一種基于阻抗譜法的細(xì)胞活性檢測(cè)方法與裝置的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種基于阻抗譜法的針對(duì)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的活性檢測(cè)方法與裝置，培養(yǎng)皿的內(nèi)部底部是與培養(yǎng)皿底面相平行的叉指電極，叉指電極的兩極分別通過(guò)導(dǎo)線連接控制器，控制器中的單片機(jī)控制DDS頻率發(fā)生器分別發(fā)出從高頻到低頻n個(gè)頻率的正弦波，電流激勵(lì)信號(hào)經(jīng)過(guò)壓控電流源轉(zhuǎn)換后被輸出到叉指電極中，叉指電極的n個(gè)響應(yīng)電壓通過(guò)差分放大器，模數(shù)轉(zhuǎn)換后被輸入到單片機(jī)中；單片機(jī)計(jì)算出不同的頻率下的復(fù)阻抗值，根據(jù)等效電路模型和復(fù)阻抗值計(jì)算出雙電層電容值；選取等效電路中雙電層電容的電容值作為評(píng)估細(xì)胞活性的指標(biāo)，從而獲得更準(zhǔn)確的細(xì)胞活性信息，可以對(duì)細(xì)胞的活性進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)控，不會(huì)破壞細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞活性的定量測(cè)量。
【專利說(shuō)明】
-種基于阻抗譜法的細(xì)胞活性檢測(cè)方法與裝置
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種細(xì)胞活性監(jiān)測(cè)方法和裝置，細(xì)胞活性監(jiān)測(cè)特指針對(duì)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞 活性的實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞的研究是醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、生物工程等諸多學(xué)科的基礎(chǔ)，而細(xì)胞活性檢測(cè)技術(shù) 被廣泛地應(yīng)用在藥物篩選、毒理學(xué)試驗(yàn)、免疫功能評(píng)價(jià)、蛋白質(zhì)組學(xué)W及食源和藥源成分的 活性鑒定等各個(gè)領(lǐng)域。隨著抗腫瘤研究的不斷升溫，細(xì)胞活性檢測(cè)在腫瘤細(xì)胞敏感性試驗(yàn) 中也發(fā)揮著重要的作用。
[0003] 為了適應(yīng)不同條件下的檢測(cè)需要，研究人員探索出了多種細(xì)胞活性的檢測(cè)方法。 按照檢測(cè)原理的不同大致可W將實(shí)驗(yàn)室中常用的檢測(cè)手段分為染色計(jì)數(shù)法和比色法兩大 類。染色計(jì)數(shù)法是利用活細(xì)胞和死細(xì)胞對(duì)特定染料的親合力不同，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞或者死細(xì)胞 的選擇性標(biāo)記，再通過(guò)顯微鏡對(duì)標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而算出細(xì)胞的存活率。根據(jù)染料的 不同，染色計(jì)數(shù)法可W分為化學(xué)染色法和巧光染色法。比色法是利用細(xì)胞或細(xì)胞器的生理 活動(dòng)，使得特定化學(xué)物質(zhì)的顏色發(fā)生和細(xì)胞的活性成正比的改變運(yùn)一規(guī)律，通過(guò)酶標(biāo)儀等 比色儀器測(cè)定特定波長(zhǎng)的吸收率來(lái)定量地測(cè)量運(yùn)一顏色的改變，從而獲得細(xì)胞活性的量化 衡量指標(biāo)。常用的比色法有MTT法，XTT法，Alamar Blue法，LDH法，SRB法和ATP法等。除了運(yùn) 兩大類人工檢測(cè)活細(xì)胞的方法外，一些儀器如液體閃爍計(jì)數(shù)儀和流式細(xì)胞儀也可W進(jìn)行細(xì) 胞活性的檢測(cè)。
