專利名稱：動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)傷口愈合的細(xì)胞阻抗成像系統(tǒng)及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及研究和分析與傷口愈合相關(guān)的細(xì)胞與分子機(jī)理的領(lǐng)域，尤其涉及一種動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)傷口愈合的細(xì)胞阻抗成像系統(tǒng)及方法。
背景技術(shù)：
傷口愈合實(shí)驗(yàn)已經(jīng)在組織培養(yǎng)和組織工程中開展了很多年，主要被用于監(jiān)測(cè)和研究各種細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等的行為，以評(píng)價(jià)在不同細(xì)胞培養(yǎng)條件下的細(xì)胞增殖和遷移能力，還是一種研究和評(píng)價(jià)藥物、生化試劑或生物分子作用效果或作用機(jī)理的重要手段。現(xiàn)有的常規(guī)的技術(shù)方法是使用動(dòng)物模型開展實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)人員在活體動(dòng)物的表皮制造傷口，然后包覆藥物，經(jīng)過幾次反復(fù)換藥和觀察，從而得到結(jié)論。此類方法的缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)過程麻煩，所需試劑量大，并且由于是活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果的一致性和重復(fù)性難以保證。利用成像的方法開展傷口愈合實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)有的突出的技術(shù)手段包括光學(xué)成像和生物電子學(xué)成像。光學(xué)成像的方法最常見的是用光學(xué)顯微鏡拍攝圖像或者影像記錄傷口愈合的整個(gè)過程中的變化。它雖然是一種簡便易行的方法，但是只能用作定性地觀察和粗略地估算，而不能定量地觀察單個(gè)細(xì)胞的貼附、遷移等狀態(tài)和行為。生物電子學(xué)是涉及生物材料和電子裝置的交叉領(lǐng)域，已成功應(yīng)用于細(xì)胞和生物分子的分析和檢測(cè)。一種生物電子學(xué)的用于監(jiān)測(cè)傷口愈合的技術(shù)方法是將細(xì)胞培養(yǎng)在微電極上，通過測(cè)量細(xì)胞在微電極上貼附和遷移時(shí)導(dǎo)致的電極間的阻抗的改變來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)傷口愈合過程。這類方法的不足是實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞依賴于微電極的結(jié)構(gòu)和布局的設(shè)計(jì)，并且加工成本較高；同時(shí)，細(xì)胞在微電極表面的分布情況也限制了使用該類裝置和方法檢測(cè)的一致性和重復(fù)性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠同時(shí)定性和定量地動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)傷口愈合的細(xì)胞阻抗成像系統(tǒng)及方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)傷口愈合的細(xì)胞阻抗成像系統(tǒng)，它包括光學(xué)顯微鏡、CCD相機(jī)、傳感器單兀、加熱片、電動(dòng)載物臺(tái)、光導(dǎo)管、激光聚焦物鏡、激光二極管控制器、載物臺(tái)控制器、溫控儀、鎖相放大器和恒壓儀等；其中，所述光學(xué)顯微鏡的上部具有一個(gè)觀察物鏡；觀察物鏡的鏡頭朝下，用于對(duì)進(jìn)入CCD相機(jī)的光束進(jìn)行聚焦；CCD相機(jī)裝配在光學(xué)顯微鏡的上方，用于拍攝圖像或者影像；傳感器單元由環(huán)氧樹脂膠結(jié)劑固定在加熱片的上表面，用于測(cè)量細(xì)胞阻抗；加熱片放置在電動(dòng)載物臺(tái)的上表面， 