定位誤差為9.23nm；中值定位誤差為7.14nm。圖15為顯示了寬場圖像(圖13)和dSTORM圖像(圖14)中作為行長函數(shù)的線掃描強度的圖。圖16為不存在(-HT)和存在(+HT)過量HaloTag蛋白的情況下SiTMR-HaloTag配體(5μM)的吸光度譜圖。圖17為不存在(-HT)和存在(+HT)過量HaloTag蛋白的情況下JF646-HaloTag配體(5μM)的吸光度譜圖。圖18為活HeLa細胞的寬場熒光顯微圖像，該細胞采用H2B-HaloTag轉(zhuǎn)染，用SiTMR-HaloTag配體(100nM)孵育，并且在沒有經(jīng)過中間洗滌步驟的情況下成像；虛線表示細胞邊界；比例尺：10μm。圖19為活HeLa細胞的寬場熒光顯微圖像，該細胞采用H2B-HaloTag轉(zhuǎn)染，用JF646-HaloTag配體(100nM)孵育，并且在沒有經(jīng)過中間洗滌步驟的情況下成像；虛線表示細胞邊界；比例尺：10μm。圖20為圖18中作為行長函數(shù)的線掃描強度圖。圖21為圖19中作為行長函數(shù)的線掃描強度圖。圖22為表達HaloTag-H2B并采用100nM的JF646-HaloTag配體(頂行)或SiTMR-HaloTag配體(底行)孵育的未洗滌的活HeLa細胞的寬場熒光顯微圖像的實例。圖23為覆蓋在HaloTag-H2B的dSTORMH2B圖像上的、由JF549-SnapTag配體制備的SnapTag-TetR-JF549綴合物的單分子軌道透視圖，所述HaloTag-H2B在活U2OS細胞的細胞核中采用JF646-HaloTag配體標記；比例尺＝5μm。圖24為H2B的dSTORM圖像與活U2OS細胞中快速TetR擴散率(2-10μm2s-1；黃色)區(qū)域和慢TetR擴散率(<2μm2s-1；藍色)區(qū)域的覆蓋圖。圖25為與HaloTag-H2B共定位(黑色)或不與HaloTag-H2B共定位(灰色)的SnapTag-TetR的表觀擴散系數(shù)(Dapp)的歸一化分布。圖26為顯示活HeLa細胞中DRAQ5核染色熒光的寬場熒光顯微圖像，所述活HeLa細胞表達SnapTag-H2B并采用DRAQ5和Snap-Cell430標記；比例尺＝50μm。圖27為顯示活HeLa細胞中DRAQ5核染色熒光的寬場熒光顯微圖像，所述活HeLa細胞表達SnapTag-H2B并采用DRAQ5和氮雜環(huán)丁烷基-香豆素-TapTag配體標記；比例尺＝50μm。圖28為顯示活HeLa細胞中采用Snap-Cell430標記的SnapTag-H2B的熒光的寬場熒光顯微圖像，所述活HeLa細胞表達SnapTag-H2B并采用DRAQ5和Snap-Cell430標記；比例尺＝50μm。圖29為顯示活HeLa細胞中的氮雜環(huán)丁烷基-香豆素標記的SnapTag-H2B的熒光的寬場熒光顯微圖像，所述活HeLa細胞表達SnapTag-H2B并采用DRAQ5和氮雜環(huán)丁烷基-香豆素-SnapTag配體標記；比例尺＝50μm。圖30為顯示當用Snap-Cell430或氮雜環(huán)丁烷基-香豆素-TapTag配體(n＝50，誤差棒，s.e.m。)標記時細胞中背景香豆素標記物之上的中值核熒光的定量圖。圖31為用于合成本發(fā)明公開主題的實施方案的化合物的代表性合成方案。圖32為用于合成本發(fā)明公開主題的實施方案的化合物的代表性合成方案。圖33為用于合成本發(fā)明公開主題的實施方案的化合物的代表性合成方案。圖34為用于合成本發(fā)明的主題的實施方案的化合物的代表性合成方案。圖35為用于合成本發(fā)明的主題的實施方案的化合物的代表性合成方案。圖36為用于合成本發(fā)明的主題的實施方案的化合物的代表性合成方案。圖37為用于合成本發(fā)明的主題的實施方案的化合物的代表性合成方案。圖38為用于合成本發(fā)明的主題的實施方案的化合物的代表性合成方案。具體實施方式在本文中闡述了本發(fā)明公開主題的一個或多個實施方案的細節(jié)。在研究了本文中提供的信息之后，對本文中描述的實施方案以及其他實施方案的修改對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是顯而易見的。本文中提供的信息，特別是所描述的代表性實施方案的具體細節(jié)，主要是為了清楚理解而提供，不應(yīng)將其理解為不必要的限制。如果存在沖突，本文中包括定義在內(nèi)的詳細說明將控制這種情況的發(fā)生。本發(fā)明公開的主題包括具有作為熒光團(例如熒光染料)的用途的化合物。本發(fā)明化合物可用作熒光探針以觀察和表征特定物質(zhì)的位置和/或濃度。就這一點而言，術(shù)語“探針”、“染料”、“標記物”等在本文中可互換使用，他們是指包含熒光團部分的化合物，所述熒光團部分對于結(jié)合元件具有選擇性和/或結(jié)合至結(jié)合元件，而結(jié)合元件對目標物質(zhì)具有選擇性。探針能夠發(fā)出發(fā)射光，其可以用于確定目標物質(zhì)的存在和/或測量目標物質(zhì)的量。在這方面，本發(fā)明公開的主題還包括使用本發(fā)明化合物及其中間體的方法以及制備這些化合物及其中間體的方法。定義除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)科學(xué)術(shù)語具有與本公開主題所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管與本文所描述的方法、裝置和材料類似或等同的任何方法、裝置和材料可以用于本發(fā)明公開主題的實施或測試，現(xiàn)在仍要描述代表性的方法、裝置和材料。根據(jù)長期存在的專利法慣例，當在本申請(包括權(quán)利要求)中使用術(shù)語“一個”、“一種”和“所述”時，其是指“一個或多個”。因此，例如，提到“化合物”時，其包括多種這樣的化合物，如此等等。除非另有說明，在說明書和權(quán)利要求書中使用的表示成分的量、性質(zhì)(例如反應(yīng)條件)等的所有數(shù)字應(yīng)理解為其在所有情況下由術(shù)語“約”修飾。因此，除非有相反的說明，否則本說明書和權(quán)利要求書中闡述的數(shù)值參數(shù)是近似值，其可以根據(jù)本發(fā)明公開的主題所尋求獲得的期望的性質(zhì)而變化。當提及質(zhì)量、重量、時間、體積、濃度或百分比的值或量時，本文所使用的術(shù)語“約”意在涵蓋與規(guī)定的量相比有些變化的范圍，所述變化在一些實施方案中為±20％，在一些實施方案中為±10％，在一些實施方案中為±5％，在一些實施方案中為±1％，在一些實施方案中為±0.5％，并且在一些實施方案中為±0.1％，因為這些變化適于實施所公開的方法。本文所使用的范圍可以表示為從“約”一個具體值，和/或至“約”另一個具體值。還應(yīng)理解本文公開了多個值，除了這些值本身之外，每個值還在本文中公開為“約”該特定值。例如，如果公開值“10”，則還公開了“約10”。還應(yīng)當理解，兩個特定單元之間的每個單元也被公開了。例如，如果公開了10和15，則11、12、13和14也被公開了。本文使用的術(shù)語“吸收波長”是指能夠被化合物吸收以便激發(fā)化合物發(fā)射光的光波長。被吸收光激發(fā)的化合物發(fā)射的光將具有“發(fā)射波長”。本文所用的術(shù)語“衍生物”是指其結(jié)構(gòu)衍生自母體化合物(例如，本文公開的化合物)結(jié)構(gòu)的化合物，其結(jié)構(gòu)與本文公開的化合物足夠相似，并且基于該相似性，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會預(yù)期它們將表現(xiàn)出與要求保護的化合物相同或相似的活性和功用，或者作為前體誘導(dǎo)與要求保護的化合物相同或相似的活性和功用。本文所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”是指包含20種蛋白質(zhì)氨基酸中的若干的任何聚合物，而不管其大小。盡管“多肽”經(jīng)常用于指較大的蛋白質(zhì)，并且“肽”通常用于指小蛋白質(zhì)，但是在本領(lǐng)域中，這些術(shù)語的使用是部分重疊的并有所不同。除非另有說明，本文所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”是指肽、多肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語“選擇性結(jié)合”在本文中指的是原子、部分和/或分子優(yōu)先接近或結(jié)合特定化合物的性質(zhì)。在一些情況下，原子、部分和/或分子選擇性地結(jié)合化合物上的特定位點，例如蛋白質(zhì)分子上的活性位點。術(shù)語“檢測”在本文中用于指基于從本發(fā)明化合物發(fā)射的光觀察、成像、指示目標物質(zhì)的存在，以及測量目標物質(zhì)等的行為。更具體地，在一些情況下，本發(fā)明化合物可以結(jié)合到目標物質(zhì)，并且在暴露于吸收光時，將發(fā)出發(fā)射光。發(fā)射光的存在可以指示目標物質(zhì)的存在，而對光強度的定量可以用于測量目標物質(zhì)的濃度。術(shù)語“目標物質(zhì)”是指被本發(fā)明公開的化合物直接選擇性結(jié)合的物質(zhì)和/或被與本發(fā)明化合物結(jié)合的分子間接結(jié)合的物質(zhì)。目標物質(zhì)可包括但不限于蛋白質(zhì)、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、病毒、底物、代謝物、抑制劑、藥物、營養(yǎng)物、生長因子等。在一些實施方案中，目標物質(zhì)是指整個分子，在其他實施方案中，目標物質(zhì)是指分子上的位點，例如特定蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點。本文所用的術(shù)語“取代的”預(yù)期包括有機化合物的所有允許的取代基。在寬泛的方面，允許的取代基包括有機化合物的非環(huán)狀和環(huán)狀、支鏈和非支鏈、碳環(huán)和雜環(huán)、以及芳族和非芳族取代基。示例性取代基包括例如下述的那些取代基。對于適當?shù)挠袡C化合物，允許的取代基可以是一個或多個以及相同的或不同的。為了達到本發(fā)明的目的，雜原子(例如氮)可以具有氫取代基和/或滿足雜原子化合價的任何本文所述的允許的有機化合物取代基。本公開內(nèi)容不旨在以任何方式受限于所允許的有機化合物的取代基。此外，術(shù)語“取代”或“被...取代”包括隱含的條件，即該取代是根據(jù)被取代原子和取代基允許的化合價進行的，并且該取代產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物，例如不會自發(fā)通過諸如重排、環(huán)化、消除等進行轉(zhuǎn)化的物質(zhì)。除非另有說明，本文所述的所有化學(xué)基團包括未取代的和取代的變體。在定義各種術(shù)語時，“A1”，“A2”，“A3”和“A4”在本文中用作表示各種特定取代基的通用符號。這些符號可以是任何取代基，不限于本文公開的那些，并且當它們在一種情況下被定義為某些取代基時，它們在另一種情況下可以定義為一些其他取代基。當使用從左到右書寫的常規(guī)化學(xué)式詳細說明取代基時，它們同樣包括由從右到左書寫該結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生的化學(xué)上相同的取代基。例如，-CH2O-也包括-OCH2-。應(yīng)當理解，即使沒有具體記載，本文提供的化學(xué)結(jié)構(gòu)中的鍵的類型和位置也可以根據(jù)化合物中的取代基進行調(diào)整。例如，對于-X-，在X可以是C或N的情況下，-X-可以分別指-CH2-或-NH-，其中未示出N上的孤對電子。因此，即使沒有具體說明，本文所述的化合物包括完成化學(xué)結(jié)構(gòu)所需的任何氫原子、孤對電子等。本文所用的術(shù)語“烷基”是1-24個碳原子的支鏈或非支鏈飽和烴基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、丁基、正戊基、異戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。烷基可以是環(huán)狀或非環(huán)狀的。烷基可以是支鏈或非支鏈的。烷基還可以指取代或未取代的烷基。例如，烷基可以被一個或多個基團取代，所述基團包括但不限于任選取代的烷基、環(huán)烷基、烷氧基、氨基、醚、鹵素、羥基、硝基、甲硅烷基、磺基氧代或硫醇?！暗图壨榛笔呛?-6個(例如1-4個)碳原子的烷基。在整個說明書中，“烷基”通常用于指未取代的烷基和取代的烷基；然而，本文也會通過確認烷基上的具體取代基來具體引用取代的烷基。例如，術(shù)語“鹵代烷基”具體是指被一個或多個鹵素(例如氟、氯、溴或碘)取代的烷基。術(shù)語“烷氧基烷基”具體是指被一個或多個烷氧基取代的烷基，如下所述。術(shù)語“烷基氨基”具體是指被一個或多個氨基取代的烷基，如下所述，等等。當在一種情況下使用“烷基”并在另一種情況下使用諸如“烷基醇”的具體術(shù)語時，這并不意味著術(shù)語“烷基”不是指諸如“烷基醇”等的具體術(shù)語。這種習(xí)慣也用于本文所述的其他基團。也就是說，在術(shù)語例如“環(huán)烷基”是指未取代的和取代的環(huán)烷基部分的同時，在此之外可以在本文中具體確認取代部分。例如，特定的取代環(huán)烷基可以被稱為例如“烷基環(huán)烷基”。類似地，取代烷氧基可以具體地稱為例如“鹵代烷氧基”，特定的取代烯基可以是例如“烯基醇”等。同樣，使用通用術(shù)語(如“環(huán)烷基”)和具體術(shù)語(例如“烷基環(huán)烷基”)的做法并不意味著該通用術(shù)語不包括該具體術(shù)語。術(shù)語“烷基”包括“環(huán)烷基”。本文所用的術(shù)語“環(huán)烷基”是由至少三個碳原子組成的非芳香碳基環(huán)。環(huán)烷基的實例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、降冰片基等。術(shù)語“雜環(huán)烷基”是如上定義的一類環(huán)烷基，并且包括在術(shù)語“環(huán)烷基”的含義之內(nèi)，其中環(huán)烷基的環(huán)中的至少一個碳原子被雜原子(例如但不限于氮、氧、硫或磷)取代。環(huán)烷基和雜環(huán)烷基可以是取代的或未取代的。環(huán)烷基和雜環(huán)烷基可以被一個或多個基團取代，包括但不限于本文所述的任選取代的烷基、環(huán)烷基、烷氧基、氨基、醚、鹵素、羥基、硝基、甲硅烷基、磺基氧代或硫醇。在這一點上，本文所用的術(shù)語“雜環(huán)”是指單環(huán)和多環(huán)芳香或非芳香環(huán)體系，其中至少一個環(huán)成員不是碳。雜環(huán)包括吡啶、嘧啶、呋喃、噻吩、吡咯、異噁唑、異噻唑、吡唑、噁唑、噻唑、咪唑、噁唑(包括1,2,3-噁二唑、1,2,5-噁二唑和1,3,4-噁二唑)、噻二唑(包括1,2,3-噻二唑、1,2,5-噻二唑和1,3,4-噻二唑)、三唑(包括1,2,3-三唑、1,3,4-三唑)、四唑(包括1,2,3,4-四唑和1,2,4,5-四唑)、吡啶、噠嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪(包括1,2,4-三嗪和1,3,5-三嗪)、四嗪(包括1,2,4,5-四嗪)、吡咯烷、哌啶、哌嗪、嗎啉、氮雜環(huán)丁烷、四氫吡喃、四氫呋喃、二噁烷等。本文所用的術(shù)語“烷氧”或“烷氧基”是指通過醚鍵連接的烷基或環(huán)烷基；即“烷氧基”可以定義為-OA1，其中A1是如上所定義的烷基或環(huán)烷基?！巴檠趸边€包括剛剛描述的烷氧基的聚合物；即，烷氧基可以是聚醚，例如-OA1-OA2或-OA1-(OA2)a-OA3，其中“a”是1-200的整數(shù)，A1、A2和A3是烷基和/或環(huán)烷基。本文所用的術(shù)語“烯基”是具有2-24個碳原子的烴基，其結(jié)構(gòu)式中含有至少一個碳-碳雙鍵的。該術(shù)語包括線性和成環(huán)(如環(huán)烯基)基團。不對稱結(jié)構(gòu)如(A1A2)C＝C(A3A4)旨在包括E和Z異構(gòu)體。這可以由本文中的其中存在不對稱烯烴的結(jié)構(gòu)式證明，或者其可以由鍵符號C＝C明確指示。烯基可以被一個或多個基團取代，該基團包括但不限于本文所述的任選取代的烷基、環(huán)烷基、烷氧基、烯基、環(huán)烯基、炔基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、鹵化物、羥基、酮、疊氮化物、硝基、甲硅烷基、磺基氧代或硫醇。本文所用的術(shù)語“芳基”是包含任何碳基芳香基的基團，包括但不限于苯、萘、苯基、聯(lián)苯、苯氧基苯等。術(shù)語“芳基”還包括“雜芳基”，雜芳基被定義為含有其環(huán)內(nèi)引入至少一個雜原子的芳香基的基團。雜原子的實例包括但不限于氮、氧、硫和磷。同樣，也包括在術(shù)語“芳基”中的術(shù)語“非雜芳基”被定義為包含不含雜原子的芳基的基團。芳基可以是取代的或未取代的。芳基可以被一個或多個基團取代，所述基團包括但不限于本文所述的任選地取代的烷基、環(huán)烷基、烷氧基、烯基、環(huán)烯基、炔基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、鹵化物、羥基、酮、疊氮化物、硝基、甲硅烷基、磺基氧基或硫醇。術(shù)語“聯(lián)芳基”是一種特定類型的芳基并且包含在“芳基”的定義中。聯(lián)芳基是指通過稠合環(huán)結(jié)構(gòu)連接在一起的兩個芳基(如在萘中)，或通過一個或多個碳-碳鍵連接(如在聯(lián)苯中)。本文所用的術(shù)語“環(huán)”是指取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的雜芳基。環(huán)包括稱為稠環(huán)體系的稠環(huán)部分，其中環(huán)可以稠合到選自取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的雜芳基中的一個或多個環(huán)的任意組合。環(huán)中的原子數(shù)通常由環(huán)中的成員數(shù)量來定義。例如，“5-8元環(huán)”是指有5-8個原子環(huán)繞排列。環(huán)可以任選地包括雜原子。術(shù)語“環(huán)”還包括包含多于一個“環(huán)”的環(huán)體系，其中每個“環(huán)”獨立地如上定義。本文所述的一些不飽和結(jié)構(gòu)，例如包括環(huán)烷基和芳基的環(huán)結(jié)構(gòu)，用虛鍵示出，以表示可能存在共振結(jié)構(gòu)。具有虛鍵的結(jié)構(gòu)旨在反映結(jié)構(gòu)的每個可能的構(gòu)型，但不一定意味著所有可能的結(jié)構(gòu)都存在。應(yīng)當理解，這種結(jié)構(gòu)中的鍵的類型(例如，單鍵、雙鍵)將根據(jù)結(jié)構(gòu)中的原子以及結(jié)構(gòu)是否被一個或多個另外的原子或部分取代而變化。本文所用的術(shù)語“醛”由式-C(O)H表示。在本說明書中，“C(O)”是羰基(即C＝O)的簡寫符號。本文所用的術(shù)語“胺基”或“氨基”由式NA1A2A3表示，其中A1、A2和A3可以獨立地是氫或任選取代的烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、炔基、環(huán)炔基、芳基或雜芳基。在具體實施方案中，胺基是指NH2、NH(烷基)、NH(芳基)、N(烷基)2和N(芳基)2中的任一個。本文所用的術(shù)語“羧酸”由式-C(O)OH表示。本文所用的術(shù)語“酯”由式-OC(O)A1或-C(O)OA1表示，其中A1可以是本文所述的任選取代的烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、炔基、環(huán)炔基、芳基或雜芳基。本文所用的術(shù)語“聚酯”由式-(A1O(O)C-A2-C(O)O)a-或-(A1O(O)C-A2-OC(O))a-，其中A1和A2獨立地可以是本文所述的任選取代的烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、炔基、環(huán)炔基、芳基或雜芳基，并且“a”是1-500的整數(shù)。“聚酯”用于描述通過具有至少兩個羧酸基團的化合物與具有至少兩個羥基的化合物之間的反應(yīng)產(chǎn)生的基團。術(shù)語“鹵化物”或“鹵素”是指選自氟、氯、溴和碘的至少一種鹵素。本文所用的術(shù)語“硫醇”由式-SH表示。化合物本發(fā)明公開的主題包括氮雜環(huán)丁烷取代的化合物。在某些實施方案中，氮雜環(huán)丁烷取代的化合物是包含供電子N,N-二烷基氨基基元的熒光化合物的修飾形式。在這樣的實施方案中，原始母體化合物的N,N-二烷基被氮雜環(huán)丁烷替代。一些包含N,N-二烷基氨基基元的未修飾的熒光團傾向于非輻射衰變機制和/或表現(xiàn)出適度的量子產(chǎn)率。然而，使用氮雜環(huán)丁烷部分取代二甲基氨基的本發(fā)明化合物的實施方案可以減少或消除該非輻射衰變途徑，并相對于相應(yīng)的未被氮雜環(huán)丁烷取代的化合物增加熒光團的量子產(chǎn)率值。由于具有增加的量子產(chǎn)率，本發(fā)明化合物的一些實施方案還表現(xiàn)出與相應(yīng)的未被氮雜環(huán)丁烷取代的化合物相當或優(yōu)于其的亮度和光穩(wěn)定性。在一些實施方案中，具有改善的量子產(chǎn)率的化合物在生物成像實驗中需要較低的照射功率，并且不太可能經(jīng)歷破壞性弛豫途徑，導(dǎo)致較高的光穩(wěn)定性。本發(fā)明化合物的某些實施方案具有優(yōu)異的和預(yù)料不到的性質(zhì)。平面結(jié)構(gòu)有利于呫噸染料和其他類似結(jié)構(gòu)中熒光發(fā)射的產(chǎn)生。先前一直認為采用低級環(huán)(例如具有約3或4個碳的那些環(huán))取代將損害化合物的平面結(jié)構(gòu)。具體地，采用四元氮雜環(huán)丁烷環(huán)體系的修飾是高度應(yīng)變的(26kcalmol-1)，并且直觀地認為其與在許多熒光分子中發(fā)現(xiàn)的平面離域結(jié)構(gòu)不相容。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本文所述的新的氮雜環(huán)丁烷取代令人驚訝地出人意料地保留甚至可以增強相應(yīng)的未被氮雜環(huán)丁烷取代的化合物的熒光特性。本發(fā)明的氮雜環(huán)丁烷取代的化合物的實施方案還包括不太容易進行分子內(nèi)扭轉(zhuǎn)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)的結(jié)構(gòu)。這種令人驚訝和意想不到的特征提供了某些具有高量子產(chǎn)率的具體化合物。在某些情況下，其量子產(chǎn)率高于作為基礎(chǔ)的未被氮雜環(huán)丁烷取代的化合物。應(yīng)當理解，本發(fā)明公開的氮雜環(huán)丁烷取代可以在包括已知的熒光團在內(nèi)的多種熒光團上進行。在一些情況下，氮雜環(huán)丁烷取代允許保留基礎(chǔ)熒光團和/或增強其有益性質(zhì)。例如，本發(fā)明化合物的實施方案包括氮雜環(huán)丁烷取代的羅丹明化合物，其保持或增強未被氮雜環(huán)丁烷取代的羅丹明化合物的亮度、光穩(wěn)定性和/或光不敏感性。在化學(xué)熒光團的現(xiàn)存集合中，羅丹明染料是一個對使用遺傳編碼自標記標簽的活細胞成像有用的類別。該功用源于羅丹明染料的亮度、光穩(wěn)定性、對pH的不敏感性和可修飾結(jié)構(gòu)?？梢钥刂屏_丹明的光譜特性以獲得具有從藍色到紅外的最大吸收的染料。此外，羅丹明染料在“開放的”、兩性離子的醌型與“閉合的”、親脂性內(nèi)酯形式之間平衡存在。這種動態(tài)兩親性使羅丹明染料成為活細胞標記技術(shù)的優(yōu)良配體。該染料在沒有洗滌劑或化學(xué)掩蔽基團的情況下有效地穿過細胞膜，并且過量的配體可以被快速洗掉。在本發(fā)明公開的主題的一些實施方案中，提供了下式的化合物：其中每個R獨立地選自鹵素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Q選自CR(2)、C(O)NR2、NR、O、S、SiR(2)和Se；W選自C和N；X選自孤對電子、H、烷基、芳基、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，X任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Y選自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且Z選自H、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)。在一些實施方案中，其中Y和Z與它們所鍵合的原子一起形成5-7元環(huán)，所述5-7元環(huán)被選自N、O和S的一個或多個另外的雜原子取代，和/或被一個或多個選自鹵素、CN、OH，O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基的取代基取代。在具體實施方案中，Y和Z與它們所鍵合的原子一起形成被未取代或取代的氮雜環(huán)丁烷基取代的5-7元環(huán)。在本發(fā)明公開的主題的一些實施方案中，化合物具有如下化學(xué)式：其中R’選自鹵素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、C(O)NR2、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；在其他實施方案中，R’選自氮雜環(huán)丁烷部分(基團)，其未被取代或被一個或多個選自鹵素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、C(O)NR2、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基的取代基取代。在本發(fā)明公開的主題的一些實施方案中，化合物具有如下化學(xué)式：在本發(fā)明公開的主題的一些實施方案中，化合物具有如下化學(xué)式：在本發(fā)明公開的主題的一些實施方案中，化合物具有如下化學(xué)式：在本發(fā)明公開的主題的一些實施方案中，化合物具有如下化學(xué)式：在本發(fā)明公開的主題的一些實施方案中，化合物具有如下化學(xué)式：在本發(fā)明公開的主題的一些實施方案中，化合物具有如下化學(xué)式：在本發(fā)明公開的主題的一些實施方案中，化合物具有如下化學(xué)式：在本發(fā)明公開的主題的一些實施方案中，化合物具有如下化學(xué)式：在本發(fā)明公開的主題的一些實施方案中，X是取代的芳基。在其他實施方案中，X也可以選自但不限于H、C、在一些實施方案中，W是N，X是孤對電子。在一些實施方案中，X可以部分或全部包含能夠?qū)⒈景l(fā)明化合物結(jié)合至如本文所述的結(jié)合元件的連接體。在其他實施方案中，X可部分或全部包含結(jié)合元件。本文所示的X的結(jié)構(gòu)僅用于示例性目的，因為在一些實施方案中X取決于可用于與一個化合物連接的連接體、可用于與一個化合物連接的結(jié)合元件和/或通過化合物進行檢測的目標物質(zhì)。在本發(fā)明公開的主題的一些實施方案中，化合物可以根據(jù)下式中的至少一種進行選擇：本發(fā)明公開的主題還包括本文所述的任何化合物的衍生物。本文所述的化合物可含有一個或多個雙鍵，因此可能產(chǎn)生順/反(E/Z)異構(gòu)體以及其他構(gòu)象異構(gòu)體。除非有相反的說明，本發(fā)明包括所有這些可能的異構(gòu)體以及這些異構(gòu)體的混合物。除非有相反的說明，具有僅表示為實線而不是楔形或虛線的化學(xué)鍵的化學(xué)式涵蓋每種可能的異構(gòu)體，例如每種對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體，以及異構(gòu)體的混合物，例如外消旋混合物或其中一個對映體過量的兩個對映體的混合物。