[0004] 現(xiàn)有的細(xì)胞活性檢測(cè)方法主要存在W下問(wèn)題： 1、侵入性:不管是人工檢測(cè)還是儀器檢測(cè)，現(xiàn)有的技術(shù)對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行判定之 前，都需要利用化學(xué)染料、同位素等物質(zhì)對(duì)特定生存狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記物要么侵入 細(xì)胞內(nèi)部，要么改變細(xì)胞外部的微環(huán)境。標(biāo)記過(guò)程或多或少對(duì)細(xì)胞的活性有一定的影響。同 時(shí)標(biāo)記也增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和不確定性，標(biāo)記染料本身的品質(zhì)、標(biāo)記操作的規(guī)范程度和 標(biāo)記的時(shí)間等因素都有可能影響最終的檢驗(yàn)結(jié)果。另外某些標(biāo)記染料價(jià)格昂貴，對(duì)環(huán)境也 有一定的危害性。
[0005] 2、終點(diǎn)檢測(cè):所有的檢測(cè)手段都是在細(xì)胞研究的某一個(gè)節(jié)點(diǎn)取樣對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活性 檢測(cè)，檢測(cè)完成之后，檢測(cè)用的細(xì)胞無(wú)法繼續(xù)培養(yǎng)。運(yùn)些檢測(cè)方式均屬于終點(diǎn)檢測(cè)的范疇， 目前尚沒(méi)有有效的手段能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞在生長(zhǎng)周期內(nèi)細(xì)胞活性的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
[0006] 3、對(duì)人工操作依賴性:傳統(tǒng)檢測(cè)離不開操作人員的人工操作，不同熟練程度的操 作人員對(duì)同一個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有一定的影響。利用流式細(xì)胞儀等設(shè)備雖然能在分選過(guò)程實(shí)現(xiàn) 自動(dòng)化操作，但是前期的標(biāo)記過(guò)程依然離不開檢驗(yàn)員的人工操作。人工操作的依賴性將直 接導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的重復(fù)精度難W得到突破。
[0007] 傳統(tǒng)的阻抗法，是利用特定頻率下電極之間的總阻抗作為測(cè)量指標(biāo)，運(yùn)一方法雖 然操作簡(jiǎn)便，易于實(shí)現(xiàn)。然而，系統(tǒng)的總阻抗除了包括了細(xì)胞本身的阻抗，細(xì)胞和電極的間 隙阻抗W外還包含了電極和溶液界面的容抗，電解液的電阻等。因此總阻抗無(wú)法直接地反 映細(xì)胞和電極之間粘附的緊密程度，選取其作為評(píng)估細(xì)胞活性的指標(biāo)，最終的檢測(cè)結(jié)果將 會(huì)受到電解質(zhì)、電極、細(xì)胞類型等諸多因素干擾。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有細(xì)胞活性檢測(cè)技術(shù)存在的問(wèn)題，提出一種非侵 入、無(wú)標(biāo)記、全程自動(dòng)化操作的基于阻抗譜法的細(xì)胞活性檢測(cè)方法與裝置，利用細(xì)胞和培養(yǎng) 液系統(tǒng)的復(fù)阻抗、細(xì)胞貼壁性W及細(xì)胞活性運(yùn)=者的內(nèi)在邏輯關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞活性的檢 測(cè)。
[0009] 本發(fā)明一種基于阻抗譜法的細(xì)胞活性檢測(cè)裝置采用的技術(shù)方案是:包括注有細(xì)胞 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿的內(nèi)部底部是與培養(yǎng)皿底面相平行的叉指電極，叉指電極的兩極 分別通過(guò)導(dǎo)線連接控制器，所述叉指電極具有兩個(gè)相互平行且垂直于培養(yǎng)皿底面的電極本 體，兩個(gè)電極本體之間是多個(gè)連接兩個(gè)電極本體、均與培養(yǎng)皿底面平行且上下布置的矩形 叉指，上下相鄰兩個(gè)叉指有間距，連接兩個(gè)電極本體上的叉指數(shù)量相同，相互成對(duì)上下交 叉;所述控制器包括單片機(jī)、DDS數(shù)字頻率合成器、壓控電流源、差分放大電路和A/D轉(zhuǎn)換器， 單片機(jī)的輸出端依次連接DDS數(shù)字頻率合成器、壓控電流源和叉指電極，叉指電極的輸出端 依次連接差分放大電路、A/D轉(zhuǎn)換器和單片機(jī)。