并由電動(dòng)載物臺(tái)上的玻片夾固定，用于給傳感器單元加熱，加熱片的中心具有一方形通光孔；電動(dòng)載物臺(tái)裝配在光學(xué)顯微鏡的中部，正面朝上，用于承載傳感器單元和加熱片，電動(dòng)載物臺(tái)的中心具有一方形通光孔；光導(dǎo)管裝配在光學(xué)顯微鏡的下部基座上，用于向上傳導(dǎo)激光束；激光聚焦物鏡裝配在光導(dǎo)管上方，鏡頭朝上，用于聚焦激光束；激光二極管控制器與光導(dǎo)管相連；載物臺(tái)控制器與電動(dòng)載物臺(tái)相連；溫控儀與加熱片相連，用于控制加熱片發(fā)熱，維持傳感器單元的溫度恒定；鎖相放大器與傳感器單元相連，用于給傳感器單元施加激勵(lì)信號(hào)，同時(shí)檢測(cè)響應(yīng)信號(hào)；恒壓儀與傳感器單元相連，用于給傳感器單元施加恒定電壓信號(hào)。進(jìn)一步地，所述傳感器單元包括鉬絲電極、Ag/AgCl電極和電解液-絕緣層-半導(dǎo)體結(jié)構(gòu)的半導(dǎo)體芯片；該芯片的結(jié)構(gòu)又包括絕緣層、摻雜雜質(zhì)的硅片層、歐姆接觸層等；鉬絲電極與鎖相放大器相連，Ag/AgCl電極與恒壓儀相連，樣品細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液置于絕緣層上，鉬絲電極和Ag/AgCl電極均插入細(xì)胞培養(yǎng)液中，分別用作細(xì)胞阻抗測(cè)量時(shí)的對(duì)電極和參考電極；摻雜雜質(zhì)的硅片層通過雜質(zhì)摻雜成為P型或N型半導(dǎo)體；絕緣層通過熱氧化生長在摻雜雜質(zhì)的硅片層的上表面；歐姆接觸層20通過濺射沉積在摻雜雜質(zhì)的硅片層的下表面?！N應(yīng)用上述系統(tǒng)對(duì)傷口愈合進(jìn)行動(dòng)態(tài)細(xì)胞阻抗成像的方法，該方法包括以下步驟
(1)將樣品細(xì)胞種植到傳感器單元的上表面，即絕緣層的上表面，并培養(yǎng)2-4天；
(2)使用醫(yī)用移液槍或者手術(shù)刀或者其它尖端尺寸微小并且較硬的無細(xì)胞毒性的工具，在傳感器單元上表面刮擦取走一部分細(xì)胞，形成傷口 ；
(3)激光二極管控制器發(fā)射的激光束由光導(dǎo)管傳導(dǎo)至激光聚焦物鏡，并由激光聚焦物鏡聚焦后照射到傳感器單元的下表面；
(4)載物臺(tái)控制器控制電動(dòng)載物臺(tái)連同固定在其上的加熱片和傳感器單元一起水平移動(dòng)至激光照射的位置上沒有樣品細(xì)胞貼附的位置，鎖相放大器對(duì)此位置進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算得到的阻抗值作為基準(zhǔn)阻抗值，記作Ztl ；
(5)載物臺(tái)控制器控制電動(dòng)載物臺(tái)連同固定在其上的加熱片和傳感器單元一起在水平平面內(nèi)自動(dòng)移動(dòng)，形成一系列激光照射位置，每次移動(dòng)的距離小于單個(gè)細(xì)胞尺度；
(6)鎖相放大器對(duì)上述每一激光照射位置進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算得到這些點(diǎn)的細(xì)胞阻抗值Zp
