專利名稱：用于定量pcr的熒光染料的新的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光染料的制備方法，尤其是一種用于定量PCR的熒光染料的制備方法。
背景技術(shù)：
在二十世紀(jì)九十年代中期，熒光定量PCR方法逐漸發(fā)展成為一種可以方便地用于定量地檢測(cè)各種病原體在組織內(nèi)含量的方法，為很多重要的傳染性疾病和遺傳性疾病的臨床診斷提供了一種新的更為有效、更具定量意義的方法。發(fā)展到現(xiàn)在，熒光定量PCR方法正在各級(jí)醫(yī)院推廣使用。然而，限制其更廣泛使用的主要因素是該方法所需的耗材成本過高，其中最高的一塊來自熒光染料本身。而目前能用于熒光定量PCR方法的各種標(biāo)記寡核苷酸(Oligo)用熒光染料的制造工藝都很繁復(fù)，而且收率極低，造成了成本奇高，而價(jià)格也自然居高不下。
熒光染料用于標(biāo)記生物分子可以取代以往的同位素標(biāo)識(shí)，保持較高的靈敏度，同時(shí)又不對(duì)人體造成危害，廢物的處理也變得容易得多。事實(shí)上，自從熒光染料標(biāo)識(shí)開始得到使用以后，同位素標(biāo)記的使用已經(jīng)越來越少。但日前能用于生物大分子標(biāo)識(shí)的熒光染料并不太多，主要原因是很多熒光染料或者熒光強(qiáng)度不夠高，或者穩(wěn)定性不夠好。目前能用于定量PCR技術(shù)的熒光染料中以熒光素類染料最為常用。而這類染料又因連接臂在母環(huán)上的位置不同而導(dǎo)致產(chǎn)物以兩種不同的形態(tài)出現(xiàn)，一種是5-和6-位異構(gòu)體的混合物，一種是純的6-位異構(gòu)體。異構(gòu)體的混合物在用于定量PCR時(shí)因兩個(gè)異構(gòu)體的最大吸收和發(fā)射波長(zhǎng)略有偏差而會(huì)導(dǎo)致譜帶變寬，且混合物中兩異構(gòu)體的比例難以控制，會(huì)導(dǎo)致定量PCR實(shí)驗(yàn)中批次與批次間的差異。故幾乎沒有人將5、6-位異構(gòu)體混合物直接用于標(biāo)記定量PCR探針。而為了制得純的6-位異構(gòu)體，目前使用的方法過程如圖1，依次包括如下步驟間苯二酚與偏苯三甲酸酐在較高溫度(約200℃)下縮合，形成5(6)-羧基熒光素(III)；然后先進(jìn)行乙酰化衍生化，得到二乙?；?5(6)-羧基熒光素(IV)，在這一步重結(jié)晶往往能得到純的二乙酰化-6-羧基熒光素(V)，如果不純，則要進(jìn)一步重結(jié)晶。這一步收率很低，只有10％左右。下一步，水解得到純的6-羧基熒光素(VI)，然后是特戊丁基衍生化，N-羥基琥珀酰亞胺處理，再加入6-氨基己醇處理，順序得到化合物二特戊?；?6-羧基熒光素(VII)、二特戊?；?6-N-(6’-羥基己基)-羰酰胺基熒光素(VIII)、二特戊?；?6-N-(6’-羥基己基)-羰酰胺基熒光素(IX)。最后用磷酸化試劑磷酸化二特戊?；?6-N-(6’-羥基己基)-羰酰胺基熒光素。整個(gè)過程的特點(diǎn)是是在芳環(huán)縮合后先將其乙?；苌?，然后再進(jìn)行重結(jié)晶，最后再脫保護(hù)回到原來狀態(tài)。這樣做，不單單使原本已很復(fù)雜的工藝變得更加復(fù)雜，同時(shí)在結(jié)晶這一步收率很低，通常只有10-15％的回收率，且有時(shí)第一次結(jié)晶達(dá)不到足夠高的純度，還需二次結(jié)晶，整個(gè)工藝流程的收率正常情況下是只有0.8％左右。這就使原來的方法生產(chǎn)出的產(chǎn)品的成本奇高，市場(chǎng)上的價(jià)格也降不下來，因而影響了定量PCR方法的進(jìn)一步推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提出一種用于定量PCR的熒光染料的新的制備方法，極大地簡(jiǎn)化了工藝流程，提高了產(chǎn)品收率，并對(duì)大幅度降低熒光定量PCR方法的使用成本起到了根本保證作用，為熒光定量PCR方法在臨床診斷上的更廣泛應(yīng)用起了推進(jìn)作用。