[0010] 本發(fā)明一種基于阻抗譜法的細(xì)胞活性檢測(cè)裝置的檢測(cè)方法采用的技術(shù)方案是包 括W下步驟： A、 由細(xì)胞內(nèi)液電阻Rc和細(xì)胞膜電容Cc串接后與溶液電阻Rs并接、并接后的兩端再分別 串接一個(gè)雙電層電容Cd構(gòu)成與細(xì)胞溶液相似電學(xué)特性的等效電路模型； B、 單片機(jī)控制DDS頻率發(fā)生器，分別發(fā)出從高頻到低頻n個(gè)頻率的正弦波，經(jīng)過(guò)壓控電 流源轉(zhuǎn)換為電流激勵(lì)信號(hào)，電流激勵(lì)信號(hào)被輸出到叉指電極中；叉指電極的n個(gè)響應(yīng)電壓通 過(guò)差分放大器，模數(shù)轉(zhuǎn)換后被輸入到單片機(jī)中；單片機(jī)根據(jù)激勵(lì)電流和響應(yīng)電壓計(jì)算出不 同的頻率fn下的復(fù)阻抗值Zn，即等于所述等效電路模型的復(fù)阻抗值Zn，根據(jù)等效電路模型和 復(fù)阻抗值Zn計(jì)算出雙電層電容Cd值； C、 由細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測(cè)定方法測(cè)量不同細(xì)胞活性的活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)的比例 關(guān)系，W所計(jì)算出的雙電層電容Cd值為橫坐標(biāo)，所測(cè)量的活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)的比例為縱 坐標(biāo)獲得曲線，用最小二乘法擬合曲線，將雙電層電容Cd值代入曲線方程，求得活細(xì)胞占總 細(xì)胞的百分比。
[0011] 本發(fā)明和現(xiàn)有細(xì)胞活性檢測(cè)技術(shù)相比，具有如下優(yōu)勢(shì)： 1、本發(fā)明選取等效電路中雙電層電容的電容值作為評(píng)估細(xì)胞活性的指標(biāo)，該參數(shù)和細(xì) 胞的貼壁性能具有直接的聯(lián)系，從而獲得更準(zhǔn)確的細(xì)胞活性信息，可W對(duì)細(xì)胞的活性進(jìn)行 實(shí)時(shí)的監(jiān)控。
[0012] 2、非侵入檢測(cè)手段。本發(fā)明不在培養(yǎng)液中添加任何化學(xué)試劑，同時(shí)阻抗譜法的特 性決定檢測(cè)電壓為毫伏范圍內(nèi)正弦波動(dòng)，基本不會(huì)破壞細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，因此本檢測(cè)裝置不會(huì) 對(duì)細(xì)胞的活性產(chǎn)生任何影響。
[0013] 3、非標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明不使用具有放射性的同位素、制備工藝復(fù)雜的抗體W 及各類化學(xué)染料。具有操作簡(jiǎn)單，低成本，對(duì)環(huán)境和研究人員無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)勢(shì)。
[0014] 4、全程自動(dòng)化監(jiān)測(cè)。本發(fā)明不需要專業(yè)的操作人員進(jìn)行操作，檢測(cè)結(jié)果不依賴于 操作者的熟練程度。檢測(cè)結(jié)果具有良好的可重復(fù)性。
[0015] 5、本發(fā)明檢測(cè)裝置體積小巧，可W制成手持式設(shè)備。具有應(yīng)用到P0CT即時(shí)檢測(cè)領(lǐng) 域的潛質(zhì)。
[0016] 6、本發(fā)明檢測(cè)裝置中沒(méi)有光學(xué)設(shè)備和質(zhì)譜檢測(cè)儀器中的精密元器件，成本相對(duì)低 廉。同時(shí)自動(dòng)化系統(tǒng)不依賴操作人員的操作技巧，對(duì)提高偏遠(yuǎn)地區(qū)醫(yī)療機(jī)構(gòu)的檢測(cè)和實(shí)驗(yàn) 水平具有重要意義。