本文所述的化合物可以含有一個或多個不對稱中心，因此可能產(chǎn)生非對映異構(gòu)體和光學(xué)異構(gòu)體。除非相反地說明，否則本發(fā)明包括所有這些可能的非對映異構(gòu)體及其外消旋混合物、其基本純凈的拆分對映異構(gòu)體、所有可能的幾何異構(gòu)體及其藥學(xué)上可接受的鹽。還包括立體異構(gòu)體的混合物以及分離的特定立體異構(gòu)體。在用于制備這些化合物的合成步驟中，或者在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的外消旋化或差向異構(gòu)化方法的使用中，這些步驟的產(chǎn)物可以是立體異構(gòu)體的混合物。如本文所討論的，應(yīng)當理解本發(fā)明公開的氮雜環(huán)丁烷取代是可概括的，并且可應(yīng)用于多種化合物。代表性化合物包括氮雜環(huán)丁烷取代的羅丹明衍生物、氮雜環(huán)丁烷取代的香豆素衍生物、氮雜環(huán)丁烷取代的對甲氨基酚衍生物、氮雜環(huán)丁烷取代的吖啶衍生物、氮雜環(huán)丁烷取代的噁嗪衍生物、氮雜環(huán)丁烷取代的萘二甲酰亞胺衍生物、氮雜環(huán)丁烷取代的碳羅丹明(carborhodamine)衍生物、氮雜環(huán)丁烷取代的硅羅丹明(silarhodamine)衍生物等。普通技術(shù)人員會辨認能夠進行本發(fā)明公開的氮雜環(huán)丁烷取代的其他化合物。如上所述，本發(fā)明公開主題的這些和其他衍生物可以保留和/或增強相應(yīng)的未被氮雜環(huán)丁烷取代的化合物的有益特性。例如，具有最小結(jié)構(gòu)變化的氮雜環(huán)丁烷取代的化合物的實施方案可以保持原始未被氮雜環(huán)丁烷取代的化合物的細胞滲透性和細胞內(nèi)標記效率。此外，如本文所述，氮雜環(huán)丁烷部分可以是取代的或未取代的。下面表1描述了在氮雜環(huán)丁烷環(huán)上帶有取代基的氮雜環(huán)丁烷-羅丹明，氮雜環(huán)丁烷基-碳羅丹明和氮雜環(huán)丁烷基-硅羅丹明的實施方案。應(yīng)當理解，表1中描述的氮雜環(huán)丁烷部分可以并入本文所述的任何化合物中。表1氮雜環(huán)丁烷基-羅丹明、氮雜環(huán)丁烷基-碳羅丹明和氮雜環(huán)丁烷基-硅羅丹明的實施方案的光譜數(shù)據(jù)。除非另有說明，所有測量都是在10mMHEPESpH7.3的條件下進行的。a在含有0.1％(v/v)三氟乙酸的三氟乙醇中測量的消光系數(shù)b在含有0.1％(v/v)三氟乙酸的乙醇中測量的消光系數(shù)。本發(fā)明化合物可具有寬范圍的吸收和發(fā)射性質(zhì)。由于本發(fā)明的氮雜環(huán)丁烷取代可以在多種化合物上進行，本發(fā)明的氮雜環(huán)丁烷取代的化合物的實施方案可以包括紫外至近紅外光譜的吸收波長。本發(fā)明化合物的具體實施方案可包括選自約100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm或其間的任何值的吸收波長。在一些實施方案中，化合物包括大于約1000nm的吸收波長。一旦活化，本發(fā)明化合物可以發(fā)射可檢測的發(fā)射光。發(fā)射光的波長可以根據(jù)基礎(chǔ)化合物及取代情況而變化，并且在一些實施方案中，發(fā)射波長是約100nm至約1000nm的波長，包括約100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm或其間的任何值。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還將理解，本發(fā)明化合物包含本發(fā)明熒光團的開放和閉合(例如內(nèi)酯)形式。在一些情況下，具有酯取代基的本發(fā)明的氮雜環(huán)丁烷基熒光團可以通過酸或堿介導(dǎo)的條件去保護以產(chǎn)生具有羧酸柄的氮雜環(huán)丁烷染料。圖33所示的方案說明了在閉合的“內(nèi)酯”形式和具有羧酸柄的開放形式間轉(zhuǎn)化的代表性熒光團。在其他實施方案中，化合物在暴露于吸收光時可從閉合形式轉(zhuǎn)化為開放形式。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明化合物可以被光活化或化學(xué)活化以在閉合和開放形式之間轉(zhuǎn)化。本文所述的所有化合物包括每種熒光團的閉合形式和開放形式。在一些實施方案中，本發(fā)明公開化合物的實施方案的開放形式和閉合形式可以由下式表示：其中每個R獨立地選自鹵素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Q選自CR(2)、C(O)NR2、NR、O、S、SiR(2)和Se；W選自C和N；M選自CR(2)、C(O)NR2、C(O)、SO2和PO2；L選自O(shè)、S、NR、CN2和C(O)NR2，其中任選地L和W與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)；U和V獨立地選自H、烷基、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、C(O)NR2、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代，或者其中U和V與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)；Y選自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且Z選自H、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)。在這樣的化合物的一些實施方案中，化合物具有由下式表示的結(jié)構(gòu)：其中R’選自鹵素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H或氮雜環(huán)丁烷基取代，所述氮雜環(huán)丁烷基未被取代或被H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、C(O)NR2、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基中的一個或多個取代。在這方面，本發(fā)明公開的主題的代表性開放形式化合物具有如下化學(xué)式：在一些實施方案中，本發(fā)明公開的化合物的閉合形式包括如下化學(xué)式：在一些實施方案中，本發(fā)明公開的化合物的閉合形式包括如下化學(xué)式：在一些實施方案中，U和V包括取代的芳基，并且在一些實施方案中，該化合物可以由下式表示：其中X’選自H、OH、烷基、芳基、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2和SO3H。在閉合形式化合物的某些實施方案中，化合物包括選自以下的化學(xué)式：雖然為了說明的目的提供了上述結(jié)構(gòu)，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在閱讀本文后將理解本文公開的化合物的所有開放形式和閉合形式。試劑盒本發(fā)明公開的主題包括試劑盒，其包含與合適的結(jié)合元件包裝在一起的本文所述的任何化合物。在一些情況下，結(jié)合元件在本文中被稱為配體。結(jié)合元件可以可逆地和/或不可逆地結(jié)合化合物。在一些實施方案中，結(jié)合元件可以直接結(jié)合到化合物，而在其他實施方案中，結(jié)合元件間接結(jié)合到化合物。在一些實施方案中，化合物可以經(jīng)由連接體間接結(jié)合至結(jié)合元件，其中在一些實施方案中，連接體包括未取代或取代的烷基等。試劑盒的一些實施方案還具有用于連接到本發(fā)明化合物的連接體。結(jié)合元件通?？梢赃x擇性地結(jié)合感興趣的分子或物質(zhì)(即目標物質(zhì))。代表性結(jié)合元件包括但不限于氨基酸、蛋白質(zhì)、抗體或其片段、抗原、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、藥物、激素、脂質(zhì)、合成聚合物、固體支持物、聚合物微粒、細胞、病毒、酶底物等，或病毒。結(jié)合元件可用于檢測待觀察和/或表征的分子或物質(zhì)，可指示已發(fā)生特定事件和/或指示另一分子或物質(zhì)(即目標物質(zhì))的存在。在一些實施方案中，提供了包含根據(jù)本發(fā)明公開的主題的兩種或更多種不同化合物的試劑盒。這些實施方案可以進一步具有一種或多種結(jié)合元件，其中所述化合物可以結(jié)合相同或不同的結(jié)合元件。在一些實施方案中，每一個化合物和/或結(jié)合元件可以選擇性地結(jié)合不同的分子、顆粒、物質(zhì)等。另外地或可選地，在一些實施方案中，試劑盒包含根據(jù)本發(fā)明公開的主題的兩種或更多種不同的化合物，所述化合物具有不同的吸收波長和/或發(fā)射波長，因此可以在多重過程中實施。使用方法本發(fā)明公開的主題還包括使用本文所述的化合物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括利用所述化合物作為酶活性的報道分子、熒光標記物、目標物質(zhì)(分析物)的傳感器、成像實驗的試劑和/或超分辨顯微術(shù)的成像劑。本發(fā)明公開主題的一些實施方案包括用于檢測目標樣品的方法，其包括使樣品與下式的化合物接觸：其中每個R獨立地選自鹵素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Q選自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；W選自C和N；X選自孤對電子、H、烷基、芳基、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，X任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Y選自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且Z選自H、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)?？蛇x地或另外地，在用于檢測目標樣品的方法的一些實施方案中，所述方法包括使樣品與下式的化合物接觸的步驟：其中：每個R獨立地選自鹵素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Q選自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；W選自C和N；M選自CR(2)、C(O)、SO2和PO2；L選自O(shè)、S、NR和CN2，其中任選L和W與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)；U和V獨立地選自H、烷基、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，烷基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代，或者其中U和V與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)；Y選自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且Z選自H、鹵素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任選地被獨立地選自N、O和S的一個或多個雜原子、鹵素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y與它們所鍵合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元環(huán)。本發(fā)明公開的用于檢測目標物質(zhì)的方法還可以包括檢測步驟，所述檢測步驟包括檢測來自化合物的發(fā)射光，所述發(fā)射光指示目標物質(zhì)的存在。在一些實施方案中，使用所述化合物的方法還包括通過將所述化合物暴露于包括吸收波長的吸收光來激發(fā)所述化合物。如本文所述，吸收光可以包括紫外光至近紅外光。在具體實施方案中，吸收波長可以在約100nm至約1000nm的范圍內(nèi)，在200nm至約800nm的范圍內(nèi)和/或在約450nm至約650nm的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，吸收波長為約100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm或1000nm。在一些實施方案中，通過使用熒光光譜法或通過肉眼進行檢測步驟。因此，在一些實施方案中，采用顯微鏡進行檢測步驟。在一些實施方案中，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會理解的，目標物質(zhì)的存在可以指示特定生物功能的發(fā)生或不存在。在一些實施方案中，所述方法在活細胞和/或受試者中進行。檢測方法的一些實施方案包括使樣品與對不同目標物質(zhì)具有選擇性的兩個或更多個化合物的實施方案接觸。用兩種或更多種本發(fā)明公開的化合物檢測兩種或更多種目標物質(zhì)的方法在本文中稱為“多重”檢測方法。在一些本發(fā)明的多重方法中，使用兩種或更多種探針檢測兩種或更多種不同的目標物質(zhì)和/或一種目標物質(zhì)的兩個或更多個區(qū)域，其中每個探針都用本發(fā)明化合物的不同實施方案標記。本發(fā)明公開的化合物可用于多種目標物質(zhì)的多重檢測方法中。在這點上，多重方法可包括使樣品與根據(jù)本發(fā)明公開的主題的第一化合物和第二化合物接觸。第一化合物可以對第一目標物質(zhì)具有選擇性，并且能夠發(fā)射第一發(fā)射光，第二化合物可以對第二目標物質(zhì)具有選擇性，并且可以發(fā)射第二發(fā)射光。檢測步驟包括檢測指示第一目標物質(zhì)存在的第一發(fā)射光和指示第二目標物質(zhì)存在的第二發(fā)射光，然后檢測來自化合物的第二發(fā)射光。第二發(fā)射光可以指示第二目標物質(zhì)的存在。在一些實施方案中，所述發(fā)射波長和第二發(fā)射波長彼此不同。因此，該新方法提供了用于同時檢測一種底物中的多種不同目標物質(zhì)的有效手段。合成方法本發(fā)明公開的主題還包括生產(chǎn)如本文所述的化合物的方法。用于合成本發(fā)明公開的化合物的實施方案的方法通常包括一個或多個公知的合成步驟。雖然本文描述了用于合成本發(fā)明化合物的方法的某些實施方案，但合成方法不應(yīng)限于本文所述的方法，因為合成方法可包括對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的任何方法。在一些實施方案中，該方法包括在合成方法的后期形成化合物的C(芳基)-N(例如C(芳基)-氮雜環(huán)丁烷)鍵。在一些實施方案中，使用氮親核體與熒光素二(三氟甲磺酸酯)之間的布赫瓦爾德-哈特維希交叉偶聯(lián)。在一些實施方案中，該方法在布赫瓦爾德-哈特維希條件下使用Pd(OAc)2、BINAP和Cs2CO3在約100℃下甲苯中進行。在其他實施方案中，該方法采用具有活性聯(lián)芳基配體XPhos的Pd2dba3以Cs2CO3為堿、二氧六環(huán)為溶劑，在約80℃至約100℃下進行。因此，與不同的N-烷基偶聯(lián)配偶體進行的Pd催化交叉偶聯(lián)代表了用于合成本發(fā)明化合物的方法的實施方案。在一些實施方案中，通過直接胺化合成化合物如羅丹明染料可能是不實際的。對于至少這些化合物，其合成方法中可以使用氨基甲酸酯。用于合成本發(fā)明化合物的其他代表性方法在下面文獻中進行了描述：Grimm等人，SynthesisofRhodaminesfromFluoresceinsUsingPd-CatalyzedC-NCross-Coupling，Org.Lett.13,6354-6357，(2011)，其通過引用并入本文。此外，用于合成本發(fā)明公開化合物的實施方案的方法的非限制性列表在圖31-38所示的代表性方案中進行了說明。圖31為用于制備代表性二溴熒光母素和熒光素二(三氟甲磺酸酯)的一般合成方案。具有羧酸取代基的二溴熒光母素和熒光素二乙酸酯可以通過酸催化的費歇爾酯化或通過與DMF的二叔丁基縮醛的反應(yīng)形成酯而被保護。然后可以用堿水解熒光素二乙酸酯，產(chǎn)生的取代的熒光素可以用三氟甲磺酸酐轉(zhuǎn)化為熒光素二(三氟甲磺酸酯)。圖32為用于制備代表性的碳熒光素二(三氟甲磺酸酯)和硅熒光素二(三氟甲磺酸酯)的一般合成方案。TBS保護的蒽酮和Si-蒽酮與芳基格氏試劑的反應(yīng)可以獲得TBS保護的碳熒光素和硅熒光素。通過TBAF介導(dǎo)的脫保護和隨后的與三氟甲磺酸酐的反應(yīng)可以得到碳熒光素二(三氟甲磺酸酯)和硅熒光素二(三氟甲磺酸酯)。圖33為用于制備代表性的氮雜環(huán)丁烷基羅丹明、氮雜環(huán)丁烷基碳羅丹明和氮雜環(huán)丁烷基硅羅丹明的一般合成方案。氮雜環(huán)丁烷與二溴熒光母素、熒光素二(三氟甲磺酸酯)、碳熒光素二(三氟甲磺酸酯)或硅熒光素二(三氟甲磺酸酯)的布赫瓦爾德-哈特維希鈀催化C-N交叉偶聯(lián)可直接得到氮雜環(huán)丁烷基熒光團。具有酯取代基的氮雜環(huán)丁烷基熒光團可以通過酸或堿介導(dǎo)的條件去保護以產(chǎn)生具有羧酸柄的氮雜環(huán)丁烷基染料。所述酸可以通過與DSC或TSTU反應(yīng)進一步衍生為N-羥基琥珀酰亞胺基(NHS)酯，隨后與胺反應(yīng)以產(chǎn)生具有側(cè)酰胺基的類似物。圖34為用于制備代表性氮雜環(huán)丁烷基對甲氨基酚的一般合成方案。在剩余的三氟甲磺酸酯部分水解時，氮雜環(huán)丁烷(1當量)與熒光素二(三氟甲磺酸酯)、碳熒光素二(三氟甲磺酸酯)或硅熒光素二(三氟甲磺酸酯)的布赫瓦爾德-哈特維希鈀催化的C-N交叉偶聯(lián)可提供氮雜環(huán)丁烷基對甲氨基酚。圖35為從氮雜環(huán)丁烷基羅丹明、氮雜環(huán)丁烷基碳羅丹明和氮雜環(huán)丁烷基硅羅丹明制備代表性熒光2-偶氮-1-二氫茚酮染料的一般合成方案。氮雜環(huán)丁烷基羅丹明與草酰氯反應(yīng)，然后與(三甲基甲硅烷基)二重氮甲烷反應(yīng)，得到2-偶氮-1-茚滿酮。堿介導(dǎo)的酯取代基水解可以產(chǎn)生具有酸部分的2-偶氮-1-茚滿酮，其可以通過與TSTU反應(yīng)進一步衍生為N-羥基琥珀酰亞胺基(NHS)酯，并與胺反應(yīng)以產(chǎn)生具有側(cè)酰胺基的類似物。圖36為用于制備代表性氮雜環(huán)丁烷基香豆素的一般合成方案。香豆素三氟甲磺酸酯可以通過7-羥基香豆素與三氟甲磺酸酐或N-苯基-雙(三氟甲磺酰亞胺)的反應(yīng)合成。氮雜環(huán)丁烷與香豆素三氟甲磺酸酯的布赫瓦爾德-哈特維希鈀催化C-N交叉偶聯(lián)可產(chǎn)生氮雜環(huán)丁烷基香豆素。或者，氮雜環(huán)丁烷基苯酚可以通過溴苯酚與氮雜環(huán)丁烷的C-N交叉偶聯(lián)來制備。然后氮雜環(huán)丁烷基苯酚的維爾斯邁爾－哈克甲酰化反應(yīng)可以提供醛，醛又可以與丙二酸酯縮合得到氮雜環(huán)丁烷基香豆素。對于具有酯取代基的實例，堿介導(dǎo)的水解可以產(chǎn)生具有羧酸的氮雜環(huán)丁烷基香豆素。這種羧酸可以通過與TSTU反應(yīng)進一步衍生成N-羥基琥珀酰亞胺基(NHS)酯，并與胺反應(yīng)以產(chǎn)生具有側(cè)酰胺基的類似物。圖37為用于制備代表性氮雜環(huán)丁烷基吖啶的一般合成方案。二氨基吖啶與酸在升高的溫度下反應(yīng)可以生成二羥基吖啶，然后二羥基吖啶可以與三氟甲磺酸酐反應(yīng)以獲得吖啶二(三氟甲磺酸酯)。然后可使吖啶二(三氟甲磺酸酯)與氮雜環(huán)丁烷進行布赫瓦爾德-哈特維希鈀催化C-N交叉偶聯(lián)，以制備氮雜環(huán)丁烷基吖啶。圖38為用于制備代表性的氮雜環(huán)丁烷基噁嗪的一般合成方案。吩噁嗪二(三氟甲磺酸酯)可以通過二羥基苯噁嗪與三氟甲磺酸酐的反應(yīng)制備。二(三氟甲磺酸酯)與氮雜環(huán)丁烷進行布赫瓦爾德-哈特維希鈀催化C-N交叉偶聯(lián)，然后用DDQ氧化得到氮雜環(huán)丁烷基噁嗪。普通技術(shù)人員會認識到本文所述的方法和方案僅為了說明性目的而提供，并且不旨在限制用于合成本發(fā)明公開的化合物的實施方案的反應(yīng)或反應(yīng)系列的范圍。實施例通過以下具體但非限制性的實施例進一步說明本發(fā)明公開的主題。以下實施例可以包括代表在與本發(fā)明相關(guān)的開發(fā)和實驗過程中的各個時間收集的數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)匯編。實施例1本實施例表征了結(jié)構(gòu)改性以改善羅丹明染料的亮度和光穩(wěn)定性，具體為一個新的氮雜環(huán)丁基助色團，其引起相對于母體染料的量子效率的增加。氮雜環(huán)丁烷基羅丹明染料易于合成，使其保留了母體染料的光譜性質(zhì)、細胞滲透性和功用。使用商業(yè)軟件包Spartan'10(版本1.1.0，Wavefunction)進行計算實驗。最簡單的已知羅丹明熒光團—羅丹明110(表2)在藍光(λmax＝497nm)中表現(xiàn)出最大吸收，具有高消光系數(shù)(ε＝7.6×104M-1cm-1)，發(fā)射綠光(λem＝520nm)并具有高量子產(chǎn)率羅丹明的烷基化引起吸收波長和熒光發(fā)射波長的紅移。例如，四甲基羅丹明(TMR)具有λmax/λem＝548/572nm和ε＝7.8×104M-1cm-1(表2)。光譜性質(zhì)的這種位移伴隨著量子產(chǎn)率的顯著降低，其中TMR顯示這兩種染料都用于商業(yè)自標記標簽底物，并且可用于標記活細胞中的細胞內(nèi)和細胞外蛋白質(zhì)。表2羅丹明110、四甲基羅丹明(TMR)和環(huán)大小為3-7的氮雜環(huán)狀羅丹明的光譜數(shù)據(jù)。除非另有說明，所有測量都是在10mMHEPESpH7.3的條件下進行的。N,N,N',N'-四烷基羅丹明(如TMR)的低量子效率可以通過能量方面有利的分子內(nèi)扭轉(zhuǎn)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)狀態(tài)(圖1)來解釋。在激發(fā)之后，從氮原子到呫噸環(huán)的電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)致吡嗪酰胺基氮和扭轉(zhuǎn)的C芳基-N鍵。這種TICT狀態(tài)迅速松弛而不發(fā)射光子，并且是羅丹明染料中非輻射衰變的主要途徑。這種雙自由基種類也可能發(fā)生不可逆的反應(yīng)導(dǎo)致熒光團漂白。因此，不支持TICT的羅丹明衍生物應(yīng)當顯示出提高的量子效率、更長的熒光壽命和更高的光穩(wěn)定性。通過使用標準的從頭算Hartree-Fock方法來估計平衡幾何形狀，并通過在能量最小化過程中省略來自結(jié)構(gòu)的鄰羧基以防止環(huán)合形成內(nèi)酯形式，分析表2所示的結(jié)構(gòu)中芳基碳-氮鍵(C芳基-N)的長度以及與氮相鄰(ortho)的氫取代基和與氮位于同一碳上的(alpha)氫取代基之間的最小距離。這些值是分子經(jīng)歷TICT的傾向的參數(shù)。較短的C芳基-N值表示增加的雙鍵特征和較小的采用扭曲構(gòu)象的趨勢。同樣，較大的Ho-Hα值表明取代基之間較少的空間碰撞和較低的鍵旋轉(zhuǎn)傾向。氮雜環(huán)丙烷衍生物的計算結(jié)構(gòu)含有折疊的氮雜環(huán)丙烷環(huán)，且氮與呫噸體系的平面分離，這與存在于三元環(huán)中的大環(huán)應(yīng)變(27kcalmol-1)一致。其他羅丹明最小化為包含苯胺氮的基本上平面的結(jié)構(gòu)，表明這些染料優(yōu)先選擇在熒光羅丹明中發(fā)現(xiàn)的擴展共軛?？紤]到存在于氮雜環(huán)丁烷中的相對大的環(huán)應(yīng)力(估計為26kcalmol-1)，氮雜環(huán)丁烷基羅丹明(JF549，實施例7)的投影結(jié)構(gòu)令人驚訝，預(yù)計其將有利于錐形氮原子。JF549顯示平面計算結(jié)構(gòu)的最短的C芳基-N鍵長度(1.349埃)和最長的Ho-Hα距離(2.56埃)。另外，與N,N-二烷基苯胺(1-苯基氮雜環(huán)丁烷IP＝7.61eV；N,N-二甲基苯胺IP＝7.37eV)相比，N芳基氮雜環(huán)丁烷顯示更高的IP值，表明電子從苯胺氮轉(zhuǎn)移到呫噸環(huán)體系形成TICT狀態(tài)需要更高的能量補償。這些結(jié)果暗示JF549將更加不易發(fā)生TICT，因此表現(xiàn)出優(yōu)于TMR熒光團(2)的熒光性質(zhì)。然后合成了表2的化合物并評價其熒光性質(zhì)。使用布赫瓦爾德-哈特維希交叉偶由熒光素二(三氟甲磺酸酯)容易且有效地合成了羅丹明，并且此合成方法允許由熒光素制備化合物。需要相對高的催化劑負載(10％)以最小化三氟甲磺酸酯水解并確保高產(chǎn)率。JF549和更大的環(huán)結(jié)構(gòu)是高度著色的極性化合物，其通過采用強溶劑系統(tǒng)(CH2Cl2/CH3OH/NH3)的正相快速色譜法純化。相比之下，氮雜環(huán)丙基羅丹明是無色、非極性分子，并且可以通過采用弱溶劑混合物(EtOAc/己烷)的正相色譜法純化。在水溶液中評價合成的化合物的光物理性質(zhì)，將它們與已知的羅丹明110和四甲基羅丹明比較。數(shù)據(jù)表明氮雜環(huán)丙烷取代基中的環(huán)應(yīng)變迫使氮雜環(huán)丙烷基羅丹明采用閉合的內(nèi)酯形式。JF549(實施例7)和更大的環(huán)結(jié)構(gòu)的λmax和λem值類似于具有增加的環(huán)大小的TMR，導(dǎo)致高達10nm的輕微紅移。有趣的是，JF549和氮雜環(huán)庚烷衍生物顯示比其他染料高約30％的消光系數(shù)。將苯胺氮并入簡單的環(huán)狀系統(tǒng)是打算控制TICT狀態(tài)形成中的許多結(jié)構(gòu)參數(shù)。先前認為含有較小氮雜環(huán)(如氮雜環(huán)丙烷和氮雜環(huán)丁烷)的結(jié)構(gòu)中的較高環(huán)應(yīng)變妨礙了熒光呫噸結(jié)構(gòu)所需的平面構(gòu)型。不同羅丹明染料的λmax、λem和ε對取代環(huán)大小的依賴性不太大，但是熒光壽命(τ)和量子產(chǎn)率隨環(huán)大小變化而變化(表2)。JF549表現(xiàn)出高量子產(chǎn)率值和長熒光壽命(τ＝3.8ns)，其大于TMR的所述值(τ＝2.2ns)，并且與母體羅丹明110的所述值相似(1；τ＝3.3ns)。JF549也比吡咯烷衍生物亮60％，吡咯烷衍生物顯示和τ＝3.6ns。哌啶衍生物的熒光急劇下降和τ＝0.6ns)；吡咯烷和哌啶衍生物的壽命值與類似的熒光團的壽命值一致。相對于哌啶衍生物，氮雜環(huán)庚烷衍生物的值(即和τ＝1.62ns)略高。JF549在單光子激發(fā)下的改善亮度(表2)延伸到雙光子激發(fā)，并且由保持了TMR的許多期望的性質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變引起。例如，TMR和JF549的吸收光譜和發(fā)射光譜是可重疊的(圖2)，并且所述染料對溶劑極性的靈敏度相當(圖3)，表明其具有相似的細胞滲透性。實施例2本實施例描述了評價染料JF549作為細胞成像中標記物的性能的方法。從6-羧基熒光素衍生物開始合成F549-HaloTag配體(實施例21)。首先將6-羧基熒光素的二乙酸酯衍生物保護為叔丁酯。將乙酸酯基用NaOH皂化，并將該中間體三氟甲磺酸酯化以經(jīng)兩步得到6-叔羧基熒光素二(三氟甲磺酸酯)，產(chǎn)率69％。與氮雜環(huán)丁烷交叉偶聯(lián)得到羅丹明，其被去保護以產(chǎn)生羧酸。用DSC處理所述羧酸，然后與HaloTag(O2)胺反應(yīng)，得到JF549-HaloTag配體(實施例21)。