本發(fā)明的上述目的是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的所述的用于定量PCR的熒光染料的新的制備方法，依次包括如下步驟A.間苯二酚與偏苯三甲酸酐在200℃左右的溫度下縮合，形成5(6)-羧基熒光素(III)。
B.5(6)-羧基熒光素上的兩個(gè)羥基用特戊?；M(jìn)行保護(hù)形成二特戊?；?5(6)-羧基熒光素(XI)。
C.二特戊?；?5(6)-羧基熒光素用N-羥基琥珀酰亞胺進(jìn)行活化，形成二特戊酰基-5(6)-羧基熒光素-N-琥珀酰亞胺酯(XII)。
D.二特戊酰基-5(6)-羧基熒光素-N-琥珀酰亞胺酯與6-氨基己醇反應(yīng)生成二特戊?；?5(6)-N-(6’-羥基己基)-羰酰胺基熒光素(XIII)。
E.用高效柱層析方法在引入6-羥基己基后直接進(jìn)行異構(gòu)體分離，得到二特戊?；?6-N-(6’-羥基己基)-羰酰胺基熒光素(IX)。
F.用磷酸化試劑磷酸化二特戊酰基-6-N-(6’-羥基己基)-羰酰胺基熒光素(IX)。
所述的用于定量PCR的熒光染料為6-FAM磷酸酰亞胺(6-FAMphosphoramidite)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為X 本發(fā)明的優(yōu)選方案為所述的用于定量PCR的熒光染料的新的制備方法中，所述高效柱層析方法為使用中壓柱層析系統(tǒng)。
本發(fā)明的更優(yōu)選方案為所述的用于定量PCR的熒光染料的新的制備方法中，所述的高效柱層析方法為使用中壓柱層析系統(tǒng)，并且所述的中壓柱層析系統(tǒng)利用微球型硅膠作為固定相；利用乙醚-二氯甲烷系統(tǒng)作為洗脫液。
為了解決熒光素類生物大分子標(biāo)記用染料的成本問題，放棄原有的合成路線即衍生化后重結(jié)晶的方法，而采用直接合成，獲得兩種異構(gòu)體的混合物，直至接上C-6連接臂后，再通過中壓制備柱層析進(jìn)行分離。通過使用一種特殊的對(duì)于分離這類異構(gòu)體有很好效果的洗脫系統(tǒng)，調(diào)整溶劑的極性，以達(dá)到徹底分離5-和6-位異構(gòu)體的目的。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在該步的前面或后面做分離效果都不好，只有該步效果最佳，原因可能是該步驟中兩種異構(gòu)體因?yàn)檫B接了C-6連接臂后，極性差異變得更為明顯，從而使分離變得更容易。在該步分離的過程中，固定相的選擇對(duì)分離效果也有很大影響。本發(fā)明人經(jīng)過仔細(xì)的比較，發(fā)現(xiàn)微球型硅膠作為固定相效果最好。對(duì)洗脫液也進(jìn)行過詳細(xì)的比較，發(fā)現(xiàn)一般柱層析方法中很少用到的乙醚一二氯甲烷系統(tǒng)在分離用于定量PCR的熒光染料時(shí)效果很好。
和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明的方法可以大大縮短生產(chǎn)周期，降低人力投入，成倍地提高反應(yīng)收率，從而大幅度地降低這類標(biāo)記生物大分子用熒光染料的成本，進(jìn)一步促進(jìn)熒光定量PCR方法的推廣使用。


圖1為6-FAM磷酸酰亞胺(6-FAM phosphoramidite)利用乙?；苌僦亟Y(jié)晶的方法的制備過程圖；圖2為6-FAM磷酸酰亞胺(6-FAM phosphoramidite)利用高效柱層析方法的制備過程圖；I為間苯二酚；II為偏苯三甲酸酐；III為5(6)-羧基熒光素；IV為二乙?；?5(6)-羧基熒光素；V為二乙酰化-6-羧基熒光素；VI為6-羧基熒光素；VII為二特戊酰基-6-羧基熒光素；VIII為二特戊?；?6-N-(6’-羥基己基)-羰酰胺基熒光素；IX為二特戊?；?6-N-(6’-羥基己基)-羰酰胺基熒光素；X為6-FAM磷酸酰亞胺；XI為二特戊?