[0017] 7、經(jīng)過(guò)優(yōu)化的阻抗譜等效模型使得本發(fā)明能夠更直觀地表征細(xì)胞的活性，獲得更 高測(cè)量精度。從而能實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞活性的定量測(cè)量。
[0018] 8、本發(fā)明可W為生物技術(shù)、食品科學(xué)、醫(yī)療診斷等各領(lǐng)域的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供低成本、 高靈敏度的實(shí)時(shí)細(xì)胞活性監(jiān)控。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是本發(fā)明一種基于阻抗譜法的細(xì)胞活性檢測(cè)裝置的總體結(jié)構(gòu)圖； 圖2是圖1中叉指電極結(jié)構(gòu)放大圖； 圖3是圖1中培養(yǎng)皿內(nèi)部的阻抗譜法等效電路圖； 圖4是圖1中控制器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及外接電路原理圖； 圖5是細(xì)胞活性檢測(cè)裝置的檢測(cè)方法流程圖； 圖中：1.培養(yǎng)皿；2.控制器;3.叉指電極;4.開關(guān)；5.液晶顯示屏；6.導(dǎo)線；7、8.電極本 體;9、10.接線柱；11.叉指；12.叉指間距。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 參見圖1，本發(fā)明一種基于阻抗譜法的細(xì)胞活性檢測(cè)裝置包括一個(gè)培養(yǎng)皿1，培養(yǎng) 皿1中注有細(xì)胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)皿1的內(nèi)部底部是叉指電極3,叉指電極3由生物親合類材料 制成，叉指電極3通過(guò)專用的黏合劑緊密粘合在培養(yǎng)皿1底部，使叉指電極3與培養(yǎng)皿1底面 相平行。
[0021] 叉指電極3的兩極分別通過(guò)導(dǎo)線6連接控制器2,控制器2位于培養(yǎng)皿1外部。在控制 器2的外表面安裝用于啟動(dòng)檢測(cè)裝置的開關(guān)4和用于顯示細(xì)胞活性數(shù)值的液晶顯示屏5。
[0022] 參見圖2,叉指電極3由電極本體、叉指和接線柱組成。叉指電極3有兩個(gè)電極本體， 分別是電極本體7和電極本體8,兩個(gè)電極本體7、8面對(duì)面布置，相互平行并且都垂直于培養(yǎng) 皿1底面，每個(gè)電極本體7、8向外側(cè)方延伸有一個(gè)接線柱，電極本體7向外側(cè)方延伸接線柱9、 電極本體8向外側(cè)方延伸接線柱10。兩個(gè)接線柱9、10分別連接一根導(dǎo)線6的一端，導(dǎo)線6的另 一端均穿過(guò)培養(yǎng)皿1底部連接外部的控制器2。
[0023] 在兩個(gè)垂直的電極本體7、8之間是多個(gè)叉指11，叉指11是兩個(gè)電極本體由內(nèi)側(cè)面 延伸的上下布置且相互平行的矩形結(jié)構(gòu)。每個(gè)叉指11左右長(zhǎng)度方向是長(zhǎng)邊，為叉指的長(zhǎng)。上 下相鄰兩個(gè)叉指11之間的間距是叉指間距12,所有叉指11均與培養(yǎng)皿1底面平行，均與電極 本體7、8垂直。連接兩個(gè)電極本體上的叉指11數(shù)量相同，相互成對(duì)交叉。圖2中只示出了 3對(duì) 叉指，實(shí)際應(yīng)用中叉指的對(duì)數(shù)一般在50對(duì)左右。根據(jù)所測(cè)量細(xì)胞的形狀和體積的不同，叉指 的對(duì)數(shù)，叉指間距等參數(shù)可針對(duì)性地進(jìn)行優(yōu)化。
[0024] 根據(jù)不同的細(xì)胞特性，叉指11本身的上下高度和叉指間距12運(yùn)兩個(gè)尺寸均在幾十 微米到幾百微米之間。叉指電極3采用黃金制成，金不僅是良好的導(dǎo)電材料，還具有獨(dú)特的 生物親合性，便于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，同時(shí)其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定性，使得電極本體7、8不會(huì)和溶液中 的成分發(fā)生反應(yīng)，不易被腐蝕。相對(duì)于傳統(tǒng)的平板電極，微米級(jí)的叉指電極3通過(guò)降低自身 的阻抗，縮小電極間距，提高比表面積等方式大大提高檢測(cè)的靈敏性。