該分子是商業(yè)TMR基HaloTag配體的直接類似物。值得注意的是，羅丹明染料在“開放的”、兩性離子的醌型與“閉合的”、親脂性內(nèi)酯形式之間平衡存在。這種動態(tài)兩親性使得純中性羅丹明例如羅丹明110、TMR和JF549成為活細胞標記技術(shù)有用的配體，因為染料在沒有去污劑或化學(xué)掩蔽基團的情況下有效地穿過細胞膜，并且過量的配體可以被快速洗去。將TMR和JF549HaloTag配體的標記動力學(xué)與新的Cy3HaloTag配體進行比較，同時測量所得綴合物的亮度和光子產(chǎn)率。JF549配體在體外顯示出與TMR配體相當?shù)臉擞泟恿W(xué)和相對于其他染料增加的亮度。采用JF549配體孵育表達HaloTag-組蛋白2B(H2B)融合物的活細胞導(dǎo)致明亮的細胞核標記(圖4)和低細胞質(zhì)背景，證明JF549-HaloTag配體有效地穿過活細胞膜并選擇性標記HaloTag蛋白。使用少量配體(<50nM)的JF549和TMR配體孵育允許單分子成像，并允許對標記的HaloTag-H2B個體分子的熒光團亮度(光子/秒)和光穩(wěn)定性(即軌道長度，s)進行評價。與TMR配體相比，JF549配體在亮度和光穩(wěn)定性兩方面有大的增加(圖5)。用TMR配體標記的蛋白質(zhì)顯示平均光子/s＝1.1×104和平均軌道長度0.72s。JF549配體綴合物發(fā)射幾乎兩倍數(shù)目的光子數(shù)/s(1.9×104)并且持續(xù)時間約兩倍長(平均軌道長度＝1.6s)。單分子亮度的這種改進擴展到直接隨機光學(xué)重建顯微術(shù)(dSTORM)實驗，其中還原環(huán)境的使用使合成熒光團的可逆光開關(guān)成為可能。這產(chǎn)生了采用的JF549配體(圖6)或TMR配體(圖7)的H2B的超分辨率圖像(圖8)，其分別具有14.1nm和17.0nm的中值定位誤差(σ)。dSTORM可以在使用細胞還原環(huán)境來引發(fā)JF549標記物的光開關(guān)的活細胞內(nèi)(圖9)進行。因此，JF549在該光譜范圍內(nèi)在針對體外、固定細胞和活細胞中HaloTag綴合起作用。實施例3本實施例描述了將氮雜環(huán)丁烷基取代擴展至其他染料骨架，包括含有碳和硅原子的羅丹明的其他紅移同構(gòu)異素體。該實施例證明，氮雜環(huán)丁烷基取代可普遍適用于不同的熒光團骨架，并且相對于原始母體熒光團骨架能夠增加亮度。N,N-二烷基基元存在于許多經(jīng)典熒光團骨架(表3)中，包括香豆素(例如香豆素461)、吖啶(例如吖啶橙)、對甲氨基酚、碳羅丹明、噁嗪(如噁嗪1)和硅羅丹明。已經(jīng)提出TICT作為這些熒光系統(tǒng)中非輻射衰變的主要貢獻者導(dǎo)致適度的量子效率。與前述實施例中所述的羅丹明一樣，Pd-催化的交叉偶聯(lián)方法用于從易得到的芳基鹵化物或芳基三氟甲磺酸鹽開始將氮雜環(huán)丁烷基元安裝在這些熒光團中。表3N,N-二烷基(即二甲基氨基或二乙基氨基)部分被氮雜環(huán)丁烷環(huán)取代的熒光團骨架的實施方案的光譜數(shù)據(jù)除非另有說明，所有測量都是在10mMHEPESpH7.3的條件下進行的。a在含有0.1％(v/v)三氟乙酸的乙醇中測量的消光系數(shù)。在所有情況下，氮雜環(huán)丁烷取代使量子產(chǎn)率增加，而對其他光譜性質(zhì)沒有實質(zhì)性有害影響(表3)。香豆素461在水性緩沖液中顯示λmax/λem＝372nm/470nm，ε＝1.8×104M-1cm-1和適中的氮雜環(huán)丁烷基取代的化合物(實施例49)量子產(chǎn)率增大五倍，并且吸光度最大值(λmax＝354nm)藍移18nm。氮雜環(huán)丁烷取代的化合物的發(fā)射光譜和消光系數(shù)(λmax＝467nm，ε＝1.5×104M-1cm-1)與母體香豆素染料相似。7-(二乙基氨基)香豆素-3-羧酸(DEAC)顯示λmax/λem＝410nm/471nm，ε＝3.5×104M-1cm-1，但是具有低量子產(chǎn)率氮雜環(huán)丁烷取代的化合物(實施例51)顯示出較短的吸收最大值(λmax＝387nm)、較小的消光系數(shù)(ε＝2.4×104M-1cm-1)和發(fā)射最大值(λem＝470nm)，其中氮雜環(huán)丁烷取代使量子產(chǎn)率提高幾乎30倍接著，吖啶和對甲氨基酚熒光團骨架被修飾。當在水溶液中測量時，經(jīng)典熒光團吖啶橙具有而氮雜環(huán)丁烷取代的化合物(實施例60)的亮度是原來的2.5倍，兩種吖啶的其他光譜性質(zhì)相似。二甲基對甲氨基酚顯示λmax/λem＝518nm/546nm，ε＝6.0×104M-1cm-1，盡管用氮雜環(huán)丁烷代替N,N-二甲基氨基使量子產(chǎn)率增加四倍二甲基對甲氨基酚的氮雜環(huán)丁烷取代對應(yīng)物(實施例59)與二甲基對甲氨基酚具有相似的λmax、λem和ε值。然后，關(guān)于更長波長的熒光團，TMR的含碳類似物在水性緩沖液(pH7.0)中顯示λmax/λem＝606nm/626nm，ε＝1.21×105M-1cm-1，(表3）。氮雜環(huán)丁烷基-碳羅丹明(實施例40)顯示類似的吸收和發(fā)射最大值(λmax/λem＝608nm/631nm)以及消光系數(shù)(ε＝9.9×104M-1cm-1)，具有量子產(chǎn)率染料噁嗪1在遠紅外中顯示如下光譜性質(zhì)：λmax/λem＝655nm/669nm、ε＝1.11×105M-1cm-1和相對低的并且氮雜環(huán)丁烷取代(實施例61)產(chǎn)生小的藍移(λmax/λem＝647nm/661nm)和略低的消光系數(shù)(ε＝9.9×104M-1cm-1)，使量子產(chǎn)率提高3.4倍。最后，TMR的硅羅丹明的類似物(SiTMR；來自G.等人，Nat.Chem.2013，5，132)顯示λmax/λem＝643nm/662nm和氮雜環(huán)丁烷取代的化合物(實施例30)給出相似的吸收和發(fā)射最大值(λmax/λem＝646nm/664nm)和更高的由于硅羅丹明可能在水中采用無色形式，因此在酸性乙醇中測量消光系數(shù)，發(fā)現(xiàn)SiTMR的消光系數(shù)為ε＝1.41×105M-1cm-1，氮雜環(huán)丁烷取代的化合物的消光系數(shù)為ε＝1.52×105M-1cm-1。實施例4本實施例描述了使用氮雜環(huán)丁烷基-硅羅丹明的細胞成像?；赟iTMR的化合物是活細胞內(nèi)SnapTag、HaloTag和其他蛋白質(zhì)的有效標記物。相對于非氮雜環(huán)丁烷基母體化合物SiTMR，氮雜環(huán)丁烷基-羅丹明(實施例30)顯示出優(yōu)異的亮度(表3)。在該實施例中描述的氮雜環(huán)丁烷基-硅羅丹明的實施方案具有λmax＝646，并且在本文中稱為“JF646”。為了在細胞成像實驗中直接比較這兩種染料，由新的硅熒光素前體合成氮雜環(huán)丁烷基-硅羅丹明(JF646-HaloTag配體，實施例35)和SiTMR的HaloTag配體G.等人，Nat.Chem.2013，5，132)。兩種硅羅丹明配體是HaloTag-H2B的超分辨率dSTORM成像的優(yōu)異標記物(圖10和11)，分別顯示8.4nm和9.0nm的中值定位誤差(圖12)。還對表達HaloTag-微管蛋白并采用JF646配體標記的活細胞進行了dSTORM。使用該標記物觀察到高光子產(chǎn)率和低背景，產(chǎn)生中值σ＝7.1nm(圖13-15)。在與純化的蛋白質(zhì)反應(yīng)中和活細胞成像實驗中比較Halotag配體的色原性。SiTMR配體在與緩沖液中過量的HaloTag蛋白反應(yīng)時顯示6.8倍的增強(圖16)。氮雜環(huán)丁烷基-硅羅丹明-HaloTag配體顯示較低的背景，導(dǎo)致在相同條件下吸光度較大的增加(21倍)(圖17)。接下來，使用表達HaloTag-H2B融合物的細胞進行“無洗滌”成像實驗。與兩個配體中的任一配體(100nM)孵育然后直接進行寬場成像產(chǎn)生了使用SiTMR配體(圖18)和JF646配體(圖19)明亮標記的細胞核。SiTMR顯示核外熒光(圖20)，而JF646配體顯示較低的非特異性染色(圖21和22)?？偟膩碚f，這些結(jié)果顯示已知的SiTMR配體可以被結(jié)構(gòu)類似的JF646配體取代，以在超分辨率成像中實現(xiàn)改進的定位誤差并且在常規(guī)熒光顯微術(shù)中實現(xiàn)更低的背景。實施例5本實施例描述了在同一細胞中進行的多重單粒子追蹤和超分辨率成像過程。鑒于JF549和JF646之間的光譜分離，在同一活細胞中在單分子水平上成像兩種不同的蛋白質(zhì)種類。為了實現(xiàn)正交標記，制備JF549的SnapTag配體。HaloTag-H2B以及SnapTag酶和Tet阻遏物蛋白(SnapTag-TetR)的融合物被共表達并采用JF646-HaloTag配體(實施例35)和JF549-SnapTag配體(實施例22)分別標記。對JF549標記的個體TetR蛋白的軌跡進行成像，隨后進行JF646-H2B綴合物的快速活細胞dSTORM實驗(圖23)。這種雙色程序揭示了與核的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)的快擴散DNA結(jié)合蛋白和慢擴散DNA結(jié)合蛋白各自的分區(qū)(圖24)。然后繪制H2B共定位和非共定位的TetR軌跡的擴散系數(shù)直方圖，此圖顯示TetR與H2B共定位程度比與非共定位位置的程度更大(圖25)。因此，本發(fā)明化合物可用于活細胞中的多色實驗中，其中參與生物過程的幾種組分可以在相同細胞內(nèi)以分子精確度被追蹤和定位。實施例6在本實施例中，將氮雜環(huán)丁烷基-香豆素標記物用于細胞成像。將商業(yè)SnapTag配體(即SnapCell430)的性能與由7-氮雜環(huán)丁烷基-香豆素-3-羧酸合成的新型氮雜環(huán)丁烷基衍生物(實施例52)進行比較。在相同的瞬時轉(zhuǎn)染、標記和成像條件下，將表達H2B-SnapTag的細胞用紅色熒光核染色劑DRAQ5和SnapCell430或氮雜環(huán)丁烷基配體染色。使用DRAQ5染色作為空間參照(圖26和27)，測量由SnapTag配體標記的單個核的強度。采用SnapCell430配體孵育的細胞顯示低熒光強度(圖28)，然而用氮雜環(huán)丁烷基-香豆素SnapTag配體標記的細胞顯示更亮的核標記(圖29)。核強度的定量顯示用氮雜環(huán)丁烷標記的細胞具有比用商業(yè)化合物標記的細胞高五倍的中值(圖30)。實施例7-61以下實施例描述了本文所述化合物的具體實施方案，并且說明了本發(fā)明的氮雜環(huán)丁烷方法用于制備染料的靈活性。我們推測，可以通過探索在氮雜環(huán)丁烷的3位的不同取代模式進一步調(diào)整JF549的物理化學(xué)性質(zhì)。例如，表1中所示的取代的氮雜環(huán)丁烷基-羅丹明具有相對高的ε值和量子產(chǎn)率值。將用于光譜學(xué)的熒光和熒光分子配制為DMSO中的儲備溶液，并稀釋使得DMSO濃度不超過1％v/v。除非另有說明，磷酸鹽緩沖液(PBS)的pH為7.4。使用來自StarnaCells公司的1cm路徑長度的3.5-mL石英比色皿或來自Hellma公司的1cm路徑長度的1.0-mL石英微量比色皿進行光譜測量。除非另有說明，所有測量均在環(huán)境溫度(22±2℃)下在10mMHEPES和pH7.3的緩沖液中進行。在CaryModel100光譜儀(Varian)上記錄吸收光譜；消光系數(shù)(ε)的報告值是平均值(n＝3)。在CaryEclipse熒光計(Varian)上記錄熒光光譜。為了清楚起見，示出了歸一化的光譜。所有報告的量子產(chǎn)率值均是使用Quantaurus-QY光譜儀(C11374，Hamamatsu)在相同條件下測得。使用稀釋樣品(A<0.1)進行測量，并使用儀器軟件進行自吸收校正。報告的值是平均值(n＝3)。在光譜級二噁烷(Sigma-Aldrich)和milliQH2O中進行二噁烷-H2O滴定。溶劑混合物含有0.01％v/v三乙胺以確保羅丹明染料為兩性離子形式。使用石英96孔微板(Hellma)和FlexStation3酶標儀(MolecularDevices)在5μo樣品上測量λmax處的吸光度值(n＝2)。對于熒光壽命測量，將脈沖拾取器(型號350-160，ConOptics)置于激光束中以將脈沖頻率從80MHz降低至20MHz。將樣品(在50mMHEPES，pH7.2，H2O或CH3OH中稀釋的2μ稀染料)在830nm激光波長和6mW激光功率下激發(fā)。發(fā)射的光由快速定時APD收集并且饋送到單光子計數(shù)板(TimeHarp200；PicoQuant)。定時脈沖從監(jiān)測20MHz脈沖串的PIN二極管(DET01CFC；ThorLabs)獲得。系統(tǒng)的暫時脈沖響應(yīng)是通過使用薄非線性晶體代替染料樣品的激光脈沖的二次諧波的產(chǎn)生來確定。使用定制的MATLAB程序?qū)勖p數(shù)據(jù)擬合為單指數(shù)衰減函數(shù)。與文獻值為4.1±0.1ns相比，使用該系統(tǒng)測量的參比熒光染料的壽命值為4.025±0.015ns(R2＝0.99)(Magde，D.；Rojas，GE；Seybold，P.G.Photochem.Photobiol.1999，70，737)。為了測量與HaloTag蛋白反應(yīng)時HaloTag配體的熒光，在1mL石英比色皿中進行吸光度測量。把HaloTag蛋白用作75mMNaCl和50mMTRIS·HCl中的100μM溶液，pH為7.4且含有50％v/v甘油(TBS-甘油)。將JF646和SiTMR(5μM)的HaloTag配體溶解于含有0.1mg·mL-1CHAPS且pH為7.3的10mMHEPES中。加入HaloTag蛋白(1.5當量)或相當體積的TBS-甘油空白的等分試樣，將所得混合物孵育直至觀察到一致的吸光度信號(～30分鐘)。額外的HaloTag蛋白沒有引起吸光度的增加(未顯示)。吸光度掃描是平均值(n＝2)。將HeLa細胞(ATCC)和U2OS細胞(ATCC)在補充有10％v/v胎牛血清(FBS；LifeTechnologies公司)、1mMGlutaMax(LifeTechnologies公司)和1mM丙酮酸鈉(σ)的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM；LifeTechnologies)中培養(yǎng)，并保持在37℃下潮濕的5％v/vCO2環(huán)境中。使這些細胞系經(jīng)歷Janelia細胞培養(yǎng)設(shè)備的常規(guī)支原體測試。使用HaloTag-H2B、HaloTag-微管蛋白、SnapTag-TetR或SnapTag-H2B在AmaxaNucleofector(Lonza)中轉(zhuǎn)染細胞。在成像實驗之前，將轉(zhuǎn)染的細胞轉(zhuǎn)移到用Piranha溶液(濃H2SO4和30％v/v過氧化氫的比例為3:1v/v的混合物)清潔過的1號蓋玻片(WarnerInstruments)上。為了采用HaloTag或SnapTag配體標記活細胞，將配體加入到生長培養(yǎng)基中，并將樣品孵育15分鐘。對于共焦、寬場和dSTORM實驗，標記濃度通常為100-500nM，對于單分子追蹤實驗，標記濃度為5-50nM。然后用PBS(1×)簡單洗滌細胞，然后在DMEM-FBS中再孵育15分鐘。成像前，細胞用PBS(3×)簡單洗滌，并置于新鮮的DMEM-FBS中成像。在“無洗滌”實驗中省略所有洗滌。對于核染色，將細胞在PBS中孵育5分鐘(2×)，然后在含有5μ然DRAQ5(CellSignaling)的PBS中孵育5分鐘，隨后用PBS(1×)簡單洗滌。在所有成像實驗期間，細胞被維持在由活細胞培養(yǎng)器(TOKAIHIT)提供的37℃的濕潤的5％CO2v/v環(huán)境中。使用三個單獨的系統(tǒng)獲得顯微圖像。使用具有LDC-APOCHROMAT40×/1.2WKorrM27UV-VIS-IR物鏡的ZeissLSM510META共聚焦顯微鏡來完成共焦顯微術(shù)。在配備有下述設(shè)備的NikonEclipseTi寬場落射熒光顯微鏡上進行寬場顯微術(shù)、2D單分子追蹤和超分辨率成像實驗：100×,1.4NA油浸物鏡(Nikon)、Lumencor光源、由聲光可調(diào)諧濾波器(AAOpto-Electronic)控制的一組激光器(405nm/100mW，CoherentCube；561nm/200mW，CoboltJive；633nm/140mW，VortranStradus)、兩個濾光輪(Lambda10-3；SutterInstruments)、完美聚焦系統(tǒng)(Nikon)和EMCCD攝像機(iXon3，Andor)。將發(fā)射濾光器(FF01593/40或FF01676/37；Semrock)放置在用于JF549和JF646發(fā)射的相機的前面。使用多波段反射鏡(405/488/561/633BrightLine四頻帶帶通濾波器，Semrock)將激發(fā)激光束反射到物鏡中。顯微鏡、照相機和硬件通過NIS-Elements軟件(尼康)控制。在定制的三相機RAMM框架(ASI)顯微鏡上使用1.4NAPLAPON60×OSC物鏡(Olympus)和300mm焦距鏡筒透鏡(LAO-300.0MellesGriot)來記錄其他活細胞單超分辨率成像實驗，得到100×的總放大率。采用NI-DAQ-USB-6363采集板(NationalInstruments)來實現(xiàn)Stradus405-100激光器(Vortran)的頻閃405nm激發(fā)，其也被用來控制Stradus637-140激光器(Vortran)的637nm激光發(fā)射。2mm厚的四波段二向色(ZT405/488/561/640rpx，色度)和帶通發(fā)射濾光器(FF01-731/137-25，Semrock)過濾發(fā)射的光。用背照式EMCCD照相機(AndorTechnology，IxonUltraDU-897U-CS0-EXF，17MHzEM放大器)檢測熒光，其通過Micro-Manager(1.4.17)控制。為了活細胞dSTORM成像，細胞被標記、洗滌并直接在DMEM-FBS中成像。為了得到固定的細胞制備物，細胞被標記、洗滌并在PBS緩沖液(pH＝7.5)中的4％多聚甲醛(ElectronMicroscopySciences)中固定。將細胞在密封的細胞室(LifeTechnologies)中成像，所述細胞室含有由補充有50mM巰基乙胺(Sigma-Aldrich)、10％w/v葡萄糖、0.5mg/mL葡萄糖氧化酶(Sigma-Aldrich)和28400U/mL過氧化氫酶(Sigma-Aldrich)的PBS組成的氮除氣氧化還原緩沖液。在成像之前，JF549一經(jīng)2kW·cm-2的激發(fā)光(561nm)照射就可以在黑暗狀態(tài)下有效地“擱置”，然后通過低強度(～20Wcm-2)的藍光(405nm)激活回熒光狀態(tài)。使用14kW·cm-2的637nm激發(fā)光連續(xù)照射將JF646熒光團轉(zhuǎn)化為主要暗態(tài)，之后觀察到JF646熒光團的個別快速閃爍分子。這些實驗在上述兩個寬場顯微鏡系統(tǒng)上進行，即NikonEclipseTi落射熒光顯微鏡和具有ASIRAMM框架的定制的三攝像機顯微鏡。基于多靶點追蹤(MTT)算法(Serge,A.；Bertaux,N.；Rigneault,H.；Marguet,D.NatureProtocolExchange2008,doi:10.1038/nprot.2008.1128；Serge,A.；Bertaux,N.；Rigneault,H.；Marguet,D.Nat.Methods2008,5,687)使用定制MATLAB程序得到點的定位(x,y)。對于每一幀，將單個熒光團的PSF擬合成二維高斯分布。使用以IGORPro(版本6.34A)編寫的分析程序計算綜合熒光強度并將其轉(zhuǎn)換為光子計數(shù)。使用Mortensen等人(Mortensen,K.I.；Churchman,L.S.；Spudich,J.A.；Flyvbjerg,H.Nat.Methods2010,7,377)的方程式6計算局部化誤差。采用IgorProv.3.34A運行的Dedecker等人(Dedecker,P.；Duwé,S.；Neely,R.K.；Zhang,J.J.Biomed.Opt.2012,17,126008)的軟件包Localizer來實施超分辨率圖像，IgorProv.3.34A其將檢測的斑點的位置坐標疊加作為高斯掩模，此高斯掩模以擬合強度值作為幅度并以定位誤差作為寬度。在相同的照明條件下在同一天記錄用于比較兩種不同熒光團配體的dSTORM實驗數(shù)據(jù)。在NikonEclipseTi寬場落射熒光顯微鏡上記錄雙色單分子實驗。我們首先使用激發(fā)強度為～1kWcm-2的561nm激光以100Hz的幀速率對SnapTag-TetR-JF549進行2D單分子追蹤。在單粒子追蹤實驗完成后，我們立即在如上所述的dSTORM模式下成像HaloTag-H2B-JF646。在追蹤-dSTORM實驗之前和之后拍攝透射圖像，并且采用互相關(guān)算法來計算圖像漂移(Guizar-Sicairos,M.；Thurman,S.T.；Fienup,J.R.Opt.Lett.2008,33,156)。使用商業(yè)追蹤軟件DiaTrack(v.3.03，Semasopht)進行TetR的追蹤分析，所述軟件識別熒光粒子的強度斑點，并將其和與實驗確定的點擴散函數(shù)匹配的2D高斯函數(shù)進行擬合。通過使用在IGORPro6.34A中編寫的追蹤程序產(chǎn)生擴散圖，根據(jù)在10毫秒的時間量程上的均方位移來計算在20nm×20nmx-y網(wǎng)格上評估的TetR遷移率的局部表觀擴散。每當發(fā)現(xiàn)源自給定80nm網(wǎng)格節(jié)點內(nèi)的兩個或更多個分開的位移時，計算并繪制局部表觀擴散系數(shù)。然后選擇H2B簇作為超分辨圖像中的500個最亮點。從該分析中，生成了駐留在H2B簇的320nm內(nèi)至少10毫秒的所有軌跡的表觀擴散系數(shù)的直方圖。然后繪制H2B共定位和非共定位TetR軌跡的擴散系數(shù)的直方圖。實施例72-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽將熒光素二(三氟甲磺酸酯)(75mg，126μmol；來自Grimm，JB；Lavis，L.D.Org.Lett.2011,13,6354)、Pd2dba3(11.5mg，12.6μmol，0.1當量)、XPhos(18.0mg，37.7μmol，0.3當量)和Cs2CO3(115mg，352μmol，2.8當量)裝入小瓶。將小瓶密封并抽真空/用氮氣回填(3×)。加入二噁烷(1mL)，并再次用氮氣(3×)沖洗反應(yīng)。加入氮雜環(huán)丁烷(20.3μL，302μmol，2.4當量)后，將反應(yīng)在100℃下攪拌18小時。然后將其冷卻至室溫，用MeOH稀釋，沉積在硅藻土上，并濃縮至干燥。通過硅膠色譜法(0-10％MeOH(2MNH3)/CH2Cl2，線性梯度；采用硅藻土干法上樣)純化，得到標題化合物(49mg，95％)，其為紫色固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.03–7.96(m,1H),7.63(td,J＝7.4,1.3Hz,1H),7.58(td,J＝7.4,1.1Hz,1H),7.20–7.13(m,1H),6.56(d,J＝8.6Hz,2H),6.20(d,J＝2.3Hz,2H),6.09(dd,J＝8.6,2.3Hz,2H),3.91(t,J＝7.3Hz,8H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ169.9(C),153.7(C),153.1(C),152.9(C),134.6(CH),129.4(CH),129.0(CH),127.8(C),125.0(CH),124.3(CH),107.9(C),107.8(CH),97.7(CH),52.2(CH2),16.8(CH2)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/v三氟乙酸(TFA)添加劑；運行20min(分鐘)；流速1mL/min；ESI；正離子模式；550nm處檢測)；HRMS(ESI)C26H23N2O3[M+H]+的計算值411.1703，實驗值411.1714。實施例82-(3,6-二(3,3-二甲基氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽使用實施例7中所述的方法由熒光素二(三氟甲磺酸酯)和3,3-二甲基氮雜環(huán)丁烷鹽酸鹽制備標題化合物(86％，紫色固體)。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.11–8.06(m,1H),7.67–7.57(m,2H),7.23–7.20(m,1H),7.19(d,J＝9.2Hz,2H),6.56(dd,J＝9.1,2.2Hz,2H),6.49(d,J＝2.2Hz,2H),3.92(s,8H),1.39(s,12H)；13CNMR(MeOD,101MHz)δ173.1(C),160.2(C),158.7(C),158.2(C),140.8(C),134.9(C),132.9(CH),130.82(CH),130.77(CH),130.74(CH),130.2(CH),115.0(C),113.1(CH),95.5(CH),64.4(CH2),33.0(C),27.1(CH3)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；550nm處檢測)；HRMS(ESI)C30H31N2O3[M+H]+的計算值467.2329，實驗值467.2341。實施例92-(3,6-二(3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽使用實施例7中所述的方法由熒光素二(三氟甲磺酸酯)和3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷鹽酸鹽制備標題化合物(91％，粉色固體)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.03–7.99(m,1H),7.66(td,J＝7.4,1.3Hz,1H),7.60(td,J＝7.4,1.1Hz,1H),7.17–7.14(m,1H),6.64(d,J＝8.6Hz,2H),6.30(d,J＝2.4Hz,2H),6.17(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),4.25(t,3JHF＝11.7Hz,8H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-100.05(p,3JFH＝11.8Hz)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ169.6(C),153.3(C),152.6(C),151.3(t,4JCF＝2.9Hz,C),135.0(CH),129.7(CH),129.3(CH),127.2(C),125.1(CH),124.0(CH),115.8(t,1JCF＝274.6Hz,CF2),109.7(C),108.8(CH),99.4(CH),83.9(C),63.4(t,2JCF＝26.3Hz,CH2)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；525nm處檢測)；HRMS(ESI)C26H19F4N2O3[M+H]+的計算值483.1326，實驗值483.1336。