(7)將每一位置點(diǎn)的細(xì)胞阻抗值與基準(zhǔn)阻抗值作差再除以基準(zhǔn)阻抗值，作為細(xì)胞阻抗圖像的一個(gè)像素點(diǎn)的數(shù)值，如測(cè)量的第一個(gè)像素點(diǎn)的數(shù)值為(Z1- Z0)/ Ztl，再將所有像素點(diǎn)按照相互間的實(shí)際位置關(guān)系組合成為一幅細(xì)胞阻抗圖像；CCD相機(jī)拍照記錄下此時(shí)的細(xì)胞分布形態(tài)，作為對(duì)照?qǐng)D像；
(8)重復(fù)上述步驟4，此時(shí)得到的基準(zhǔn)阻抗值為Ztl’；
(9)計(jì)算細(xì)胞阻抗補(bǔ)償因子f=Z0’ / Z0，用以補(bǔ)償由于樣品細(xì)胞的總數(shù)目或者貼附情況等隨時(shí)間發(fā)生變化引入的單個(gè)像素點(diǎn)測(cè)量時(shí)相比于第一幅細(xì)胞阻抗圖像中該像素點(diǎn)的
誤差;
(10)重復(fù)上述步驟5-6，此時(shí)得到的細(xì)胞阻抗值為Z/、Z2’、Z3,、I、Z5’、……；
(11)重復(fù)上述步驟7，將每一位置點(diǎn)的細(xì)胞阻抗值與基準(zhǔn)阻抗值作差再除以基準(zhǔn)阻抗值后再乘以細(xì)胞阻抗補(bǔ)償因子f，作為細(xì)胞阻抗圖像的一個(gè)像素點(diǎn)的數(shù)值，如此時(shí)得到的第一個(gè)像素點(diǎn)的數(shù)值將為f (Z/ - Zc/)/ Ztl'再將所有像素點(diǎn)按照相互間的實(shí)際位置關(guān)系組合成為一幅細(xì)胞阻抗圖像；CCD相機(jī)拍照記錄下此時(shí)的細(xì)胞分布形態(tài)，作為對(duì)照?qǐng)D像；
(12)順序循環(huán)重復(fù)上述步驟8-11，直至步驟2中形成的人為傷口愈合完成后停止，從而得到一系列反應(yīng)傷口愈合過程的時(shí)間上連續(xù)的細(xì)胞阻抗圖像及其對(duì)照?qǐng)D像。
本發(fā)明的有益效果是
I、本發(fā)明的系統(tǒng)及其方法可以對(duì)傷口愈合的過程以數(shù)值作為像素點(diǎn)內(nèi)容成像，從而能夠定量反映傷口的大小，傷口愈合的速度、方向和質(zhì)量。2、本發(fā)明的系統(tǒng)及方法可用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)群細(xì)胞的貼附、增殖和伸展形成致密連接的行為過程，亦可用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)單個(gè)細(xì)胞的貼附和遷移運(yùn)動(dòng)。3、本發(fā)明的系統(tǒng)及方法還可用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)藥物、生化試劑或生物分子作用下的傷口愈合狀況，從而鑒別、分析和評(píng)價(jià)這些物質(zhì)的作用效果和作用機(jī)理。


圖I是本發(fā)明的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖2是本發(fā)明傳感器單元的阻抗檢測(cè)原理圖3是本發(fā)明傷口愈合的細(xì)胞阻抗成像方法圖中，光學(xué)顯微鏡I、觀察物鏡2、CCD相機(jī)3、傳感器單元4、加熱片5、電動(dòng)載物臺(tái)6、光導(dǎo)管7、激光聚焦物鏡8、激光二極管控制器9、載物臺(tái)控制器10、溫控儀11、鎖相放大器12、 恒壓儀13、鉬絲電極14、Ag/AgCl電極15、細(xì)胞培養(yǎng)液16、樣品細(xì)胞17、絕緣層18、半導(dǎo)體 19、歐姆接觸20、細(xì)胞貼附輪廓21、人為傷口 22。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。