[0025] 根據(jù)電化學(xué)理論，固態(tài)電極和液體電解質(zhì)的兩相接觸界面會(huì)形成具有電容特性的 雙電層結(jié)構(gòu)。當(dāng)細(xì)胞具有較高活性而緊密貼附在電極表面時(shí)。此時(shí)電極和培養(yǎng)液的接觸表 面很小，相當(dāng)于等效平板電容的極板的截面積很小，雙電層的電容值對(duì)應(yīng)的也處于很低的 數(shù)值。反之細(xì)胞喪失活性時(shí)，會(huì)逐漸脫離電極表面，此時(shí)大量培養(yǎng)液開始充斥到細(xì)胞和電極 的間隙之間，電極和培養(yǎng)液的接觸面積增大，相當(dāng)于等效平板電容的極板的截面積變大，雙 電層電容值隨之變大。因此電極和培養(yǎng)液兩相接觸面的雙電層的電容值可W定量的反映細(xì) 胞的貼壁程度，并W此來(lái)間接地表征細(xì)胞的活性。參見圖3的阻抗譜法等效電路圖，電極和 溶液界面形成的雙電層，其電學(xué)特性可W等效為電容值為Cd的電容元件。Rs代表溶液的電 阻，R。和C。分別表征細(xì)胞內(nèi)液的電阻和細(xì)胞膜的電容。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，在叉指電極3的兩個(gè)叉指 11之間，密密麻麻地貼附著貼壁細(xì)胞。在低頻激勵(lì)下，電流難W通過(guò)絕緣的細(xì)胞膜，大多數(shù) 從細(xì)胞之間間隙的溶液中通過(guò)。此時(shí)溶液電阻Rs在培養(yǎng)液的阻抗中占較大的權(quán)重。高頻激 勵(lì)時(shí)，高頻電流可W通過(guò)具有電容特性的細(xì)胞膜穿過(guò)細(xì)胞內(nèi)液。細(xì)胞內(nèi)液電阻Rc和細(xì)胞膜 電容Cc串聯(lián)支路將在溶液總阻抗中占較大的權(quán)重，而電容Cc的等效電容正好體現(xiàn)了細(xì)胞阻 礙低頻電流，導(dǎo)通高頻電流的特性。
[0026] 參加圖1和圖4,控制器2包括單片機(jī)、DDS數(shù)字頻率合成器、壓控電流源、差分放大 電路和A/D轉(zhuǎn)換器，單片機(jī)通過(guò)顯示接口電路連接外部的液晶顯示屏5,由開關(guān)4控制單片機(jī) 的電源。單片機(jī)的輸出端依次連接DDS數(shù)字頻率合成器、壓控電流源和叉指電極3,叉指電極 3的輸出端依次連接差分放大電路、A/D轉(zhuǎn)換器和單片機(jī)。單片機(jī)整個(gè)控制器2的中樞，不僅 控制整個(gè)設(shè)備的運(yùn)行，也是等效電路模型匹配算法和關(guān)鍵因子參數(shù)計(jì)算的核屯、硬件。開關(guān)4 啟動(dòng)控制器2運(yùn)行時(shí)，單片機(jī)將激勵(lì)源的頻率信號(hào)發(fā)送給孤S數(shù)字頻率合成器，孤S數(shù)字頻率 合成器根據(jù)收到的指令，發(fā)出相應(yīng)頻率的正弦波信號(hào)，該正弦波信號(hào)經(jīng)過(guò)壓控電流源電路 轉(zhuǎn)化為電流激勵(lì)信號(hào)輸入到叉指電極3。差分放大電路用于放大叉指電極3響應(yīng)的電壓信 號(hào)，并最終通過(guò)A/D轉(zhuǎn)換器模數(shù)轉(zhuǎn)換，輸入到單片機(jī)中進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。本發(fā)明采用電流激勵(lì)、 電壓響應(yīng)的方式測(cè)量電阻抗譜。相對(duì)于電壓激勵(lì)而言，電流激勵(lì)的方式可W有效提高輸入 電阻，最大限度減小接觸電阻和極化電勢(shì)所引起的誤差。