；?5(6)-羧基熒光素；XII為二特戊?；?5(6)-羧基熒光素-N-琥珀酰亞胺酯；XIII為二特戊酰基-5(6)-N-(6’-羥基己基)-羰酰胺基熒光素。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合說明書附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述如圖2，將間苯二酚(I)(55g)加熱到135-145℃左右溶解，加入偏苯三甲酸酐(II)(19.2g)，在180-200℃反應(yīng)兩小時(shí)左右。TLC表明反應(yīng)已完成，冷卻后加入10MNaOH溶液(500ml)使之溶解，用2×500ml二氯甲烷萃取，棄去萃取液，水相用10MHCl溶液(700ml)中和至酸性(pH＝2)，形成的沉淀過濾并干燥后即得5(6)-羧基熒光素(III)(30g，純度90％)。
將5(6)-羧基熒光素(III)(15g)溶于吡啶(100ml)，加入特戊丁酰氯(10ml)，三乙胺(10ml)，在室溫下反應(yīng)16小時(shí)，加入甲醇(20ml)終止反應(yīng)，減壓蒸除溶劑，加入二氯甲烷(150ml)，水(150ml)，分層后用二氯甲烷洗滌，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥后，蒸干，得到18g固體二特戊酰基-5(6)-羧基熒光素(XI)。不經(jīng)任何處理，進(jìn)入下一步。
將上步所得二特戊?；?5(6)-羧基熒光素(XI)(18g)，N-羥基琥珀酰亞胺(4g)，DCC(7g)一起溶于乙酸乙酯(150ml)攪拌半小時(shí)，將生成的固體濾掉，濾液用水洗，并用無水硫酸鈉干燥，蒸干后所得的產(chǎn)品用柱層析進(jìn)行分離，將所得的適當(dāng)?shù)酿s分合并后蒸干得到所要的產(chǎn)品二特戊酰基-5(6)-羧基熒光素-N-琥珀酰亞胺酯(XII)(4g，純度95％)。
將上步所得二特戊?；?5(6)-羧基熒光素-N-琥珀酰亞胺酯(XII)(4g)溶于60ml干燥過的二氯甲烷中，在半小時(shí)內(nèi)滴加入6-氨基己醇(4ml)溶于二氯甲烷(15ml)的溶液，然后反應(yīng)液在水(100ml)和二氯甲烷(100ml)中分配，將有機(jī)相分離出來后，干燥，蒸去溶劑，殘余物使用中壓柱層析系統(tǒng)(Biotage75m)在硅膠上用乙醚一二氯甲烷系統(tǒng)進(jìn)行高效柱層析分離，將適當(dāng)?shù)酿s分收集到一起，蒸干溶劑后即得純的6-位異構(gòu)體二特戊?；?6-N-(6’-羥基己基)-羰酰胺基熒光素(IX)(1.5g，純度98.5％，無5-位異構(gòu)體)。
將上步所得二特戊?；?6-N-(6’-羥基己基)-羰酰胺基熒光素(IX)(1.5g)溶于15ml干燥過的二氯甲烷中，加入二異丙胺四唑鹽(0.15g)，N，N，N’N’-四異丙基-氰乙基磷酸酰亞胺(1.2g)，在室溫下反應(yīng)過夜，加入5％NaHCO3，分離后水相用二氯甲烷萃取，合并有機(jī)相，干燥，蒸干后，用硅膠柱層析進(jìn)行分離。將適當(dāng)?shù)慕M分合并，蒸干后，再溶于15ml無水乙腈，用0.2微米的聚四氟乙烯膜過濾，蒸干后，冷凍干燥過夜，即得最終產(chǎn)品6-FAM磷酸酰亞胺(6-FAM phosphoramidite)(X)1.2g，純度96％。
整個(gè)工藝流程以偏苯三甲酸酐為基礎(chǔ)計(jì)算收率為3％，并且制備出的產(chǎn)品與標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品的P31核磁共振和HPLC比較，完全一致。