實施例102-(3,6-二(3-氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽使用實施例7中所述的方法由熒光素二(三氟甲磺酸酯)和3-氟氮雜環(huán)丁烷鹽酸鹽制備標題化合物(89％，粉色固體)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.01–7.95(m,1H),7.78(td,J＝7.5,1.2Hz,1H),7.71(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),7.25–7.20(m,1H),6.52(d,J＝8.6Hz,2H),6.33(d,J＝2.3Hz,2H),6.24(dd,J＝8.6,2.3Hz,2H),5.49(dtt,2JHF＝57.6Hz,J＝6.0,3.1Hz,2H),4.26–4.13(m,4H),4.00–3.88(m,4H)；19FNMR(DMSO-d6,376MHz)δ-178.95(dtt,JFH＝57.4,24.2,20.9Hz)；13CNMR(DMSO-d6,101MHz)δ168.7(C),152.54(d,4JCF＝1.3Hz,C),152.47(C),151.8(C),135.4(CH),129.9(CH),128.6(CH),126.4(C),124.5(CH),123.9(CH),108.6(CH),107.8(C),98.0(CH),83.8(C),83.3(d,1JCF＝200.3Hz,CFH),59.2(d,2JCF＝23.7Hz,CH2)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；550nm處檢測)；HRMS(ESI)C26H21F2N2O3[M+H]+的計算值447.1515,實驗值447.1525。實施例112-(3,6-二(3-甲氧基氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽使用實施例7中所述的方法由熒光素二(三氟甲磺酸酯)和3-甲氧基氮雜環(huán)丁烷鹽酸鹽制備標題化合物(83％，紫色固體)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.00–7.94(m,1H),7.77(td,J＝7.5,1.2Hz,1H),7.70(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),7.25–7.20(m,1H),6.48(d,J＝8.6Hz,2H),6.26(d,J＝2.3Hz,2H),6.19(dd,J＝8.6,2.3Hz,2H),4.32(tt,J＝6.2,4.2Hz,2H),4.07(dd,J＝8.0,6.6Hz,4H),3.66(dd,J＝8.4,4.1Hz,4H),3.24(s,6H)；13CNMR(DMSO-d6,101MHz)δ168.7(C),152.8(C),152.5(C),151.9(C),135.4(CH),129.9(CH),128.5(CH),126.5(C),124.5(CH),123.9(CH),108.2(CH),107.2(C),97.5(CH),84.1(C),69.2(CH),58.3(CH2),55.4(CH3)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；550nm處檢測)；HRMS(ESI)C28H27N2O5[M+H]+的計算值471.1914,實驗值471.1926。實施例122-(3,6-二(3-氰基氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽使用實施例7中所述的方法由熒光素二(三氟甲磺酸酯)和3-氮雜環(huán)丁烷甲腈鹽酸鹽制備標題化合物(85％，洋紅色固體)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.03–7.98(m,1H),7.66(td,J＝7.4,1.3Hz,1H),7.60(td,J＝7.4,1.1Hz,1H),7.17–7.13(m,1H),6.62(d,J＝8.6Hz,2H),6.25(d,J＝2.3Hz,2H),6.12(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),4.25–4.18(m,4H),4.15–4.08(m,4H),3.60(tt,J＝8.5,6.2Hz,2H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ169.6(C),153.2(C),152.5(C),151.9(C),135.0(CH),129.7(CH),129.3(CH),127.1(C),125.1(CH),124.0(CH),119.7(C),109.7(C),108.1(CH),98.7(CH),83.9(C),55.2(CH2),18.4(CH)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；550nm處檢測)；HRMS(ESI)C28H21N4O3[M+H]+的計算值461.1608，實驗值461.1628。實施例132-(3,6-二(3-(二甲基氨基)氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽使用實施例7中所述的方法由熒光素二(三氟甲磺酸酯)和3-(二甲基氨基)氮雜環(huán)丁烷二鹽酸化物制備標題化合物(80％，紫色固體)。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.10–8.05(m,1H),7.69–7.60(m,2H),7.24–7.19(m,1H),7.12(d,J＝9.0Hz,2H),6.56(dd,J＝9.0,2.2Hz,2H),6.53(d,J＝2.2Hz,2H),4.31–4.22(m,4H),4.01(dd,J＝10.5,5.1Hz,4H),3.39(tt,J＝7.0,5.1Hz,2H),2.27(s,12H)；13CNMR(MeOD,101MHz)δ172.8(C),157.9(C),157.1(C),147.7(C),138.7(C),138.4(C),132.5(CH),131.8(CH),130.8(CH),129.9(CH),129.3(CH),114.1(C),112.4(CH),96.3(CH),57.0(CH),56.6(CH2),42.0(CH3)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；550nm處檢測)；HRMS(ESI)C30H33N4O3[M+H]+的計算值497.2547，實驗值497.2561。實施例142-(3,6-二(3-(甲氧基羰基)氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽使用實施例7中所述的方法由熒光素二(三氟甲磺酸酯)和氮雜環(huán)丁烷-3-羧酸甲酯鹽酸鹽制備標題化合物(79％，紫色固體)。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.09–8.03(m,1H),7.69–7.62(m,2H),7.24–7.17(m,1H),7.02(d,J＝8.9Hz,2H),6.48(dd,J＝8.9,2.2Hz,2H),6.45(d,J＝2.1Hz,2H),4.34(t,J＝9.0Hz,4H),4.25(dd,J＝9.0,5.9Hz,4H),3.77(s,6H),3.71(tt,J＝8.9,5.9Hz,2H)；13CNMR(MeOD,101MHz)δ174.4(C),172.6(C),157.0(C),156.5(C),141.6(C),136.7(C),135.8(C),132.7(CH),131.9(CH),130.9(CH),129.0(CH),128.5(CH),113.3(C),111.7(CH),96.8(CH),55.2(CH2),52.9(CH3),34.0(CH)；HRMS(ESI)C30H27N2O7[M+H]+的計算值527.1813，實驗值527.1823。實施例152-(3,6-二(3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽使用實施例7中所述的方法由熒光素二(三氟甲磺酸酯)和3-氮雜丁烷乙酸酯三氟乙酸甲酯制備標題化合物(67％，紫色固體)。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.10–8.05(m,1H),7.67–7.57(m,2H),7.21–7.18(m,1H),7.16(d,J＝9.1Hz,2H),6.54(dd,J＝9.1,2.2Hz,2H),6.48(d,J＝2.2Hz,2H),4.41–4.32(m,4H),3.97–3.88(m,4H),3.69(s,6H),3.26–3.13(m,2H),2.80(d,J＝7.7Hz,4H)；13CNMR(MeOD,101MHz)δ173.7(C),173.0(C),158.3(C),157.5(C),154.9(C),140.1(C),136.3(C),132.7(CH),131.1(CH),130.8(CH),130.4(CH),129.8(CH),114.5(C),112.7(CH),95.7(CH),57.5(CH2),52.2(CH3),38.5(CH2),27.3(CH)；HRMS(ESI)C32H31N2O7[M+H]+的計算值555.2126，實驗值555.2132。實施例162-(3,6-二(3-羧基氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽將2-(3,6-二(3-(甲氧基羰基)氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽(實施例14；40mg，76.0μ6.0)溶于MeOH(2.5mL)中，加入1MNaOH(304μ0，304NaOH，4當量)。將反應(yīng)在室溫下攪拌18小時后，用1MHCl(350μ5)酸化，并通過反相HPLC(10-50％MeCN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑)直接純化得到28mg的標題化合物(60％，TFA鹽)，其為紅紫色固體。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.36–8.30(m,1H),7.84(td,J＝7.5,1.6Hz,1H),7.79(td,J＝7.6,1.5Hz,1H),7.40–7.36(m,1H),7.12(d,J＝9.2Hz,2H),6.66(dd,J＝9.2,2.2Hz,2H),6.61(d,J＝2.2Hz,2H),4.48(t,J＝9.6Hz,4H),4.39(dd,J＝9.9,5.9Hz,4H),3.72(tt,J＝9.0,5.8Hz,2H)；13CNMR(MeOD,101MHz)δ175.2(C),168.0(C),162.4(C),158.9(C),157.9(C),135.3(C),133.9(CH),132.6(CH),132.5(CH),131.5(CH),131.4(CH),115.4(C),113.8(CH),95.6(CH),55.3(CH2),33.9(CH)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–75％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；550nm處檢測)；HRMS(ESI)C28H23N2O7[M+H]+的計算值499.1500，實驗值499.1507。實施例172-(3,6-二(3-羧甲基氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽使用實施例16中所述的方法由實施例15制備標題化合物(80％，紅紫色固體，TFA鹽)。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.35–8.30(m,1H),7.83(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.78(td,J＝7.6,1.5Hz,1H),7.40–7.35(m,1H),7.07(d,J＝9.2Hz,2H),6.62(dd,J＝9.2,2.2Hz,2H),6.56(d,J＝2.2Hz,2H),4.43(t,J＝9.6Hz,4H),4.05–3.96(m,4H),3.28–3.16(m,2H),2.78(d,J＝7.7Hz,4H)；13CNMR(MeOD,101MHz)δ175.1(C),167.9(C),161.7(C),158.8(C),158.0(C),135.4(C),133.8(CH),132.5(CH),132.3(CH),131.41(CH),131.40(CH),115.1(C),113.7(CH),95.3(CH),57.6(CH2),38.5(CH2),27.3(CH)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；550nm處檢測)；HRMS(ESI)C30H27N2O7[M+H]+的計算值527.1813，實驗值527.1815。實施例184-(叔丁氧基羰基)-2-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽步驟1：將6-羧基熒光素二乙酸酯(1.39g，3.02mmol)在甲苯(6mL)中的懸浮液加熱至80℃，在5分鐘內(nèi)滴加N,N-二甲基甲酰胺二叔丁基縮醛(4.34mL，18.1mmol，6當量)。在80℃下攪拌反應(yīng)15分鐘。冷卻混合物至室溫后，用飽和NaHCO3稀釋并用CH2Cl2(2×)萃取。將合并的有機提取物干燥(MgSO4)、過濾和蒸發(fā)。通過快速色譜(0-20％EtOAc/己烷，線性梯度，恒定的40％v/vCH2Cl2)得到6-(叔丁氧基羰基)-3-氧代-3H-螺[異苯并呋喃-1,9'-呫噸]-3',6'-二基二乙酸酯，其為無色固體(971mg，62％)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.26(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.07(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.73(dd,J＝1.2,0.8Hz,1H),7.12(dd,J＝2.1,0.4Hz,2H),6.84(dd,J＝8.7,2.1Hz,2H),6.80(dd,J＝8.7,0.5Hz,2H),2.32(s,6H),1.56(s,9H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ168.9(C),168.3(C),164.0(C),152.8(C),152.3(C),151.7(C),138.8(C),131.4(CH),129.4(C),129.1(CH),125.2(CH),125.1(CH),118.0(CH),116.0(C),110.6(CH),83.0(C),82.1(C),28.2(CH3),21.3(CH3)；HRMS(ESI)C29H25O9[M+H]+的計算值517.1493，實驗值517.1495。步驟2：向步驟1所得中間體(910mg，1.76mmol)的1：1THF/MeOH(20mL)的溶液中加入1MNaOH(4.23mL，4.23mmol，2.4當量)。將反應(yīng)在室溫下攪拌1小時。將所得的紅橙色溶液用1NHCl(5mL)酸化，用水稀釋，并用EtOAc(2×)萃取。有機物用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，真空濃縮得到紅色固體。將粗固體懸浮于CH2Cl2(15mL)中并冷卻至0℃。加入吡啶(1.14mL，14.1mmol，8當量)和三氟甲磺酸酐(1.19mL，7.05mmol，4當量)，并移除冰浴。將反應(yīng)在室溫下攪拌1小時。隨后用水稀釋并用CH2Cl2(2×)萃取。將合并的有機萃取物干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)。進行硅膠色譜法(0-25％EtOAc/己烷，線性梯度)得到3-氧代-3',6'-二(((三氟甲基)磺?；?氧基)-3H-螺[異苯并呋喃-1,9'-呫噸]-6-羧酸叔丁酯，其為無色固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.28(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.11(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.75(dd,J＝1.2,0.7Hz,1H),7.32(d,J＝2.4Hz,2H),7.04(dd,J＝8.8,2.5Hz,2H),6.94(d,J＝8.8Hz,2H),1.57(s,9H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-73.12(s)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ167.7(C),163.8(C),152.2(C),151.5(C),150.5(C),139.3(C),131.9(CH),130.1(CH),128.8(C),125.8(CH),124.9(CH),118.9(C),118.8(q,1JCF＝320.9Hz,CF3),118.0(CH),111.0(CH),83.3(C),80.5(C),28.2(CH3)；HRMS(ESI)C27H19F6O11S2[M+H]+的計算值697.0267，實驗值697.0255。步驟3：使用實施例7中所述的方法由步驟2中合成的二(三氟甲磺酸酯)制備標題化合物4-(叔丁氧基羰基)-2-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽(86％，深紫色固體)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.19(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),8.02(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.73(dd,J＝1.3,0.7Hz,1H),6.55(d,J＝8.6Hz,2H),6.21(d,J＝2.3Hz,2H),6.09(dd,J＝8.6,2.3Hz,2H),3.92(t,J＝7.3Hz,8H),2.38(p,J＝7.2Hz,4H),1.54(s,9H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ169.1(C),164.5(C),153.8(C),153.0(C),152.6(C),137.9(C),131.1(C),130.6(CH),129.0(CH),125.4(CH),125.0(CH),107.9(CH),107.4(C),97.6(CH),82.4(C),52.2(CH2),28.2(CH3),16.8(CH2)；HRMS(ESI)C31H31N2O5[M+H]+的計算值511.2227，實驗值511.2253。實施例194-羧基-2-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽取4-(叔丁氧基羰基)-2-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽(實施例18；70mg，0.137mmol)溶于CH2Cl2(2.5mL)，并加入三氟乙酸(0.5mL)。在室溫下攪拌反應(yīng)6小時。加入甲苯(3mL)。將反應(yīng)混合物濃縮至干，然后與MeOH共沸三次，得到標題化合物(77mg，99％，TFA鹽)，其為深紅色粉末。分析HPLC和NMR表明該物質(zhì)純度>95％，并且在酰胺偶聯(lián)之前不需要進一步純化。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.40(dd,J＝8.2,0.6Hz,1H),8.37(dd,J＝8.2,1.5Hz,1H),7.94(dd,J＝1.5,0.6Hz,1H),7.06(d,J＝9.2Hz,2H),6.61(dd,J＝9.2,2.2Hz,2H),6.55(d,J＝2.2Hz,2H),4.31(t,J＝7.6Hz,8H),2.56(p,J＝7.6Hz,4H)；19FNMR(MeOD,376MHz)δ-75.32(s)；13CNMR(MeOD,101MHz)δ167.7(C),167.5(C),160.1(C),158.7(C),158.0(C),136.2(C),135.9(C),135.4(C),132.8(CH),132.25(CH),132.24(CH),132.19(CH),114.8(C),113.6(CH),95.2(CH),52.9(CH2),16.8(CH2)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；550nm處檢測)；HRMS(ESI)C27H23N2O5[M+H]+的計算值455.1601，實驗值455.1610。實施例202-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)-4-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)苯甲酸鹽將4-羧基-2-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽(實施例19；20mg，35.2μ5.2)與DSC(19.8mg，77.4μmol，2.2當量)在DMF(1.5mL)中合并。加入Et3N(14.7μ4，1067Lg1，3當量)和DMAP(0.4mg，3.52μ.52，0.1當量)后，將反應(yīng)在室溫下攪拌2小時。通過反相HPLC純化粗反應(yīng)混合物(10-95％MeCN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑)得到18.3mg標題化合物(78％，TFA鹽)，其為深紫色固體。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.47(dd,J＝8.2,1.8Hz,1H),8.42(d,J＝8.2Hz,1H),8.11(d,J＝1.6Hz,1H),7.06(d,J＝9.1Hz,2H),6.60(d,J＝9.1Hz,2H),6.58–6.53(m,2H),4.26(t,J＝7.4Hz,8H),2.91(s,4H),2.44(p,J＝7.7Hz,4H)；分析HPLC:97.4％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；550nm處UV檢測)；MS(ESI)C31H26N3O7[M+H]+的計算值552.2，實驗值552.0。實施例214-((2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙基)氨基甲?；?-2-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽將4-羧基-2-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽(實施例19；10mg，17.6μ7.6)與DSC(9.9mg，38.7μ8.7，2.2當量)在DMF(1mL)中合并。加入Et3N(14.7μ4，1067g]I，6當量)和DMAP(0.2mg，1.76μ.76，0.1當量)后，在室溫下攪拌反應(yīng)1小時，同時避光。然后加入2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙胺(“HaloTag(O2)胺”，9.8mg，44.0μ4.0，2.5當量)的DMF(100μ0)溶液。將反應(yīng)在室溫下再攪拌4小時。隨后用飽和NaHCO3稀釋，并用CH2Cl2(2×)萃取。將合并的有機萃取物干燥(MgSO4)，過濾，沉積在硅藻土上，并真空濃縮。通過硅膠色譜法(0-10％MeOH/CH2Cl2，線性梯度，恒定的1％v/vAcOH添加劑；采用硅藻土干法上樣)以及隨后的反相HPLC(10-95％MeCN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑)得到8.5mg的標題化合物(62％，TFA鹽)，其為暗紅色固體。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.79(t,J＝5.4Hz,1H),8.39(d,J＝8.2Hz,1H),8.20(dd,J＝8.2,1.8Hz,1H),7.80(d,J＝1.6Hz,1H),7.07(d,J＝9.2Hz,2H),6.61(dd,J＝9.2,2.2Hz,2H),6.56(d,J＝2.2Hz,2H),4.31(t,J＝7.6Hz,8H),3.68–3.55(m,8H),3.53(t,J＝6.6Hz,2H),3.43(t,J＝6.5Hz,2H),2.56(p,J＝7.6Hz,4H),1.77–1.66(m,2H),1.56–1.27(m,6H)；19FNMR(MeOD,376MHz)δ-75.33(s)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；550nm處檢測)；HRMS(ESI)C37H43ClN3O6[M+H]+的計算值660.2835，實驗值660.2844。實施例224-((4-(((2-氨基-9H-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-2-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽將4-羧基-2-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)苯甲酸鹽(實施例19；10mg，17.6μ7.6)與DSC(9.9mg，38.7μ8.7，2.2當量)在DMF(1mL)中合并。加入Et3N(14.7μ4，1067g84，6當量)和DMAP(0.2mg，1.76μ.76，0.1當量)后，將反應(yīng)在室溫下攪拌1小時，同時避光。然后加入6-((4-(氨基甲基)芐基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(“BG-NH2”11.9mg，44.0μ4.0，2.5當量)。將反應(yīng)在室溫下再攪拌2小時。通過反相HPLC(10-95％MeCN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑)純化粗反應(yīng)混合物得到11.5mg(80％，TFA鹽)標題化合物，其為深紅色固體。1HNMR(MeOD,400MHz)δ9.28(t,J＝5.8Hz,1H),8.39(d,J＝8.3Hz,1H),8.20(dd,J＝8.2,1.8Hz,1H),8.17(s,1H),7.81(d,J＝1.7Hz,1H),7.50(d,J＝8.1Hz,2H),7.40(d,J＝8.2Hz,2H),7.04(d,J＝9.2Hz,2H),6.58(dd,J＝9.1,2.2Hz,2H),6.54(d,J＝2.1Hz,2H),5.60(s,2H),4.63–4.55(m,2H),4.30(t,J＝7.6Hz,8H),2.56(p,J＝7.7Hz,4H)；19FNMR(MeOD,376MHz)δ-75.44(s)；分析HPLC:98.3％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；550nm處UV檢測)；HRMS(ESI)C40H35N8O5[M+H]+的計算值707.2725，實驗值707.2723。