[0027] 本發(fā)明的檢測(cè)原理首先是基于細(xì)胞的活力和細(xì)胞的貼壁性之間存在著密切的關(guān) 系。當(dāng)細(xì)胞處于活躍狀態(tài)時(shí)，會(huì)分泌大量促進(jìn)貼壁的貼壁蛋白。貼壁蛋白將細(xì)胞粘附在電極 表面，此時(shí)細(xì)胞和電極之間的間距很小。當(dāng)細(xì)胞受到急性損傷發(fā)生壞死或者受到調(diào)控信號(hào) 控制開始調(diào)亡時(shí)，其活性逐漸下降，分泌貼壁蛋白的能力也隨之受到影響。貼壁蛋白的減少 使得細(xì)胞和電極表面的間隙不斷增大，直至細(xì)胞徹底死亡后將完全脫離電極表面。本發(fā)明 將貼壁類細(xì)胞植入培養(yǎng)皿1后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。在外界刺激或自身的調(diào)節(jié)下，細(xì)胞的活性會(huì) 發(fā)生改變，而運(yùn)一改變將導(dǎo)致其貼壁性發(fā)生變化，并導(dǎo)致雙電層電容的電容值發(fā)生改變。利 用檢測(cè)電路測(cè)量阻抗譜不同頻率下的復(fù)阻抗的改變，再通過(guò)電化學(xué)阻抗譜中的等效電路分 析方法，計(jì)算出界面雙電層電容的具體的數(shù)值，并W此為指標(biāo)來(lái)評(píng)估細(xì)胞的活性情況。
[0028] 參見圖1-5,本發(fā)明細(xì)胞活性檢測(cè)裝置工作時(shí)，按下啟動(dòng)開關(guān)4后，單片機(jī)控制DDS 頻率發(fā)生器發(fā)出頻率為fl的高頻正弦波，經(jīng)過(guò)壓控電流源轉(zhuǎn)換后，電流激勵(lì)信號(hào)il被輸出到 叉指電極3中。當(dāng)貼附在電極表面的細(xì)胞的數(shù)量W及細(xì)胞和電極之間的間隙大小不同時(shí)，叉 指11之間的阻抗值是不同的，因此對(duì)于相同的激勵(lì)電流，不同活力的細(xì)胞對(duì)應(yīng)的響應(yīng)電壓 是不同的。叉指電極3的響應(yīng)電壓VI通過(guò)差分放大器，模數(shù)轉(zhuǎn)換后被輸入到單片機(jī)中。單片 機(jī)根據(jù)激勵(lì)電流il和響應(yīng)電壓VI的關(guān)系計(jì)算出頻率fl下的阻抗值，具體公式如下： 導(dǎo)紙
隨后單片機(jī)控制DDS頻率發(fā)生器改變輸出頻率，發(fā)出頻率為f2的激勵(lì)電流，測(cè)得阻抗值 Z2。如此往復(fù)從高頻到低頻遍取頻譜中的所有的n個(gè)頻率后，得到不同頻率下fn的n個(gè)阻抗值 Zi，Z2，Z3 ? ? ? Zn。
[0029] 等效電路法是電阻抗譜測(cè)量技術(shù)中最經(jīng)典的分析方法之一，等效電路并不是實(shí)際 存在的電路，而是假象的和被描述模型具有相同或相近電學(xué)特性的虛擬電路。圖3是所構(gòu)建 的評(píng)估細(xì)胞活性的等效電路，等效電路具有和被測(cè)量的細(xì)胞溶液相似的電學(xué)特性，等效電 路是細(xì)胞內(nèi)液電阻Rc和細(xì)胞膜電容Cc串接后與溶液電阻Rs并接，并接后的兩端再分別串接 一個(gè)雙電層電容Cd形成。當(dāng)頻率fn的激勵(lì)電流in輸入到圖3的等效電路中時(shí)，理論上其輸出 電壓應(yīng)該為Vn，在此頻率下，虛擬等效電路的復(fù)阻抗應(yīng)該和實(shí)際測(cè)量細(xì)胞溶液的復(fù)阻抗測(cè) 量值相同，即也為Zn。根據(jù)電路原理，由等效電路模型可W得到如下的公式：
其中Rs、Rc的單位為歐姆；Rs是溶液電阻值，Rc是細(xì)胞內(nèi)液電阻值，Cd和Cc單位為法拉 第，Cd是等效的雙電層電容，Cc是細(xì)胞膜電容，鶴產(chǎn)2纖，j為虛數(shù)單位。Zn為復(fù)阻抗，其實(shí) 部為a，虛部為b。
[0030] 由于需要獲得的是雙電層電容Cd的電容值，因此只需要對(duì)公式的虛部進(jìn)行計(jì)算即 可，將復(fù)阻抗的虛部提取出來(lái)，得到雙電層電容Cd值：
其中Rs是溶液阻抗，其計(jì)算公式為：
其中P刃浴液的電阻率，是培養(yǎng)液的固有屬性，有專用的溶液電導(dǎo)測(cè)量?jī)x測(cè)量出電導(dǎo)率 后取倒數(shù)即可。1為兩個(gè)叉指11之間的間距，即叉指間距12的垂直高度，S為叉指11的水平截 面積，即上下相鄰兩叉指11正對(duì)面的面積，也是與培養(yǎng)皿1底面平行的截面積，均有設(shè)備本 身決定。
[0031] 當(dāng)通入兆赫茲W上的高頻激勵(lì)時(shí)，不論是雙電層電容還是細(xì)胞膜電容，在極高的 頻率下，均可W看成是短路導(dǎo)線。此時(shí)，電路中只有細(xì)胞內(nèi)液電阻Rc和溶液電阻Rs兩電阻并 聯(lián)，細(xì)胞內(nèi)液電阻Rc的計(jì)算公式為：
其中I為激勵(lì)電流值，U為激勵(lì)電流I下測(cè)量得到的響應(yīng)電壓值。