上面實(shí)施例顯示利用高效柱層析方法的制備6-FAM磷酸酰亞胺(6-FAMphosphoramidite)只需6個(gè)主要反應(yīng)步驟(圖2)，而利用原來的乙?；苌笾亟Y(jié)晶的辦法制備6-FAM磷酸酰亞胺則必須經(jīng)過8個(gè)必要的反應(yīng)步驟(圖1)，并且前者的收率3％遠(yuǎn)高于相同量原料使用后者方法的收率0.8％。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，本發(fā)明所述用于定量PCR的熒光染料包括但不限于6-FAM磷酸酰亞胺(6-FAM phosphoramidite)，即6-FAM標(biāo)記單體，而各種類似標(biāo)記單體如6-HEX、6-TET等與6-FAM標(biāo)記單體有基本相同的制備方法，即本發(fā)明所述制備方法也適用于除6-FAM標(biāo)記單體外的用于定量PCR的熒光染料。因此本發(fā)明不局限于上述實(shí)施例的各個(gè)細(xì)節(jié)，而且本發(fā)明還可體現(xiàn)在不背離本發(fā)明基本特征的其他特定形式中，所以希望本實(shí)施例在各個(gè)方面都視為闡述性的而非限制性的。
權(quán)利要求
1.一種用于定量PCR的熒光染料的新的制備方法，依次包括如下步驟A.間苯二酚與偏苯三甲酸酐在200℃左右的溫度下縮合，形成5(6)-羧基熒光素；B.5(6)-羧基熒光素上的兩個(gè)羥基用特戊?；M(jìn)行保護(hù)形成二特戊?；?5(6)-羧基熒光素；C.二特戊?；?5(6)-羧基熒光素用N-羥基琥珀酰亞胺進(jìn)行活化，形成二特戊?；?5(6)-羧基熒光素-N-琥珀酰亞胺酯；D.二特戊?；?5(6)-羧基熒光素-N-琥珀酰亞胺酯與6-氨基己醇反應(yīng)生成二特戊?；?5(6)-N-(6’-羥基己基)-羰酰胺基熒光素；E.用高效柱層析方法在引入6-羥基己基后直接進(jìn)行異構(gòu)體分離，得到二特戊酰基-6-N-(6’-羥基己基)-羰酰胺基熒光素；F.用磷酸化試劑磷酸化二特戊?；?6-N-(6’-羥基己基)-羰酰胺基熒光素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于定量PCR的熒光染料的新的制備方法，其特征在于所述的用于定量PCR的熒光染料是6-FAM磷酸酰亞胺(6-FAM phosphoramidite)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于定量PCR的熒光染料的新的制備方法，其特征在于所述的用于定量PCR的熒光染料化學(xué)式為X
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于定量PCR的熒光染料的新的制備方法，其特征在于所述步驟E中高效柱層析方法為使用中壓柱層析系統(tǒng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于定量PCR的熒光染料的新的制備方法，其特征在于所述的中壓柱層析系統(tǒng)利用微球型硅膠作為固定相；
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于定量PCR的熒光染料的新的制備方法，其特征在于所述的中壓柱層析系統(tǒng)利用乙醚-二氯甲烷系統(tǒng)作為洗脫液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于定量PCR的熒光染料的新的制備方法。該方法放棄原有的合成路線即衍生化后重結(jié)晶的方法，而采用直接合成，并用高效柱層析方法在引入6－羥基己基后直接進(jìn)行異構(gòu)體分離。本發(fā)明的方法可以大大縮短生產(chǎn)周期，降低人力投入，成倍地提高反應(yīng)收率，從而大幅度地降低這類標(biāo)記生物大分子用熒光染料的成本。
文檔編號(hào)C09B57/00GK1600816SQ03151259
公開日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2003年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月28日
發(fā)明者張佩琢, 段春曉, 曹躍瓊 申請(qǐng)人:上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司