實施例232-(3,6-二(3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)-4-(叔丁氧基羰基)苯甲酸鹽使用實施例7中所述的方法由3-氧代-3',6'-二(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-3H-螺[異苯并呋喃-1,9'-呫噸]-6-羧酸叔丁酯(實施例18，步驟2)和3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷鹽酸鹽制備標題化合物(84％，粉紅色固體)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.21(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.04(dd,J＝8.0,0.8Hz,1H),7.73(dd,J＝1.2,0.8Hz,1H),6.61(d,J＝8.6Hz,2H),6.30(d,J＝2.4Hz,2H),6.17(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),4.25(t,3JHF＝11.7Hz,8H),1.55(s,9H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-100.06(p,3JFH＝11.7Hz)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ168.8(C),164.3(C),153.3(C),152.6(C),151.4(t,4JCF＝2.9Hz,C),138.4(C),130.9(CH),130.2(C),129.3(CH),125.1(CH),125.0(CH),115.7(t,1JCF＝274.5Hz,CF2),109.1(C),108.9(CH),99.4(CH),84.3(C),82.7(C),63.4(t,2JCF＝26.3Hz,CH2),28.2(CH3)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；30–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；550nm處檢測)；MS(ESI)C31H27F4N2O5[M+H]+的計算值583.2，實驗值583.1。實施例242-(3,6-二(3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)-4-羧基苯甲酸鹽使用實施例19中所述的方法由實施例23制備標題化合物(93％，深粉色固體，TFA鹽)。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.44(d,J＝8.3Hz,1H),8.40(dd,J＝8.2,1.6Hz,1H),7.99–7.96(m,1H),7.23(d,J＝9.1Hz,2H),6.83(d,J＝2.2Hz,2H),6.79(dd,J＝9.1,2.3Hz,2H),4.70(t,3JHF＝11.6Hz,8H)；19FNMR(MeOD,376MHz)δ-75.59(s,3F),-100.90(p,3JFH＝11.6Hz,4F)；13CNMR(MeOD,101MHz)δ167.6(C),167.3(C),159.1(C),157.7(t,4JCF＝3.9Hz,C),136.1(C),135.8(C),135.4(C),132.9(CH),132.7(CH),132.6(CH),132.1(CH),119.2(C),116.5(t,1JCF＝271.9Hz,CF2),116.1(C),115.2(CH),97.4(CH),64.2(t,2JCF＝29.1Hz,CH2)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；550nm處檢測)；MS(ESI)C27H19F4N2O5[M+H]+的計算值527.1，實驗值527.0。實施例252-(3,6-二(3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)-4-((2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙基)氨基甲?；?苯甲酸鹽使用實施例21中所述的方法由實施例24制備標題化合物(62％，粉色固體)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.05(dd,J＝8.0,0.8Hz,1H),7.98(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.55(dd,J＝1.5,0.8Hz,1H),6.72(s,1H),6.62(d,J＝8.6Hz,2H),6.31(d,J＝2.4Hz,2H),6.17(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),4.26(t,3JHF＝11.7Hz,8H),3.69–3.57(m,6H),3.56–3.48(m,4H),3.40(t,J＝6.6Hz,2H),1.79–1.70(m,2H),1.54–1.48(m,2H),1.46–1.38(m,2H),1.37–1.29(m,2H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-100.04(p,3JFH＝11.8Hz,4F)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；550nm處檢測)；MS(ESI)C37H39ClF4N3O6[M+H]+的計算值732.2，實驗值732.1。實施例262-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)-4-(甲氧基羰基)苯甲酸鹽步驟1：將3',6'-二溴-3-氧代-3H-螺[異苯并呋喃-1,9'-呫噸]-6-羧酸(1.50g，2.99mmol；Woodroofe,C.C.；Lim,M.H.；Bu,W.；Lippard,S.J.Tetrahedron2005,61,3097)懸浮于MeOH(50mL)中，加入H2SO4(293mg，2.99mmol，1當量)。將反應(yīng)在回流下攪拌72小時。隨后真空濃縮，所得殘余物用飽和NaHCO3稀釋，并用15％i-PrOH/CHCl3(2×)萃取。將合并的有機萃取物干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)。通過硅膠色譜(0-10％EtOAc/己烷，線性梯度，恒定的40％v/vCH2Cl2)得到1.49g(97％)3',6'-二溴-3-氧代-3H-螺[異苯并呋喃-1,9'-呫噸]-6-羧酸甲酯，其為白色固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.31(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.10(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.76(dd,J＝1.2,0.8Hz,1H),7.52(d,J＝1.9Hz,2H),7.20(dd,J＝8.5,1.9Hz,2H),6.68(d,J＝8.5Hz,2H),3.89(s,3H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ168.1(C),165.3(C),153.1(C),151.2(C),137.0(C),131.6(CH),129.24(C),129.21(CH),127.8(CH),125.7(CH),125.1(CH),124.6(C),120.7(CH),117.4(C),81.5(C),53.0(CH3)；MS(ESI)C22H13Br2O5[M+H]+的計算值514.9，實驗值515.1。步驟2：使用實施例7中描述的方法由步驟1中合成的溴化物制備標題化合物2-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)-4-(甲氧羰基)苯甲酸鹽。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.24(dd,J＝8.1,1.7Hz,1H),8.12(dd,J＝8.1,0.4Hz,1H),7.83–7.80(m,1H),7.16(d,J＝9.2Hz,2H),6.56(dd,J＝9.2,2.2Hz,2H),6.48(d,J＝2.2Hz,2H),4.32–4.22(m,8H),3.90(s,3H),2.54(p,J＝7.6Hz,4H)；MS(ESI)C28H25N2O5[M+H]+的計算值469.2，實驗值469.2。實施例273',6'-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-2-重氮基-3-氧代-2,3-二氫螺[茚-1,9'-呫噸]-6-羧酸甲酯向2-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)呫噸鎓-9-基)-4-(甲氧基羰基)苯甲酸鹽(實施例26；135mg，0.288mmol)的CH2Cl2(9mL)溶液中加入草酰氯(98μ8，1.15mmol，4當量)。室溫下攪拌反應(yīng)2小時后，將反應(yīng)物濃縮至干。將殘余物再溶于CH2Cl2(9mL)中，然后依次加入Et3N(50μ0，0.360mmol，1.25當量)和(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷(2.0M，溶于Et2O，252μ5，0.504mmol，1.75當量)。將反應(yīng)在室溫下攪拌90分鐘，真空濃縮，并通過硅膠快速色譜(0-50％EtOAc/己烷，線性梯度；然后，0-25％EtOAc/甲苯，線性梯度)純化兩次得到40mg(28％)標題化合物，其為黃色固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.07(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.87(dd,J＝8.0,0.6Hz,1H),7.68(dd,J＝1.4,0.6Hz,1H),6.66(d,J＝8.5Hz,2H),6.18(d,J＝2.3Hz,2H),6.07(dd,J＝8.5,2.4Hz,2H),3.96–3.84(m,8H),3.82(s,3H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H)；MS(ESI)C29H25N4O4[M+H]+的計算值493.2，實驗值493.3。實施例283',6'-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-2-重氮基-3-氧代-2,3-二氫螺[茚-1,9'-呫噸]-6-羧酸2,5-二氧吡咯烷-1-基酯步驟1：向3',6'-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-2-重氮基-3-氧代-2,3-二氫螺[茚-1,9'-呫噸]-6-羧酸甲酯(實施例27；40mg，81.2μmol)在2:1MeOH/THF(6mL)中的溶液中氮氣保護下加入1MNaOH(203μL，0.203mmol，2.5當量)。在室溫下攪拌溶液2小時后，加入另外的1MNaOH(203μL，0.203mmol，2.5當量)。將反應(yīng)在室溫下攪拌24小時。隨后用1MHCl(420μL)酸化，用水稀釋，并用CH2Cl2(2×)萃取。將有機萃取物干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮，得到3',6'-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-2-重氮基-3-氧代-2,3-二氫螺[茚-1,9'-呫噸]-6-羧酸(37mg，95％)，其為黃色固體。MS(ESI)C28H23N4O4[M]+的計算值479.2，實驗值479.3。步驟2：將步驟1所得的酸(37mg，77.3μ7.3)與TSTU(35mg，0.116mmol，1.5當量)在DMF(2mL)中合并，并加入DIEA(40μ0，0.232mmol，3當量)。將反應(yīng)在室溫下攪拌1小時后，濃縮至干并沉積在硅藻土上。進行硅膠快速色譜法(10-100％EtOAc/己烷，線性梯度；采用硅藻土干法上樣)，得到標題化合物3',6'-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-2-重氮基-3-氧代-2,3-二氫螺[茚-1,9'-呫噸]-6-羧酸2,5-二氧吡咯烷-1-基酯，其為黃橙色固體(30mg，68％)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.16(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.93(dd,J＝8.0,0.6Hz,1H),7.75(dd,J＝1.4,0.6Hz,1H),6.66(d,J＝8.5Hz,2H),6.16(d,J＝2.3Hz,2H),6.09(dd,J＝8.5,2.4Hz,2H),3.90(t,J＝7.3Hz,8H),2.86(s,4H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H)；MS(ESI)C32H26N5O6[M+H]+的計算值576.2，實驗值576.3。實施例293',6'-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-N-(2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙基)-2-重氮基-3-氧代-2,3-二氫螺[茚-1,9'-呫噸]-6-甲酰胺將3',6'-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-2-重氮基-3-氧代-2,3-二氫螺[茚-1,9'-呫噸]-6-羧酸2,5-二氧吡咯烷-1-基酯(實施例28；15mg，26.1μ6.1)溶于DMF(1mL)中。加入2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙胺(“HaloTag(O2)胺”，11.7mg，52.2μ2.2，2當量)的DMF(250μ5)溶液，然后加入DIEA(22.7μ2，0.131mmol，5當量)。在室溫下攪拌反應(yīng)2小時后，將其濃縮至干，并通過硅膠色譜法(0-100％EtOAc/甲苯，線性梯度)純化，得到標題化合物(15.9mg，89％)，其為黃色泡沫狀物。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.86(dd,J＝7.9,0.6Hz,1H),7.79(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.43(dd,J＝1.4,0.6Hz,1H),6.66(d,J＝8.5Hz,2H),6.59(t,J＝5.1Hz,1H),6.16(d,J＝2.3Hz,2H),6.07(dd,J＝8.5,2.4Hz,2H),3.95–3.83(m,8H),3.64–3.48(m,10H),3.39(t,J＝6.6Hz,2H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H),1.78–1.69(m,2H),1.55–1.48(m,2H),1.46–1.36(m,2H),1.36–1.27(m,2H)；MS(ESI)C38H43ClN5O5[M+H]+的計算值684.3，實驗值684.4。實施例302-(3,7-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅雜苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸鹽步驟1：向小瓶中加入2-溴苯甲酸叔丁酯(309mg，1.20mmol，1.5當量)，密封并用氮氣沖洗。將溴化物溶解在THF(2mL)中并將反應(yīng)冷卻至-15℃后，加入iPrMgCl·LiCl(1.3M的THF溶液，924μ2，1.20mmol，1.5當量)。將反應(yīng)升溫至-5℃并攪拌5小時。滴加3,7-二((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅雜苯-10(5H)-酮(400mg，0.802mmol；來自Egawa,T.；Koide,Y.；Hanaoka,K.；Komatsu,T.；Terai,T.；Nagano,T.Chem.Commun.,2011,47,4162)的THF(2mL)溶液。在-5℃下攪拌10分鐘后，將反應(yīng)混合物溫熱至室溫并攪拌30分鐘。隨后用飽和NH4Cl淬滅，用水稀釋，并用EtOAc(2×)萃取。將合并的有機物用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)。通過硅膠色譜法(0-20％Et2O/己烷，線性梯度)得到271mg(56％)3,7-二((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5,5-二甲基-3’H，5H-螺[二苯并[b，e]硅雜苯-10,1'-異苯并呋喃]-3'-酮，其為無色膠狀物。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.97(dt,J＝7.5,0.9Hz,1H),7.66(td,J＝7.5,1.2Hz,1H),7.56(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),7.35–7.29(m,1H),7.12(d,J＝2.7Hz,2H),6.85(d,J＝8.7Hz,2H),6.67(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),0.97(s,18H),0.62(s,3H),0.60(s,3H),0.19(s,12H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ170.5(C),155.3(C),154.0(C),137.8(C),137.2(C),134.0(CH),129.1(CH),128.6(CH),126.6(C),126.1(CH),125.1(CH),124.7(CH),121.2(CH),90.8(C),25.8(CH3),18.4(C),0.2(CH3),-1.5(CH3),-4.21(CH3),-4.23(CH3)；HRMS(ESI)C34H47O4Si3[M+H]+的計算值603.2777，實驗值603.2771。步驟2：在0℃下，向步驟1產(chǎn)物(194mg，0.322mmol)的THF(5mL)溶液中加入TBAF(1.0M的THF溶液，965μL，0.965mmol，3當量)。將反應(yīng)在0℃下攪拌10分鐘。隨后在0℃下用飽和NH4Cl稀釋，并用EtOAc(2×)萃取。將有機萃取物干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)，并沉積到硅膠上。通過快速色譜法(20-100％EtOAc/己烷，線性梯度，恒定的1％v/vAcOH添加劑；采用硅膠干法上樣)得到3,7-二羥基-5,5-二甲基-3'H,5H-螺[二苯并[b,e]硅雜苯-10,1'-異苯并呋喃]-3'-酮(120mg，99％)，其為灰白色固體。1HNMR(MeOD,400MHz)δ7.95(d,J＝7.7Hz,1H),7.77(td,J＝7.6,1.1Hz,1H),7.65(td,J＝7.6,0.7Hz,1H),7.32(d,J＝7.7Hz,1H),7.13(d,J＝2.7Hz,2H),6.74(d,J＝8.7Hz,2H),6.65(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),0.61(s,3H),0.55(s,3H)；13CNMR(MeOD,101MHz)δ172.6(C),158.3(C),155.8(C),138.8(C),136.3(C),135.6(CH),130.4(CH),129.6(CH),127.4(C),126.6(CH),125.8(CH),121.1(CH),117.7(CH),92.9(C),0.2(CH3),-1.6(CH3)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；550nm處UV檢測)；HRMS(ESI)C22H19O4Si[M+H]+的計算值375.1047，實驗值375.1047。步驟3：取步驟2所得的中間體(120mg，0.320mmol)溶于CH2Cl2(5mL)中并冷卻至0℃。加入吡啶(207μL，2.56mmol，8.0當量)和三氟甲磺酸酐(216μL，1.28mmol，4.0當量)，并移除冰浴。將反應(yīng)在室溫下攪拌2小時。隨后用水稀釋并用CH2Cl2(2×)萃取。將合并的有機萃取物用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮。通過硅膠快速色譜法(0-30％EtOAc/己烷，線性梯度)得到172mg(84％)5,5-二甲基-3'-氧代-3'H,5H-螺[二苯并[b,e]硅雜苯-10,1'-異苯并呋喃]-3,7-二基二(三氟甲磺酸酯)，其為無色泡沫狀物。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.04(dt,J＝7.7,0.9Hz,1H),7.77(td,J＝7.5,1.2Hz,1H),7.66(td,J＝7.5,0.8Hz,1H),7.57(dd,J＝2.4,0.5Hz,2H),7.38(dt,J＝7.6,0.7Hz,1H),7.185(ABofABX,A＝2878.9,JAX＝0.3,B＝2871.0,JBX＝2.8,JAB＝8.9Hz,4H),0.75(s,3H),0.72(s,3H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-73.30；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ169.2(C),151.8(C),149.5(C),144.3(C),139.3(C),134.8(CH),130.3(CH),129.2(CH),127.0(CH),126.5(CH),126.0(C),124.6(CH),122.8(CH),118.9(CF3,1JCF＝320.8Hz),88.7(C),0.1(CH3),-1.7(CH3)；HRMS(ESI)C24H17F6O8S2Si[M+H]+的計算值639.0033，實驗值639.0030。步驟4：使用實施例7中描述的方法由步驟3中合成的二(三氟甲磺酸酯)制備標題化合物2-(3,7-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅雜苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸鹽(92％，灰白色固體)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.98–7.93(m,1H),7.63(td,J＝7.5,1.2Hz,1H),7.53(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),7.32–7.28(m,1H),6.75(d,J＝8.7Hz,2H),6.66(d,J＝2.6Hz,2H),6.25(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),3.89(t,J＝7.2Hz,8H),2.36(p,J＝7.2Hz,4H),0.60(s,3H),0.58(s,3H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ170.7(C),154.3(C),151.0(C),137.1(C),133.7(CH),132.9(C),128.8(CH),128.0(CH),127.2(C),125.8(CH),124.8(CH),115.7(CH),112.3(CH),92.1(C),52.4(CH2),17.1(CH2),0.5(CH3),-1.5(CH3)；分析HPLC:98.7％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；650nm處檢測)；HRMS(ESI)C28H29N2O2Si[M+H]+的計算值453.1993，實驗值453.1998。實施例312-(3,7-二(3-氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅雜苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸鹽使用實施例7種所述的方法，從5,5-二甲基-3'-氧代-3'H,5H-螺[二苯并[b,e]硅雜苯-10,1'-異苯并呋喃]-3,7-二基二(三氟甲磺酸酯)(實施例30，步驟3)和3-氟氮雜環(huán)丁烷鹽酸鹽(78％，灰白色固體)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.97(dt,J＝7.6,0.9Hz,1H),7.65(td,J＝7.5,1.2Hz,1H),7.55(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),7.29(dt,J＝7.7,0.8Hz,1H),6.80(d,J＝8.7Hz,2H),6.70(d,J＝2.6Hz,2H),6.30(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),5.41(dtt,2JHF＝57.0Hz,J＝5.9,3.7Hz,2H),4.25–4.14(m,4H),4.04–3.91(m,4H),0.62(s,3H),0.60(s,3H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-180.48(dtt,JFH＝57.0,23.9,18.2Hz)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ170.6(C),154.1(C),150.0(d,4JCF＝1.0Hz,C),137.2(C),133.93(C),133.86(CH),129.0(CH),128.1(CH),127.0(C),126.0(CH),124.7(CH),116.3(CH),112.9(CH),91.6(C),82.8(d,1JCF＝204.8Hz,CFH),59.6(d,2JCF＝23.8Hz,CH2),0.5(CH3),-1.4(CH3)；分析HPLC:98.7％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；30–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；650nm處檢測)；MS(ESI)C28H27F2N2O2Si[M+H]+的計算值489.2，實驗值489.1。實施例324-(叔丁氧基羰基)-2-(3,7-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅雜苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸鹽步驟1：將2-溴對苯二甲酸(2.50g，10.2mmol)的甲苯(25mL)懸浮液加熱至80℃，在15分鐘內(nèi)滴加N,N-二甲基甲酰胺二叔丁基縮醛(24.5mL，102mmol，10當量)。將反應(yīng)在80℃下攪拌30分鐘。冷卻混合物至室溫后，用飽和NaHCO3稀釋，并用EtOAc(2×)萃取。將合并的有機萃取物用水和鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)。通過快速色譜(0-10％Et2O/己烷，線性梯度)得到2-溴對苯二甲酸二叔丁酯，其為無色膠狀物(3.29g，90％)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.19(d,J＝1.4Hz,1H),7.92(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.67(d,J＝8.0Hz,1H),1.62(s,9H),1.60(s,9H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ165.4(C),163.8(C),138.0(C),135.1(C),134.9(CH),130.4(CH),128.1(CH),120.7(C),83.3(C),82.3(C),28.26(CH3),28.25(CH3)；HRMS(ESI)C16H21BrO4Na[M+Na]+的計算值379.0515，實驗值379.0531。步驟2：向小瓶中加入步驟1的產(chǎn)物(537mg，1.50mmol，1.5當量)，密封并用氮氣沖洗。將溴化物溶解在THF(2.5mL)中并將反應(yīng)冷卻至-50℃后，加入iPrMgCl·LiCl(1.3M的THF溶液，1.16mL，1.50mmol，1.5當量)。