[0032] 雖然細(xì)胞群落呈現(xiàn)的的總體電學(xué)特性和細(xì)胞的數(shù)量密切相關(guān)，但是對(duì)于同一種細(xì) 胞而言，細(xì)胞內(nèi)液的電阻值和細(xì)胞膜的電容值呈現(xiàn)固定的比例k，運(yùn)一特性和細(xì)胞的數(shù)量無(wú) 關(guān)，運(yùn)一比例k的關(guān)系可W通過(guò)查詢常用的生物阻抗學(xué)文獻(xiàn)資料獲得，也可W實(shí)現(xiàn)通過(guò)常規(guī) 的實(shí)驗(yàn)標(biāo)定，因此細(xì)胞膜電容C。的計(jì)算公式為：
k是細(xì)胞內(nèi)液電阻值和細(xì)胞膜電容值的固定的比例值，不同的細(xì)胞選擇不同的固定的k 值;因此，利用測(cè)量得到的阻抗值結(jié)合等效電路模型可W計(jì)算出雙電層電容Cd值，表征細(xì)胞 活件的觀由居由怒。值巧據(jù)公擊計(jì)當(dāng)?shù)谜琁I，
[0033] 由于細(xì)胞的活性傳統(tǒng)上一般用活細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比來(lái)表征，因此需要建立 傳統(tǒng)細(xì)胞活性指標(biāo)和雙電層電容Cd值之間的函數(shù)關(guān)系，運(yùn)一過(guò)程叫做儀器的標(biāo)定，由雙電 層電容Cd值推算細(xì)胞的活性。本發(fā)明裝置在第一次使用前，需要進(jìn)行標(biāo)定，當(dāng)標(biāo)定完成后， 今后再檢測(cè)同種細(xì)胞，無(wú)需再進(jìn)行標(biāo)定工作。
[0034] MTT法是細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測(cè)定方法，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞活性的檢測(cè)，其原理是利 用特定的染料可W對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行選擇性染色，而死細(xì)胞由于沒(méi)有新陳代謝活動(dòng)，因此無(wú)法 被其染色。根據(jù)染色后的吸光度值來(lái)推算活細(xì)胞占全部細(xì)胞百分比。標(biāo)定時(shí)，使用MTT法和 本發(fā)明裝置同時(shí)測(cè)量不同細(xì)胞活性的例如10份細(xì)胞樣本。MTT的測(cè)量的是活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞 總數(shù)的比例關(guān)系，結(jié)果是一個(gè)百分?jǐn)?shù)。本發(fā)明裝置的測(cè)量結(jié)果是等效的雙電層電容Cd值。測(cè) 量完成后將會(huì)得到10組數(shù)據(jù)，每組數(shù)據(jù)由一個(gè)MTT測(cè)量得到的百分?jǐn)?shù)和對(duì)應(yīng)的雙電層電容 Cd運(yùn)兩個(gè)部分構(gòu)成，W雙電層電容值Cd為橫坐標(biāo)，M1T的測(cè)量值為縱坐標(biāo)，可W得到坐標(biāo)平面 上的10個(gè)點(diǎn)，繪制出特性曲線，再用最小二乘法進(jìn)行曲線擬合，最小二乘法是用來(lái)進(jìn)行曲線 擬合的常規(guī)方法，它可W根據(jù)運(yùn)10個(gè)點(diǎn)的分布，擬合出一條曲線，運(yùn)條曲線與運(yùn)10個(gè)點(diǎn)的距 離的平方和最小，通過(guò)單片機(jī)采用最小二乘法擬合曲線，將雙電層電容Cd值代入擬合曲線 方程，求得MTT法的理論測(cè)量結(jié)果，即活細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比。并W此作為衡量細(xì)胞活性 的指標(biāo)顯示在液晶顯示屏上，由此實(shí)現(xiàn)雙電層電容Cd值推算出細(xì)胞的活性。