將反應(yīng)升溫至-40℃并攪拌2小時。然后滴加3,7-二((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅雜苯-10(5H)-酮(500mg，1.00mmol；來自Egawa,T.；Koide,Y.；Hanaoka,K.；Komatsu,T.；Terai,T.；Nagano,T.Chem.Commun.,2011,47,4162)的THF(2.5mL)溶液。將反應(yīng)混合物升溫至室溫并攪拌2小時。隨后用飽和NH4Cl淬滅，用水稀釋，并用EtOAc(2×)萃取。將合并的有機物用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)。通過硅膠色譜法(0-10％Et2O/己烷，線性梯度)得到213mg(30％)的3,7-二((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5,5-二甲基-3'-氧代-3'H,5H-螺[二苯并[b,e]硅雜苯-10,1'-異苯并呋喃]-6'-羧酸叔丁酯，其為無色固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.13(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),7.98(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.84(dd,J＝1.2,0.8Hz,1H),7.13(d,J＝2.7Hz,2H),6.93(d,J＝8.7Hz,2H),6.72(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),1.56(s,9H),0.98(s,18H),0.67(s,3H),0.59(s,3H),0.196(s,6H),0.194(s,6H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ170.1(C),164.3(C),155.4(C),155.0(C),137.5(C),136.9(C),136.8(C),130.2(CH),128.7(C),128.3(CH),125.9(CH),125.2(CH),125.1(CH),121.6(CH),90.6(C),82.5(C),28.2(CH3),25.8(CH3),18.4(C),-0.1(CH3),-0.7(CH3),-4.21(CH3),-4.23(CH3)；HRMS(ESI)C39H55O6Si3[M+H]+的計算值703.3301，實驗值703.3311。步驟3：在0℃下，向得自步驟2的產(chǎn)物(205mg，0.292mmol)的THF(5mL)溶液中加入TBAF(1.0M的THF溶液，1.17mL，1.17mmol，4當量)。在0℃下攪拌反應(yīng)10分鐘。隨后用飽和NH4Cl稀釋并用EtOAc(2×)萃取。有機萃取液用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)，得到橙色殘余物。將粗中間體溶于CH2Cl2(5mL)中并冷卻至0℃。加入吡啶(189μL，2.33mmol，8當量)和三氟甲磺酸酐(196μL，1.17mmol，4當量)，并移除冰浴。在室溫下攪拌反應(yīng)2小時。然后用水稀釋并用CH2Cl2(2×)萃取。將合并的有機物用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮。通過硅膠快速色譜法(0-20％EtOAc/己烷，線性梯度)得到209mg(97％)5,5-二甲基-3'-氧代-3,7-二(((三氟甲基)磺?；?氧基)-3'H,5H-螺[二苯并[b,e]硅雜苯-10,1'-異苯并呋喃]-6'-羧酸叔丁酯，其為無色固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.21(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.05(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.93–7.90(m,1H),7.58(d,J＝2.6Hz,2H),7.28(d,J＝8.9Hz,2H),7.22(dd,J＝8.9,2.7Hz,2H),1.58(s,9H),0.81(s,3H),0.71(s,3H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-73.28(s)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ168.9(C),163.8(C),152.8(C),149.5(C),144.1(C),138.3(C),138.2(C),131.2(CH),128.8(CH),128.0(C),126.8(CH),126.6(CH),124.8(CH),123.2(CH),118.9(q,1JCF＝320.8Hz,CF3),88.6(C),83.1(C),28.2(CH3),-0.1(CH3),-0.9(CH3)；HRMS(ESI)C29H25F6O10S2Si[M+H]+的計算值739.0557，實驗值739.0555。步驟4：使用實施例7中所述的方法制備標題化合物4-(叔丁氧基羰基)-2-(3,7-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅雜苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸鹽(91％，灰白色泡沫狀物)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.11(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),7.95(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.82(dd,J＝1.2,0.8Hz,1H),6.82(d,J＝8.7Hz,2H),6.66(d,J＝2.6Hz,2H),6.29(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),3.90(t,J＝7.3Hz,8H),2.36(p,J＝7.2Hz,4H),1.54(s,9H),0.64(s,3H),0.58(s,3H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ170.3(C),164.5(C),155.4(C),151.0(C),137.2(C),136.2(C),132.4(C),129.9(CH),129.2(C),127.7(CH),125.6(CH),125.2(CH),115.6(CH),112.6(CH),91.9(C),82.3(C),52.3(CH2),28.2(CH3),17.0(CH2),0.2(CH3),-0.7(CH3)；HRMS(ESI)C33H37N2O4Si[M+H]+的計算值553.2517，實驗值553.2529。實施例334-羧基-2-(3,7-二(氮雜環(huán)丁-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅雜苯鎓-10-基)-10(5H)-基)苯甲酸鹽使用實施例19中所述的方法，由實施例32制備標題化合物(99％，深藍綠色固體，TFA鹽)。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.30–8.23(m,2H),7.82–7.78(m,1H),6.90(d,J＝2.5Hz,2H),6.86(d,J＝9.2Hz,2H),6.33(dd,J＝9.2,2.5Hz,2H),4.27(t,J＝7.4Hz,8H),2.51(p,J＝7.6Hz,4H),0.60(s,3H),0.53(s,3H)；19FNMR(MeOD,376MHz)δ-75.45(s)；HPLC:>98.7％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；650nm處檢測)；HRMS(ESI)C29H29N2O4Si[M+H]+的計算值497.1891，實驗值497.1890。實施例342(3,7-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅雜苯鎓-10-基)-10(5H)-基)-4(((2,5-二氧吡咯烷-1-基)氧基)羰基)苯甲酸鹽4-羧基-2-(3,7-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅雜苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸鹽(實施例33；40mg，65.5μmol)與DSC(37mg，144μmol，2.2當量)在DMF(2.5mL)中合并。加入Et3N(55μL，393μmol，6當量)和DMAP(0.8mg，6.55μmol，0.1當量)后，將反應(yīng)在室溫下攪拌3小時。隨后用10％w/v檸檬酸稀釋并用EtOAc(2×)萃取。將合并的有機萃取物用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮。通過快速色譜法(0-50％EtOAc/甲苯，線性梯度)得到31mg(80％)標題化合物，其為黃綠色固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.27(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),8.07(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),8.00(dd,J＝1.3,0.7Hz,1H),6.74(d,J＝8.7Hz,2H),6.66(d,J＝2.6Hz,2H),6.30(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),3.91(t,J＝7.3Hz,8H),2.89(s,4H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H),0.62(s,3H),0.56(s,3H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ169.4(C),169.0(C),161.1(C),155.5(C),151.2(C),136.5(C),131.7(C),131.6(C),130.7(CH),130.1(C),127.8(CH),126.8(CH),126.3(CH),115.8(CH),112.7(CH),92.4(C),52.3(CH2),25.8(CH2),17.0(CH2),0.3(CH3),-1.1(CH3)；HRMS(ESI)C33H32N3O6Si[M+H]+的計算值594.2055，實驗值594.2069。實施例354-((2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙基)氨基甲?；?-2-(3,7-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅雜苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸鹽4-羧基-2-(3,7-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅雜苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸鹽(實施例33；30mg，49.1μmol)與DSC(28mg，108μ08g，2.2當量)在DMF(2mL)中合并。加入Et3N(41μ1，295。加入6，6當量)和DMAP(0.6mg，4.91μ.91，0.1當量)后，將反應(yīng)在室溫下攪拌1小時，同時避光。然后加入2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙胺(“HaloTag(O2)胺”，27mg，123μ23g，2.5當量)的DMF(250μL)溶液。將反應(yīng)在室溫下再攪拌2小時。隨后用飽和NaHCO3稀釋并用EtOAc(2×)萃取。將合并的有機萃取物用水和鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮。通過硅膠色譜法(10-100％EtOAc/甲苯，線性梯度)得到25mg(73％)標題化合物，其為藍色泡沫狀物。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.98(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.90(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.68(dd,J＝1.2,0.7Hz,1H),6.75(d,J＝8.7Hz,2H),6.74–6.68(m,1H),6.66(d,J＝2.6Hz,2H),6.26(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),3.89(t,J＝7.3Hz,8H),3.67–3.60(m,6H),3.56–3.53(m,2H),3.50(t,J＝6.7Hz,2H),3.39(t,J＝6.7Hz,2H),2.36(p,J＝7.2Hz,4H),1.78–1.68(m,2H),1.56–1.47(m,2H),1.44–1.35(m,2H),1.35–1.25(m,2H),0.63(s,3H),0.57(s,3H)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O,線性梯度,恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；650nm處UV檢測)；HRMS(ESI)C39H49ClN3O5Si[M+H]+的計算值702.3125，實驗值702.3137。實施例364-((4-((2-氨基-9H-嘌呤-6-基)氧基)甲基)芐基)氨基甲?；?-2-(3,7-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)二甲基二苯并[b,e]硅雜苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸鹽4-羧基-2-(3,7-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅雜苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸鹽(實施例33；25mg，40.9μ0.9)與DSC(23.1mg，90.1μ0.1，2.2當量)在DMF(2mL)中合并。加入Et3N(34μ4，246。加入3，6當量)和DMAP(0.5mg，4.09μ.09，0.1當量)后，將反應(yīng)在室溫下攪拌1小時，同時避光。然后加入6-((4-(氨基甲基)芐基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(“BG-NH2”28mg，102μmol，2.5當量)。將反應(yīng)在室溫下再攪拌2小時。隨后用飽和NaHCO3稀釋，并用CH2Cl2(2×)萃取。將合并的有機萃取物干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮。通過硅膠色譜法(0-10％MeOH/EtOAc，線性梯度)得到24.7mg(80％)標題化合物，其為藍色固體。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.02(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),7.99(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.82(s,1H),7.67–7.64(m,1H),7.46(d,J＝8.1Hz,2H),7.32(d,J＝8.2Hz,2H),6.73(d,J＝2.6Hz,2H),6.70(d,J＝8.7Hz,2H),6.32(dd,J＝8.7,2.6Hz,2H),5.51(s,2H),4.52(s,2H),3.87(t,J＝7.3Hz,8H),2.35(p,J＝7.1Hz,4H),0.58(s,3H),0.51(s,3H)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O,線性梯度,恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；650nm處UV檢測)；HRMS(ESI)C42H41N8O4Si[M+H]+的計算值749.3015，實驗值749.2971。實施例372-(3,7-二(3-氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅雜苯鎓-10-基-10(5H)-基)-4-(叔丁氧羰基)苯甲酸鹽使用實施例7中所述的方法，由5,5-二甲基-3'-氧代-3,7-二(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-3'H,5H-螺[二苯并[b,e]硅雜苯-10,1'-異苯并呋喃]-6'-羧酸叔丁酯(實施例32，步驟3)和3-氟氮雜環(huán)丁烷鹽酸鹽制備標題化合物(85％，灰白色固體)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.12(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),7.97(dd,J＝7.9,0.8Hz,1H),7.82(dd,J＝1.3,0.8Hz,1H),6.88(d,J＝8.7Hz,2H),6.70(d,J＝2.6Hz,2H),6.35(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),5.41(dtt,2JHF＝57.0,5.9,3.7Hz,2H),4.26–4.15(m,4H),4.05–3.93(m,4H),1.55(s,9H),0.67(s,3H),0.60(s,3H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-180.48(dtt,JFH＝57.0,23.9,18.2Hz)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ170.2(C),164.4(C),155.1(C),150.0(d,4JCF＝1.2Hz,C),137.4(C),136.3(C),133.5(C),130.1(CH),129.0(C),127.8(CH),125.8(CH),125.1(CH),116.3(CH),113.3(CH),91.4(C),82.8(d,1JCF＝204.8,CFH),82.5(C),59.6(d,2JCF＝23.8Hz,CH2),28.2(CH3),0.17(CH3),-0.68(CH3)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；50–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；633nm處檢測)；MS(ESI)C33H35F2N2O4Si[M+H]+的計算值589.2，實驗值589.2。實施例382-(3,7-二(3-氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅雜苯鎓-10-基-10(5H)-基)-4-羧基苯甲酸鹽使用實施例19中所述的方法由實施例37制備標題化合物(80％，深藍色固體，TFA鹽)。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.25(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),8.11(d,J＝8.1Hz,1H),7.84(dd,J＝1.4,0.7Hz,1H),6.87(d,J＝2.6Hz,2H),6.83(d,J＝8.8Hz,2H),6.39(dd,J＝8.9,2.6Hz,2H),5.43(dtt,2JHF＝57.3,6.1,3.3Hz,2H),4.41–4.20(m,4H),4.16–4.01(m,4H),0.65(s,3H),0.56(s,3H)；分析HPLC:88.1％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；633nm處檢測)；MS(ESI)C29H27F2N2O4Si[M+H]+的計算值533.2，實驗值533.0。實施例392-(3,7-二(3-氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅雜苯鎓-10-基-10(5H)-基)-4-((2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙基)氨基甲?；?苯甲酸鹽使用實施例35中所述的方法，由實施例38制備標題化合物(61％，藍綠色固體)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.99(dd,J＝7.9,0.7Hz,1H),7.89(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.69(dd,J＝1.4,0.8Hz,1H),6.81(d,J＝8.7Hz,2H),6.78(s,1H),6.69(d,J＝2.6Hz,2H),6.36–6.26(m,2H),5.41(dtt,2JHF＝56.9,5.9,3.7Hz,2H),4.29–4.13(m,4H),4.06–3.91(m,4H),3.67–3.60(m,6H),3.58–3.53(m,2H),3.50(t,J＝6.6Hz,2H),3.40(t,J＝6.7Hz,2H),1.79–1.67(m,2H),1.54–1.47(m,2H),1.45–1.35(m,2H),1.35–1.24(m,2H),0.66(s,3H),0.59(s,3H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-180.49(dtt,JFH＝56.9,23.9,18.2Hz)；分析HPLC:98.7％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；633nm處檢測)；MS(ESI)C39H47ClF2N3O5Si[M+H]+的計算值738.3，實驗值738.2。實施例402-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)苯甲酸鹽使用實施例7中所述的方法由碳熒光素二(三氟甲磺酸酯)(Grimm,J.B.；Sung,A.J.；Legant,W.R.；Hulamm,P.；Matlosz,S.M.；Betzig,E.；Lavis,L.D.ACSChem.Biol.2013,8,1303)制備標題化合物(88％，淡藍色固體)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.00–7.95(m,1H),7.58(td,J＝7.4,1.4Hz,1H),7.53(td,J＝7.4,1.2Hz,1H),7.08–7.03(m,1H),6.58(d,J＝2.4Hz,2H),6.55(d,J＝8.5Hz,2H),6.20(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),3.90(t,J＝7.2Hz,8H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H),1.82(s,3H),1.72(s,3H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ170.9(C),155.6(C),152.4(C),146.9(C),134.5(CH),128.94(CH),128.89(CH),127.4(C),125.0(CH),124.1(CH),120.6(C),110.4(CH),107.9(CH),88.4(C),52.4(CH2),38.6(C),35.7(CH3),32.3(CH3),17.0(CH2)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；600nm處檢測)；HRMS(ESI)C29H29N2O2[M+H]+的計算值437.2224，實驗值437.2236。實施例412-(3,6-二(3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)苯甲酸鹽使用實施例7中所述的方法由碳熒光素二(三氟甲磺酸酯)(Grimm,J.B.；Sung,A.J.；Legant,W.R.；Hulamm,P.；Matlosz,S.M.；Betzig,E.；Lavis,L.D.ACSChem.Biol.2013,8,1303)和3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷鹽酸鹽制備標題化合物(95％，灰白色固體)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.04–7.98(m,1H),7.60(td,J＝7.3,1.5Hz,1H),7.56(td,J＝7.3,1.3Hz,1H),7.04(s,1H),6.64(d,J＝2.8Hz,2H),6.63(d,J＝8.7Hz,2H),6.28(dd,J＝8.6,2.5Hz,2H),4.25(t,3JHF＝11.8Hz,8H),1.84(s,3H),1.74(s,3H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-99.95(p,3JFH＝11.8Hz)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ170.6(C),155.2(C),150.1(t,4JCF＝2.7Hz,C),146.9(C),134.8(CH),129.3(CH),129.2(CH),127.0(C),125.2(CH),123.9(CH),122.4(C),115.9(t,1JCF＝274.6Hz,CF2),111.6(CH),109.2(CH),87.2(C),63.4(t,2JCF＝25.9Hz,CH2),38.6(C),35.6(CH3),32.5(CH3)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；30–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；600nm處檢測)；MS(ESI)C29H25F4N2O2[M+H]+的計算值509.2，實驗值509.1。實施例424-(叔丁氧基羰基)-2-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)苯甲酸鹽步驟1：向小瓶中裝入2-溴對苯二甲酸二叔丁酯(實施例32，步驟1；1.48g，4.14mmol，2當量)，密封并用氮氣沖洗。將溴化物溶解在THF(7mL)中并將反應(yīng)冷卻至-15℃后，加入iPrMgCl·LiCl(1.3M的THF溶液，3.19mL，4.14mmol，2當量)。將反應(yīng)升溫至-10℃并攪拌4小時。滴加3,6-二((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-10,10-二甲基蒽-9(10H)-酮(1.00g，2.07mmol；來自Grimm,J.B.；Sung,A.J.；Legant,W.R.；Hulamm,P.；Matlosz,S.M.；Betzig,E.；Lavis,L.D.ACSChem.Biol.2013,8,1303)的THF(4mL)溶液。將反應(yīng)混合物升溫至室溫并攪拌2小時。隨后用飽和NH4Cl淬滅，用水稀釋，并用EtOAc(2×)萃取。將合并的有機物用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)。通過硅膠色譜法(0-10％Et2O/己烷，線性梯度)得到245mg(17％)3,6-二((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-10,10-二甲基-3'-氧代-3'H,10H-螺[蒽-9,1'-異苯并呋喃]-6'-羧酸叔丁酯，其為無色固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.16(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.02(dd,J＝8.0,0.6Hz,1H),7.63–7.59(m,1H),7.09–7.05(m,2H),6.64–6.57(m,4H),1.81(s,3H),1.72(s,3H),1.54(s,9H),0.99(s,18H),0.22(s,12H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ169.9(C),164.4(C),156.5(C),155.5(C),147.0(C),138.1(C),130.3(CH),129.7(C),129.3(CH),125.1(CH),125.0(CH),124.0(C),119.2(CH),117.8(CH),87.0(C),82.5(C),38.2(C),35.0(CH3),33.2(CH3),28.2(CH3),25.8(CH3),18.4(C),-4.17(CH3),-4.19(CH3)；HRMS(ESI)C40H55O6Si2[M+H]+的計算值687.3537，實驗值687.3533。步驟2：向步驟1的產(chǎn)物(170mg，0.247mmol)的THF(5mL)溶液中加入TBAF(1.0M的THF溶液，990μL，0.990mmol，4當量)。將反應(yīng)在室溫下攪拌10分鐘。隨后用飽和NH4Cl稀釋并用EtOAc(2×)萃取。有機萃取物用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)得到橙色殘余物。取粗中間體溶于CH2Cl2(5mL)中并冷卻至0℃。加入吡啶(160μL，1.98mmol，8當量)和三氟甲磺酸酐(167μL，0.990mmol，4當量)，并移除冰浴。將反應(yīng)在室溫下攪拌2小時。然后用水稀釋并用CH2Cl2(2×)萃取。將合并的有機物用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮。通過硅膠快速色譜(0-20％EtOAc/己烷，線性梯度)得到159mg(89％)10,10-二甲基-3'-氧代-3,6-二(((三氟甲基)磺?；?氧基)-3'H,10H-螺[蒽-9,1'-異苯并呋喃]-6'-羧酸叔丁酯，其為無色固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.24(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.11(dd,J＝8.0,0.6Hz,1H),7.63–7.60(m,1H),7.56(d,J＝2.5Hz,2H),7.10(dd,J＝8.8,2.5Hz,2H),6.88(d,J＝8.8Hz,2H),1.91(s,3H),1.81(s,3H),1.56(s,9H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-73.20(s)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ168.8(C),163.9(C),153.9(C),150.4(C),147.2(C),138.9(C),131.4(CH),131.1(C),130.3(CH),128.8(C),125.9(CH),124.7(CH),120.6(CH),119.8(CH),118.9(q,1JCF＝320.9Hz,CF3),84.3(C),83.1(C),39.0(C),34.8(CH3),33.2(CH3),28.2(CH3)；HRMS(ESI)C30H25F6O10S2[M+H]+的計算值723.0793，實驗值723.0797。步驟3：使用實施例7中描述的方法由步驟2中合成的二(三氟甲磺酸酯)制備標題化合物4-(叔丁氧基羰基)-2-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)苯甲酸鹽(84％，藍色固體)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.14(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.00(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.61(dd,J＝1.3,0.8Hz,1H),6.58(d,J＝2.3Hz,2H),6.54(d,J＝8.6Hz,2H),6.21(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),3.91(t,J＝7.2Hz,8H),2.38(p,J＝7.2Hz,4H),1.83(s,3H),1.73(s,3H),1.53(s,9H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ170.1(C),164.6(C),155.6(C),152.4(C),146.8(C),137.8(C),130.3(C),130.1(CH),128.9(CH),125.1(CH),124.8(CH),119.9(C),110.5(CH),108.0(CH),88.8(C),82.3(C),52.3(CH2),38.5(C),35.5(CH3),32.8(CH3),28.2(CH3),17.0(CH2)；HRMS(ESI)C34H37N2O4[M+H]+的計算值537.2753，實驗值537.2768。實施例434-羧基-2-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)苯甲酸鹽使用實施例19中描述的方法由實施例42制備標題化合物(98％，深藍色固體，TFA鹽)。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.34(dd,J＝8.2,0.5Hz,1H),8.31(dd,J＝8.2,1.5Hz,1H),7.84(dd,J＝1.5,0.5Hz,1H),6.93(d,J＝9.1Hz,2H),6.82(d,J＝2.2Hz,2H),6.39(dd,J＝9.1,2.3Hz,2H),4.33(t,J＝7.6Hz,8H),2.55(p,J＝7.6Hz,4H),1.82(s,3H),1.70(s,3H)；19FNMR(MeOD,376MHz)δ-75.24(s)；13CNMR(MeOD,101MHz)δ167.9(C),167.5(C),165.4(C),158.0(C),156.8(C),139.3(C),137.6(CH),136.2(C),135.5(C),132.5(CH),132.4(CH),131.5(CH),121.8(C),111.9(CH),109.7(CH),52.9(CH2),42.8(C),35.6(CH3),32.0(CH3),16.8(CH2)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；600nm處檢測)；HRMS(ESI)C30H29N2O4[M+H]+的計算值481.2127，實驗值481.2120。實施例444-((2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙基)氨基甲?；?-2-(3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)苯甲酸鹽使用實施例35中描述的方法由實施例43制備標題化合物(72％，深藍色固體)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.02(dd,J＝8.0,0.6Hz,1H),7.94(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.42–7.40(m,1H),6.68–6.62(m,1H),6.57(d,J＝2.3Hz,2H),6.52(d,J＝8.6Hz,2H),6.20(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),3.91(t,J＝7.4Hz,8H),3.64–3.56(m,6H),3.55–3.48(m,4H),3.38(t,J＝6.6Hz,2H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H),1.83(s,3H),1.77–1.68(m,2H),1.72(s,3H),1.56–1.47(m,2H),1.46–1.36(m,2H),1.36–1.28(m,2H)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；600nm處UV檢測)；HRMS(ESI)C40H49ClN3O5[M+H]+的計算值686.3361，實驗值686.3375。實施例452-(3,6-二(3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)-4-(叔丁氧基羰基)苯甲酸鹽使用實施例1中所述的方法由10,10-二甲基-3'-氧代-3,6-二(((三氟甲基)磺?；?氧基)-3'H,10H-螺[蒽-9,1'-異苯并呋喃]-6'-羧酸叔丁酯(實施例42，步驟2)和3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷鹽酸鹽制備標題化合物(93％，灰白色固體)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.16(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.02(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.60(dd,J＝1.2,0.8Hz,1H),6.65(d,J＝2.4Hz,2H),6.62(d,J＝8.6Hz,2H),6.29(dd,J＝8.6,2.5Hz,2H),4.26(t,3JHF＝11.7Hz,8H),1.85(s,3H),1.75(s,3H),1.53(s,9H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-99.96(p,3JFH＝11.8Hz)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ169.9(C),164.4(C),155.3(C),150.1(t,4JCF＝2.7Hz,C),146.8(C),138.1(C),130.3(CH),129.9(C),129.2(CH),125.1(CH),124.9(CH),121.7(C),115.9(t,1JCF＝274.6Hz,CF2),111.8(CH),109.3(CH),87.5(C),82.5(C),63.4(t,2JCF＝26.0Hz,CH2),38.5(C),35.4(CH3),33.0(CH3),28.2(CH3)；MS(ESI)C34H33F4N2O4[M+H]+的計算值609.2，實驗值609.3。實施例462-(3,6-二(3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)-4-羧基苯甲酸鹽使用實施例19中所述的方法由實施例45制備標題化合物(99％，深藍色固體，TFA鹽)。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.30(dd,J＝8.1,1.4Hz,1H),8.23–8.15(m,1H),7.69(s,1H),6.92(d,J＝2.1Hz,2H),6.79(d,J＝7.6Hz,2H),6.47(dd,J＝8.8,2.3Hz,2H),4.45(t,3JHF＝11.0Hz,8H),1.88(s,3H),1.76(s,3H)；19FNMR(MeOD,376MHz)δ-75.81(s,3F),-100.32(m,4F)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；30–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；600nm處檢測)；MS(ESI)C30H25F4N2O4[M+H]+的計算值553.2，實驗值553.1。實施例472-(3,6-二(3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)-4-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)苯甲酸鹽使用實施例34中所述的方法由實施例46制備標題化合物(93％，黃色固體)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.32(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),8.14(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.74(dd,J＝1.3,0.8Hz,1H),6.65(d,J＝2.4Hz,2H),6.58(d,J＝8.6Hz,2H),6.31(dd,J＝8.6,2.5Hz,2H),4.26(t,3JHF＝11.7Hz,8H),2.88(s,4H),1.84(s,3H),1.73(s,3H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-99.97(p,JFH＝11.7Hz)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ169.1(C),168.9(C),160.9(C),155.6(C),150.3(t,4JCF＝2.5Hz,C),146.9(C),132.0(C),131.3(CH),131.0(C),129.3(CH),126.2(CH),125.8(CH),120.9(C),115.9(t,1JCF＝274.5Hz,CF2),112.0(CH),109.4(CH),87.9(C),63.4(t,2JCF＝26.0Hz,CH2),38.5(C),35.5(CH3),32.8(CH3),25.8(CH2)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；30–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；600nm處檢測)；MS(ESI)C34H28F4N3O6[M+H]+的計算值650.2，實驗值650.1。實施例482-(3,6-二(3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)-4-((2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙基)氨基甲?；?苯甲酸鹽使用實施例35中描述的方法由實施例46制備標題化合物(54％，灰白色/青白色固體)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.04(dd,J＝8.0,0.5Hz,1H),7.93(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.44–7.40(m,1H),6.70–6.65(m,1H),6.64(d,J＝2.4Hz,2H),6.60(d,J＝8.6Hz,2H),6.28(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),4.25(t,3JHF＝11.7Hz,8H),3.66–3.57(m,6H),3.56–3.48(m,4H),3.39(t,J＝6.6Hz,2H),1.85(s,3H),1.79–1.70(m,5H),1.57–1.48(m,2H),1.46–1.37(m,2H),1.37–1.26(m,2H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-99.94(p,3JFH＝11.8Hz)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；30–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；600nm處檢測)；MS(ESI)C40H45ClF4N3O5[M+H]+計算值758.3，實驗值758.2。實施例497-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-4-甲基-2H-色烯-2-酮向小瓶中加入4-甲基傘形酮三氟甲磺酸酯(300mg，0.973mmol；來自J.；Antus,S.Z.Naturforsch.,B:J.Chem.Sci.2005,60,792)、RuPhos-G3-環(huán)鈀配合物(41mg，0.049mmol，0.05當量)、RuPhos(23mg，0.049mmol，0.05當量)和K2CO3(188mg，1.36mmol，1.4當量)。將小瓶密封并抽真空/用氮氣回填(3×)。加入二噁烷(8mL)，并再次用氮氣(3×)沖洗反應(yīng)。加入氮雜環(huán)丁烷(72μ洗，1.07mmol，1.1當量)后，在80℃下攪拌反應(yīng)6.5小時。然后將其冷卻至室溫，沉積在硅藻土上，并濃縮至干。通過硅膠色譜法(0-30％EtOAc/己烷，線性梯度；用硅藻土干法上樣)純化得到(190mg，91％)標題化合物，其為黃色固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.38(d,J＝8.6Hz,1H),6.30(dd,J＝8.6,2.3Hz,1H),6.22(d,J＝2.3Hz,1H),5.97(q,J＝1.1Hz,1H),4.03–3.95(m,4H),2.44(p,J＝7.3Hz,2H),2.34(d,J＝1.1Hz,3H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ162.0(C),155.7(C),154.0(C),153.1(C),125.5(CH),110.4(C),109.5(CH),107.8(CH),97.2(CH),51.9(CH2),18.7(CH3),16.6(CH2)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；350nm處檢測)；HRMS(ESI)C13H14NO2[M+H]+的計算值216.1019，實驗值216.1014。實施例507-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-2-氧代-2H-色烯-3-羧酸乙酯步驟1：向燒瓶中加入Pd(OAc)2(130mg，0.578mmol，0.05當量)，密封，抽真空/用氮氣回填(3×)。加入甲苯(40mL)，然后依次加入3-溴苯酚(2.00g，11.6mmol)的甲苯(8mL)溶液、2,8,9-三異丁基-2,5,8,9-四氮雜-1-磷雜雙環(huán)[3.3.3]十一烷(“Verkade”堿，396mg，1.16mmol，0.1當量)的甲苯(8mL)溶液和LiHMDS(1.0M的THF溶液，26.6mL，26.6mmol，2.3當量)。加入氮雜環(huán)丁烷(935μL，13.9mmol，1.2當量)后，在80℃下攪拌反應(yīng)18小時。然后將其冷卻至室溫，沉積在硅藻土上，并濃縮至干。通過硅膠色譜法(0-35％EtOAc/己烷，線性梯度；用硅藻土干法上樣)純化得到灰白色固體3-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)苯酚(1.44g，84％)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.05(t,J＝8.0Hz,1H),6.19(ddd,J＝8.0,2.4,0.8Hz,1H),6.04(ddd,J＝8.1,2.1,0.8Hz,1H),5.92(t,J＝2.3Hz,1H),4.77(s,1H),3.89–3.81(m,4H),2.34(p,J＝7.2Hz,2H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ156.7(C),153.9(C),130.1(CH),105.1(CH),104.5(CH),99.0(CH),52.7(CH2),17.0(CH2)；HRMS(ESI)C9H12NO[M+H]+的計算值150.0913，實驗值150.0915。步驟2：將DMF(2mL)在氮氣下冷卻至0℃，滴加POCl3(500μL，5.36mmol，2當量)。然后移除冰浴，并將反應(yīng)在室溫下攪拌1小時。然后加入步驟1所得的苯酚(400mg，2.68mmol)的DMF(4mL)溶液。在室溫下攪拌反應(yīng)1小時后，小心地用飽和NaHCO3(～20mL)和EtOAc(～20mL)稀釋并劇烈攪拌10分鐘。將混合物用另外的水稀釋并用EtOAc(2×)萃取。將合并的有機萃取物用水和鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮。通過硅膠快速色譜法(0-40％EtOAc/己烷，線性梯度)純化殘余物得到230mg(48％)白色固體4-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-2-羥基苯甲醛。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ11.69(s,1H),9.50(s,1H),7.25(d,J＝8.5Hz,1H),5.94(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),5.75(d,J＝2.1Hz,1H),4.08–3.98(m,4H),2.43(p,J＝7.4Hz,2H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ192.6(CH),164.4(C),156.6(C),135.5(CH),112.2(C),103.2(CH),95.6(CH),51.2(CH2),16.3(CH2)；HRMS(ESI)C10H12NO2[M+H]+的計算值178.0863，實驗值178.0866。步驟3：將來自步驟2的醛(175mg，0.988mmol)懸浮于EtOH(10mL)中。加入丙二酸二乙酯(301μ0，1.98mmol，2當量)和哌啶(29μ9，0.296mmol，0.3當量)，并將反應(yīng)在回流下攪拌12小時。然后將其冷卻至室溫并靜置12小時，在此期間從溶液中結(jié)晶出黃色固體。將混合物過濾，用EtOH洗滌濾餅并干燥，得到232mg(86％)標題化合物7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-2-氧代-2H-色烯-3-羧酸乙酯，其為亮黃色結(jié)晶固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.39(s,1H),7.31(d,J＝8.6Hz,1H),6.26(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),6.09(d,J＝2.1Hz,1H),4.37(q,J＝7.1Hz,2H),4.10–4.02(m,4H),2.48(p,J＝7.4Hz,2H),1.38(t,J＝7.1Hz,3H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ164.2(C),158.13(C),158.12(C),155.2(C),149.5(CH),131.0(CH),109.4(C),108.39(C),108.36(CH),95.4(CH),61.2(CH2),51.4(CH2),16.3(CH2),14.5(CH3)；HRMS(ESI)C15H15NO4Na[M+Na]+計算值296.0893，實驗值296.0900。實施例517-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-2-氧代-2H-色烯-3-羧酸取7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-2-氧代-2H-色烯-3-羧酸乙酯(實施例50；65mg，0.238mmol)溶解在1:1THF/MeOH(8mL)中，并加入1MNaOH(476μ7，0.476mmol，2當量)。在室溫下攪拌反應(yīng)3小時。然后將其用1MHCl(500μ0)酸化，并將得到的黃色懸浮液過濾。將濾餅洗滌(水，EtOAc)并干燥，得到呈亮黃色固體的標題化合物(47mg，81％)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ12.52(s,1H),8.59(s,1H),7.64(d,J＝8.7Hz,1H),6.42(dd,J＝8.7,2.2Hz,1H),6.23(d,J＝1.9Hz,1H),4.10–4.01(m,4H),2.39(p,J＝7.4Hz,2H)；13CNMR(DMSO-d6,101MHz)δ164.4(C),159.1(C),157.4(C),155.1(C),149.7(CH),131.7(CH),108.7(CH),108.0(C),107.6(C),94.7(CH),51.2(CH2),15.6(CH2)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；400nm處檢測)；HRMS(ESI)C13H12NO4[M+H]+的計算值246.0761，實驗值246.0770。實施例52N-(4-(((2-氨基-9H-嘌呤-6-基)氧基)甲基)芐基)-7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲酰胺將7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-2-氧代-2H-色烯-3-羧酸(實施例51；6.0mg，24.5μ4.5)與TSTU(11.0mg，36.7μ6.7，1.5當量)在DMF(1mL)中合并。加入DIEA(21.3μ1，122μ22l，5當量)后，將反應(yīng)在室溫下攪拌1小時，同時避光。然后加入6-((4-(氨基甲基)芐基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(“BG-NH2”，9.9mg，36.7μ6.7，1.5當量)。將反應(yīng)在室溫下再攪拌2小時。通過反相HPLC(10-75％MeCN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑)純化粗反應(yīng)混合物得到11.5mg(77％，TFA鹽)標題化合物，其為黃色固體。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.65(s,1H),8.31(s,1H),7.57–7.50(m,3H),7.41(d,J＝8.1Hz,2H),6.45(dd,J＝8.7,2.1Hz,1H),6.22(d,J＝2.0Hz,1H),5.64(s,2H),4.62(s,2H),4.15–4.06(m,4H),2.48(p,J＝7.4Hz,2H)；19FNMR(MeOD,376MHz)δ-75.44(s)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；400nm處檢測)；HRMS(ESI)C26H24N7O4[M+H]+計算值498.1884，實驗值498.1891。實施例532-(7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸甲酯步驟1：將7-羥基-4-甲基香豆素-3-乙酸甲酯(1.00g，4.03mmol；來自Franzini,R.M.；Kool,E.T.Chembiochem2008,9,2981)、N-苯基-二(三氟甲磺酰亞胺)(1.58g，4.43mmol，1.1當量)和DIEA(912μ1，5.24mmol，1.3當量)在MeCN(20mL)中合并，并在室溫下攪拌18小時。