[0035] 由于生物材料的非線性特性，每一種細(xì)胞適合的最優(yōu)測(cè)量頻率不盡相同。在標(biāo)定 時(shí)一般使用多個(gè)頻率進(jìn)行，獲得多組擬合曲線，擬合度最高的頻率為該種細(xì)胞的測(cè)量頻率。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于阻抗譜法的細(xì)胞活性檢測(cè)裝置，包括注有細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿（1 )，其特征 是:培養(yǎng)皿（1)的內(nèi)部底部是與培養(yǎng)皿（1)底面相平行的叉指電極(3)，叉指電極(3)的兩極 分別通過(guò)導(dǎo)線(6)連接控制器(2)，所述叉指電極(3)具有兩個(gè)相互平行且垂直于培養(yǎng)皿（1) 底面的電極本體(7、8 )，兩個(gè)電極本體(7、8 )之間是多個(gè)連接兩個(gè)電極本體(7、8 )、均與培 養(yǎng)皿（1)底面平行且上下布置的矩形叉指（11)，上下相鄰兩個(gè)叉指（11)有間距，連接兩個(gè)電 極本體上的叉指（11)數(shù)量相同，相互成對(duì)上下交叉;所述控制器(2)包括單片機(jī)、DDS數(shù)字頻 率合成器、壓控電流源、差分放大電路和A/D轉(zhuǎn)換器，單片機(jī)的輸出端依次連接DDS數(shù)字頻率 合成器、壓控電流源和叉指電極(3)，叉指電極(3)的輸出端依次連接差分放大電路、A/D轉(zhuǎn) 換器和單片機(jī)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于阻抗譜法的細(xì)胞活性檢測(cè)裝置，其特征是:叉指電極(3)由 生物親合類材料制成，控制器(2)的外表面裝有開關(guān)(4)和液晶顯示屏(5)，單片機(jī)通過(guò)顯示 接口電路連接液晶顯示屏(5)。3. -種如權(quán)利要求1所述基于阻抗譜法的細(xì)胞活性檢測(cè)裝置的檢測(cè)方法，其特征是包 括以下步驟： A、 由細(xì)胞內(nèi)液電阻R。和細(xì)胞膜電容C。串接后與溶液電阻Rs并接、并接后的兩端再分別 串接一個(gè)雙電層電容Cd構(gòu)成與細(xì)胞溶液相似電學(xué)特性的等效電路模型； B、 單片機(jī)控制DDS頻率發(fā)生器分別發(fā)出從高頻到低頻n個(gè)頻率的正弦波，經(jīng)過(guò)壓控電流 源轉(zhuǎn)換為電流激勵(lì)信號(hào)被輸出到叉指電極(3)中；叉指電極(3)的n個(gè)響應(yīng)電壓信號(hào)通過(guò)差 分放大器，模數(shù)轉(zhuǎn)換后被輸入到單片機(jī)中；單片機(jī)根據(jù)激勵(lì)電流和響應(yīng)電壓計(jì)算出不同的 頻率f n下的復(fù)阻抗值Zn，即等于所述等效電路模型的復(fù)阻抗值Zn，根據(jù)等效電路模型和復(fù)阻 抗值Z n計(jì)算出雙電層電容Cd值； C、 由細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測(cè)定方法測(cè)量不同細(xì)胞活性的活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)的比例 關(guān)系，以所計(jì)算出的雙電層電容Cd值為橫坐標(biāo)，所測(cè)量的活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)的比例為縱 坐標(biāo)獲得曲線，用最小二乘法擬合曲線，將雙電層電容Cd值代入曲線方程，求得活細(xì)胞占總 細(xì)胞的百分比。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征是：步驟B中，等效電路模型的復(fù)阻抗值Rs、R。的單位為歐姆，1是溶液電阻值，R。是細(xì)胞內(nèi)液電阻值，Cd和C。單位為法拉第，Cd是 雙電層電容，C。是細(xì)胞膜電容，叫.:=2tt4，j為虛數(shù)單位;Zn為復(fù)阻抗，a為實(shí)部，b為虛部。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征是：步驟B中，雙電層電容?，P為溶 液電阻率;k是根據(jù)不同細(xì)胞選定的固定比值，1為兩個(gè)叉指（11)之間的間距，S為叉指（11) 與培養(yǎng)皿(1)底面平行的截面積;I為激勵(lì)電流值;U為激勵(lì)電流I下測(cè)量得到的響應(yīng)電壓值。
【文檔編號(hào)】G01N27/22GK106047678SQ201610335957
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月20日
【發(fā)明人】張榮標(biāo), 孫健
【申請(qǐng)人】江蘇大學(xué)