將反應(yīng)混合物濃縮至干，并將所得殘余物通過硅膠快速色譜法(0-50％EtOAc/己烷，線性梯度)純化得到灰白色固體2-(4-甲基-2-氧代-7-(((三氟甲基)磺?；?氧基)-2H-色烯-3-基)乙酸甲酯(1.41g，92％)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.73(d,J＝8.8Hz,1H),7.29(d,J＝2.4Hz,1H),7.26(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),3.76(s,2H),3.73(s,3H),2.44(s,3H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-73.08(s)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ170.2(C),160.4(C),153.0(C),150.5(C),147.9(C),126.7(CH),121.0(C),120.5(C),118.8(q,1JCF＝321.0Hz,CF3),117.6(CH),110.5(CH),52.6(CH3),33.0(CH2),15.7(CH3)；HRMS(ESI)C14H11F3O7SNa[M+Na]+計算值403.0070，實驗值403.0081。步驟2：將來自步驟1的三氟甲磺酸酯(300mg，0.789mmol)、RuPhos-G3-環(huán)鈀配合物(33mg，0.039mmol，0.05當量)、RuPhos(18mg，0.039mmol，0.05當量)和K2CO3(153mg，1.10mmol，1.4當量)。將小瓶密封并抽真空/用氮氣回填(3×)。加入二噁烷(5mL)，并再次用氮氣沖洗反應(yīng)(3×)。加入氮雜環(huán)丁烷(58μL，0.868mmol，1.1當量)后，將反應(yīng)在80℃下攪拌4小時。然后將其冷卻至室溫，用CH2Cl2稀釋，沉積在硅藻土上，并濃縮至干。通過硅膠色譜法(0-50％EtOAc/己烷，線性梯度，恒定的40％v/vCH2Cl2；用硅藻土干燥上樣)純化得到標題化合物2-(7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸甲酯(210mg，93％)，其為淺黃色固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.42(d,J＝8.7Hz,1H),6.32(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),6.22(d,J＝2.3Hz,1H),4.03–3.94(m,4H),3.70(s,3H),3.69(s,2H),2.43(p,J＝7.3Hz,2H),2.33(s,3H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ171.4(C),162.4(C),154.6(C),153.7(C),149.8(C),125.7(CH),113.7(C),110.7(C),108.0(CH),97.0(CH),52.2(CH3),51.9(CH2),32.8(CH2),16.6(CH2),15.3(CH3)；HRMS(ESI)C16H17NO4Na[M+Na]+計算值310.1050，實驗值310.1068。實施例542-(7-(3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸甲酯向小瓶中加入2-(4-甲基-2-氧代-7-(((三氟甲基)磺?；?氧基)-2H-色烯-3-基)乙酸甲酯(實施例53，步驟1；240mg，0.631mmol)、RuPhos-G3-鈀環(huán)配合物(26mg，0.032mmol，0.05當量)、RuPhos(15mg，0.032mmol，0.05當量)、K2CO3(218mg，1.58mmol，2.5當量)和3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷鹽酸鹽(84mg，0.694mmol，1.1當量)。將小瓶密封并抽真空/用氮氣回填(3×)。加入二噁烷(4mL)，并用氮氣(3×)再次沖洗反應(yīng)物。然后將混合物在80℃下攪拌24小時。隨后將其冷卻至室溫，用CH2Cl2稀釋，沉積在硅藻土上，并濃縮至干。通過硅膠色譜法(0-40％EtOAc/己烷，線性梯度，恒定的40％v/vCH2Cl2；用硅藻土干法上樣)純化得到標題化合物(158mg，77％)，其為灰白色固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.50(d,J＝8.7Hz,1H),6.41(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),6.34(d,J＝2.4Hz,1H),4.32(t,3JHF＝11.7Hz,4H),3.71(s,3H),3.71(s,2H),2.36(s,3H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-100.14(p,3JFH＝11.6Hz)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ171.1(C),161.9(C),154.3(C),151.5(t,4JCF＝3.2Hz,C),149.4(C),126.1(CH),115.5(t,1JCF＝274.6Hz,CF2),115.4(C),112.3(C),109.0(CH),98.9(CH),63.3(t,2JCF＝26.8Hz,CH2),52.3(CH3),32.8(CH2),15.4(CH3)；HRMS(ESI)C16H15F2NO4Na[M+Na]+的計算值346.0861，實驗值346.0872。實施例552-(7-(氮雜環(huán)丙烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸將2-(7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸甲酯(實施例53；190mg，0.661mmol)溶于1:1THF/MeOH(8mL)中，并加入1MNaOH(1.32mL，1.32mmol，2當量)。在室溫下攪拌反應(yīng)24小時后，用1MHCl(1.40mL)酸化，用水稀釋，并用EtOAc(2×)萃取。將合并的有機萃取物用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮。將所得殘余物用CH2Cl2/己烷研磨，過濾并干燥得到164mg(91％)標題化合物，其為淺黃色固體。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ12.33(s,1H),7.58(d,J＝8.8Hz,1H),6.40(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),6.25(d,J＝2.3Hz,1H),3.94(t,J＝7.3Hz,4H),3.52(s,2H),2.36(p,J＝7.3Hz,2H),2.30(s,3H)；13CNMR(DMSO-d6,101MHz)δ171.8(C),161.2(C),153.7(C),153.4(C),149.5(C),126.2(CH),113.6(C),109.7(C),108.0(CH),96.1(CH),51.5(CH2),32.5(CH2),16.0(CH2),14.9(CH3)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；350nm處檢測)；HRMS(ESI)C15H15NO4Na[M+Na]+的計算值296.0893，實驗值296.0909。實施例562-(7-(3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸使用實施例55中描述的方法由實施例54制備標題化合物(93％，白色固體)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ12.37(s,1H),7.67(d,J＝8.7Hz,1H),6.58(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),6.51(d,J＝2.3Hz,1H),4.42(t,3JHF＝12.3Hz,4H),3.55(s,2H),2.33(s,3H)；19FNMR(DMSO-d6,376MHz)δ-98.45(p,3JHF＝12.4Hz)；13CNMR(DMSO-d6,101MHz)δ171.7(C),161.0(C),153.3(C),151.7(t,4JCF＝3.2Hz,C),149.3(C),126.4(CH),116.4(t,1JCF＝272.9Hz,CF2),115.1(C),111.3(C),109.6(CH),98.6(CH),62.8(t,2JCF＝26.1Hz,CH2),32.6(CH2),14.9(CH3)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；350nm處檢測)；HRMS(ESI)C15H13F2NO4Na[M+Na]+的計算值332.0705，實驗值332.0714。實施例572-(7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯向2-(7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸(實施例55；75mg，0.274mmol)和TSTU(124mg，0.412mmol，1.5當量)的DMF(4mL)溶液中加入DIEA(96μL，0.549mmol，2當量)。將反應(yīng)在室溫下攪拌4小時。隨后用10％w/v檸檬酸稀釋并用EtOAc(2×)萃取。將合并的有機萃取物用水和鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮。通過硅膠色譜法(0-50％EtOAc/CH2Cl2，線性梯度)得到84mg(83％)標題化合物，其為淺黃色固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.43(d,J＝8.7Hz,1H),6.31(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),6.21(d,J＝2.3Hz,1H),4.02(s,2H),4.02–3.96(m,4H),2.81(s,4H),2.44(p,J＝7.3Hz,2H),2.38(s,3H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ169.0(C),166.4(C),162.0(C),154.7(C),154.0(C),151.3(C),125.9(CH),111.2(C),110.3(C),108.1(CH),96.9(CH),51.8(CH2),29.8(CH2),25.7(CH2),16.6(CH2),15.5(CH3)；HRMS(ESI)C19H18N2O6Na[M+Na]+的計算值393.1057，實驗值393.1065。實施例582-(7-(3,3-二氟氮雜環(huán)丁烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯使用實施例57中描述的方法由實施例56制備標題化合物(82％，白色固體)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ7.71(d,J＝8.8Hz,1H),6.59(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),6.53(d,J＝2.3Hz,1H),4.43(t,3JHF＝12.3Hz,4H),4.03(s,2H),2.79(s,4H),2.40(s,3H)；19FNMR(DMSO-d6,376MHz)δ-98.49(p,3JFH＝12.3Hz)；13CNMR(DMSO-d6,101MHz)δ170.0(C),166.5(C),160.6(C),153.5(C),152.1(t,4JCF＝3.2Hz,C),151.2(C),126.7(CH),116.4(t,1JCF＝272.8Hz,CF2),112.1(C),110.9(C),109.8(CH),98.5(CH),62.8(t,2JCF＝26.2Hz,CH2),29.5(CH2),25.4(CH2),15.1(CH3)；HRMS(ESI)C19H16F2N2O6Na[M+Na]+的計算值429.0869，實驗值429.0876。實施例592-(6-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-3-氧代-3H-呫噸-9-基)苯甲酸步驟1：向小瓶中加入熒光素二(三氟甲磺酸酯)(500mg，0.838mmol)，Pd2dba3(38mg，0.042mmol，0.05當量)，XPhos(60mg，0.126mmol，0.15當量)和Cs2CO3(382mg，1.17mmol，1.4當量)。將小瓶密封并抽真空/用氮氣回填(3×)。加入二噁烷(4mL)，并用氮氣(3×)再次沖洗反應(yīng)。加入氮雜環(huán)丁烷(57μL，0.838mmol，1當量)后，將反應(yīng)在80℃下攪拌2小時。然后將其冷卻至室溫，沉積在硅藻土上，并濃縮至干。通過硅膠色譜法(0-35％EtOAc/己烷，線性梯度；用硅藻土干法上樣)純化得到3'-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-3-氧代-3H-螺[異苯并呋喃-1,9'-呫噸]-6'-基三氟甲磺酸酯(125mg，30％)，其為灰白色固體。MS(ESI)C24H17F3NO6S[M+H]+的計算值504.1，實驗值504.2。步驟2：將步驟1的產(chǎn)物(72mg，0.143mmol)溶于1:1THF/MeOH(5mL)中，并加入1MNaOH(286μ8，0.286mmol，2當量)。室溫下攪拌反應(yīng)6小時后，將反應(yīng)物濃縮至干。殘余物通過反相HPLC(10-95％MeCN/H2O，線性梯度，用恒定的0.1％v/vTFA添加劑)純化，得到40mg(58％)標題化合物2-(6-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-3-氧代-3H-呫噸-9-基)苯甲酸，其為亮橙色固體。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.36–8.30(m,1H),7.85(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.81(td,J＝7.6,1.5Hz,1H),7.43–7.38(m,1H),7.16(d,J＝9.3Hz,1H),7.15(d,J＝9.0Hz,1H),7.08(d,J＝2.3Hz,1H),6.93(dd,J＝9.0,2.3Hz,1H),6.74(dd,J＝9.3,2.2Hz,1H),6.64(d,J＝2.2Hz,1H),4.44–4.35(m,4H),2.58(p,J＝7.7Hz,2H)；13CNMR(MeOD,101MHz)δ168.4(C),168.0(C),161.0(C),159.9(C),159.1(C),157.9(C),135.7(C),134.0(CH),133.1(CH),132.42(CH),132.40(CH),132.1(C),131.7(CH),131.2(CH),118.0(CH),117.1(C),116.4(C),115.9(CH),103.3(CH),95.1(CH),53.4(CH2),16.7(CH2)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；500nm處檢測)；HRMS(ESI)C23H18NO4[M+H]+的計算值372.1230，實驗值372.1230。實施例603,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)吖啶步驟1：在微波小瓶中將鹽酸原黃素(250mg，1.02mmol)懸浮于水(1mL)中，加入濃H2SO4(450μ5)。將密封的混合物在微波中在195℃下加熱8小時。將棕色懸浮液用水稀釋并過濾；將所得濾餅用水洗滌并干燥，得到粗制3,6-二羥基吖啶，其為紅棕色固體(260mg)。然后將3,6-二羥基吖啶(260mg，1.23mmol)懸浮于CH2Cl2(5mL)中。加入吡啶(796μ9，9.85mmol，8當量)和三氟甲磺酸酐(828μ2，4.92mmol，4當量)，在室溫下攪拌反應(yīng)2小時。隨后用水稀釋并用CH2Cl2(2×)萃取。將合并的有機萃取物干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮。通過硅膠快速色譜法(0-30％EtOAc/己烷，線性梯度)純化得到303mg(63％，2步)吖啶-3,6-二基二(三氟甲磺酸酯)，其為灰白色固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.93(s,1H),8.19–8.13(m,4H),7.54(dd,J＝9.2,2.4Hz,2H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-73.10(s)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ151.1(C),149.5(C),137.0(CH),131.2(CH),125.7(C),121.4(CH),120.8(CH),119.0(q,1JCF＝321.0Hz,CF3)；HRMS(ESI)C15H8F6NO6S2[M+H]+的計算值475.9692，實驗值475.9689。步驟2：將來自步驟1的二(三氟甲磺酸酯)(200mg，0.421mmol)、Pd(OAc)2(19mg，0.084mmol，0.2當量)、BINAP(79mg，0.126mmol，0.3當量)和Cs2CO3(384mg，1.18mmol，2.8當量)。將小瓶密封并抽真空/用氮氣回填(3×)。加入甲苯(2.5mL)，并再次用氮氣(3×)沖洗反應(yīng)。加入氮雜環(huán)丁烷(68μL，1.01mmol，2.4當量)后，將反應(yīng)在100℃下攪拌18小時。然后將其冷卻至室溫，用MeOH稀釋，沉積在硅藻土上，并濃縮至干。通過硅膠色譜(0-10％MeOH(2MNH3)/CH2Cl2，線性梯度；用硅藻土干法加樣)純化，得到標題化合物3,6-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)吖啶(89mg，73％)，其為紅橙色固體。1HNMR(MeOD,400MHz)δ8.44(s,1H),7.74(d,J＝9.0Hz,2H),6.78(dd,J＝9.0,2.2Hz,2H),6.57(d,J＝2.0Hz,2H),4.08(t,J＝7.3Hz,8H),2.47(p,J＝7.3Hz,4H)；13CNMR(MeOD,101MHz)δ156.0(C),144.2(CH),143.1(C),132.6(CH),118.1(C),114.1(CH),91.4(CH),52.3(CH2),17.0(CH2)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；500nm處檢測)；HRMS(ESI)C19H20N3[M+H]+的計算追290.1652，實驗值290.1650。實施例613,7-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)吩噁嗪-5-鎓三氟乙酸鹽步驟1：取AmplexRed(449mg，1.75mmol)溶于CH2Cl2(45mL)中并冷卻至0℃。加入吡啶(1.14mL，14.0mmol，8.0當量)和三氟甲磺酸酐(1.17mL，6.98mmol，4.0當量)，并移除冰浴。將反應(yīng)在室溫下攪拌3小時。隨后用水稀釋并用CH2Cl2(2×)萃取。將合并的有機萃取物用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并真空濃縮。通過硅膠快速色譜(0-35％EtOAc/己烷，線性梯度)得到836mg(92％)10-乙?；?10H-吩噁嗪-3,7-二基二(三氟甲磺酸酯)，其為灰白色固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.58–7.54(m,2H),7.14–7.09(m,4H),2.35(s,3H)；19FNMR(CDCl3,376MHz)δ-73.15(s)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ168.9(C),151.0(C),147.4(C),129.1(C),126.3(CH),118.8(q,1JCF＝320.9Hz,CF3),117.2(CH),111.1(CH),23.0(CH3)；HRMS(ESI)C16H10F6NO8S2[M+H]+的計算值521.9747，實驗值521.9748。步驟2：將來自步驟1的二(三氟甲磺酸酯)(150mg，0.288mmol)、Pd2dba3(26mg，0.029mmol，0.1當量)、XPhos(41mg，0.086mmol，0.3eq)和Cs2CO3(262mg，0.806mmol，2.8當量)裝入小瓶中。將小瓶密封并抽真空/用氮氣回填(3×)。加入二噁烷(4mL)，并用氮氣(3×)再次沖洗反應(yīng)。加入氮雜環(huán)丁烷(47μL，0.691mmol，2.4當量)后，將反應(yīng)在80℃下攪拌4小時。然后將其冷卻至室溫，沉積在硅藻土上，并濃縮至干。通過硅膠色譜法(5-50％EtOAc/己烷，線性梯度；用硅藻土干法上樣)純化得到1-(3,7-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-10H-吩噁嗪-10-基)乙酮(91mg，94％)，其為無色固體。MS(ESI)C20H22N3O2[M+H]+的計算值336.2，實驗值336.2。步驟3：將來自步驟2的中間體(63mg，0.189mmol)溶于CH2Cl2(11.7mL)和水(1.3mL)的混合物中并冷卻至0℃。加入DDQ(47mg，0.207mmol，1.1當量)，并將反應(yīng)在室溫下攪拌2.5小時。加入第二部分的DDQ(21mg，0.094mmol，0.5當量)，將反應(yīng)物再攪拌30分鐘。將混合物蒸發(fā)，再溶于MeCN中，沉積在硅藻土上，并濃縮至干。通過硅膠色譜法(0-15％MeOH/CH2Cl2，線性梯度，恒定的1％v/vAcOH添加劑；用硅藻土干法上樣)以及隨后的反相HPLC(10-95％MeCN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑)得到38mg(50％)標題化合物3,7-二(氮雜環(huán)丁烷-1-基)吩噁嗪-5-鎓三氟乙酸鹽，其為深藍色固體。1HNMR(MeOD,400MHz)δ7.72(d,J＝9.3Hz,2H),6.92(dd,J＝9.3,2.4Hz,2H),6.50(d,J＝2.4Hz,2H),4.43(t,J＝7.7Hz,8H),2.60(p,J＝7.7Hz,4H)；19FNMR(MeOD,376MHz)δ-75.45(s)；13CNMR(MeOD,101MHz)δ158.0(C),150.3(C),135.4(CH),135.3(C),116.4(CH),95.1(CH),53.7(CH2),16.6(CH2)；分析HPLC:>99％純度(4.6mm×150mm5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，線性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加劑；運行20min；流速1mL/min；ESI；正離子模式；650nm處檢測)；HRMS(ESI)C18H18N3O[M]+的計算值292.1444，實驗值292.1439。在本文中，提及了各種參考文獻。包括以下所列的參考文獻在內(nèi)的所有這些參考文獻通過引用并入本文：參考文獻1Kremers,G.-J.,Gilbert,S.G.,Cranfill,P.J.,Davidson,M.W.&Piston,D.W.Fluorescentproteinsataglance(熒光蛋白一覽).J.CellSci.124,157-160,(2011).2Xia,T.,Li,N.&Fang,X.Single-moleculefluorescenceimaginginlivingcells(活細胞中的單分子熒光成像).Ann.ReviewPhys.Chem.64,459-480,(2013).3Gautier,A.etal.Anengineeredproteintagformultiproteinlabelinginlivingcells(用于活細胞中多蛋白標記的工程蛋白標簽).Chem.Biol.15,128-136,(2008).4Los,G.V.etal.HaloTag:Anovelproteinlabelingtechnologyforcellimagingandproteinanalysis(HaloTag：一種用于細胞成像和蛋白分析的新型蛋白標記技術(shù)).ACSChem.Biol.3,373-382,(2008).5Encell,L.P.etal.Developmentofadehalogenase-basedproteinfusiontagcapableofrapid,selectiveandcovalentattachmenttocustomizableligands(一種能夠快速地選擇性地共價附著到可定制配體的基于脫鹵素酶的蛋白質(zhì)融合標簽的研制).Curr.Chem.Genomics6,(Suppl1-M7)55-71,(2012).6Wombacher,R.etal.Live-cellsuper-resolutionimagingwithtrimethoprimconjugates(使用甲氧芐啶綴合物的活細胞超分辨率成像).Nat.Methods7,717-719,(2010).7Zhao,Z.W.etal.SpatialorganizationofRNApolymeraseIIinsideamammaliancellnucleusrevealedbyreflectedlight-sheetsuperresolutionmicroscopy(通過反射光片超分辨率顯微術(shù)揭示的哺乳動物細胞核內(nèi)RNA聚合酶II的空間組織).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111,681-686,(2014).8Abrahamsson,S.etal.Fastmulticolor3Dimagingusingaberration-correctedmultifocusmicroscopy(使用像差校正多焦點顯微術(shù)的快速多色3D成像).Nat.Methods10,60-63,(2013).9Chen,J.etal.Single-moleculedynamicsofenhanceosomeassemblyinembryonicstemcells(胚胎干細胞中增強體組裝的單分子動力學(xué)).Cell156,1274-1285,(2014).10Beija,M.,Afonso,C.A.M.&Martinho,J.M.G.Synthesisandapplicationsofrhodaminederivativesasfluorescentprobes(羅丹明衍生物作為熒光探針的合成和應(yīng)用).Chem.Soc.Rev.38,2410-2433,(2009).11Lavis,L.D.&Raines,R.T.Brightbuildingblocksforchemicalbiology(用于化學(xué)生物學(xué)的明亮結(jié)構(gòu)單元).ACSChem.Biol.9,855–866(2014).12Grimm,J.B.etal.Carbofluoresceinsandcarborhodaminesasscaffoldsforhigh-contras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