如圖I所示，本發(fā)明動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)傷口愈合的細(xì)胞阻抗成像系統(tǒng)包括光學(xué)顯微鏡I、 CCD相機(jī)3、傳感器單元4、加熱片5、電動(dòng)載物臺(tái)6、光導(dǎo)管7、激光聚焦物鏡8、激光二極管控制器9、載物臺(tái)控制器10、溫控儀11、鎖相放大器12、恒壓儀13。其中，光學(xué)顯微鏡I的上部具有一個(gè)觀察物鏡2 ;觀察物鏡2的鏡頭朝下，用于對(duì)進(jìn)入CCD相機(jī)3的光束進(jìn)行聚焦；CCD 相機(jī)3裝配在光學(xué)顯微鏡I的上方，用于拍攝圖像或者影像；傳感器單元4由環(huán)氧樹脂膠結(jié)劑固定在加熱片5的上表面，用于測(cè)量細(xì)胞阻抗；加熱片5放置在電動(dòng)載物臺(tái)6的上表面， 并由電動(dòng)載物臺(tái)6上的玻片夾固定，用于給傳感器單元4加熱，加熱片5的中心具有一方形通光孔；電動(dòng)載物臺(tái)6裝配在光學(xué)顯微鏡I的中部，正面朝上，用于承載傳感器單元4和加熱片5，并且能夠在其內(nèi)部的步進(jìn)電機(jī)的驅(qū)動(dòng)下在水平平面內(nèi)精細(xì)位移，電動(dòng)載物臺(tái)6的中心具有一方形通光孔；光導(dǎo)管7裝配在光學(xué)顯微鏡I的下部基座上，用于向上傳導(dǎo)激光束； 激光聚焦物鏡8裝配在光導(dǎo)管7上方，鏡頭朝上，用于聚焦激光束，聚焦后的激光束穿過電動(dòng)載物臺(tái)6中心的通光孔和加熱片5中心的通光孔照射到傳感器單元4的下表面；激光二極管控制器9與光導(dǎo)管7相連，用于產(chǎn)生激光和調(diào)制激光的強(qiáng)度；載物臺(tái)控制器10與電動(dòng)載物臺(tái)6相連，用于接收用戶的編程命令，之后控制電動(dòng)載物臺(tái)6按照編程命令設(shè)定的路徑水平移動(dòng)；溫控儀11通過與加熱片5相連，用于控制加熱片5發(fā)熱，維持傳感器單元4的溫度恒定；鎖相放大器12與傳感器單元4相連，用于給傳感器單元4施加激勵(lì)信號(hào)，同時(shí)檢測(cè)響應(yīng)信號(hào)；恒壓儀13與傳感器單元4相連，用于給傳感器單元4施加恒定電壓信號(hào)。如圖2所示，傳感器單元4包括鉬絲電極14、Ag/AgCl電極15、電解液-絕緣層-半導(dǎo)體(EIS)結(jié)構(gòu)的半導(dǎo)體芯片，該芯片的結(jié)構(gòu)又包括絕緣層18、摻雜雜質(zhì)的硅片層 19、歐姆接觸層20。鉬絲電極14與鎖相放大器12相連，Ag/AgCl電極15與恒壓儀13相連，樣品細(xì)胞17和細(xì)胞培養(yǎng)液16置于絕緣層18上，鉬絲電極14和Ag/AgCl電極15均插入細(xì)胞培養(yǎng)液16中，分別用作細(xì)胞阻抗測(cè)量時(shí)的對(duì)電極和參考電極。樣品細(xì)胞17，典型的如腫瘤細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞以及能發(fā)生貼附生長和遷移運(yùn)動(dòng)的其它細(xì)胞。半導(dǎo)體芯片采用微機(jī)電加工工藝制造而成，具體地說，絕緣層18通過熱氧化生長在摻雜雜質(zhì)的硅片層19的上表面；摻雜雜質(zhì)的硅片層19通過雜質(zhì)摻雜成為P型或N型半導(dǎo)體；歐姆接觸層20為強(qiáng)導(dǎo)電性的金屬材料，如金屬鋁，通過濺射沉積在摻雜雜質(zhì)的硅片層19的下表面。本發(fā)明利用了上述半導(dǎo)體芯片的內(nèi)光電效應(yīng)，即當(dāng)半導(dǎo)體受到一定波長的光照射時(shí)，半導(dǎo)體吸收光子， 發(fā)生禁帶到導(dǎo)帶的躍遷，產(chǎn)生了電子空穴對(duì)。當(dāng)在半導(dǎo)體芯片的上下表面施加偏置電壓時(shí)， 摻雜雜質(zhì)的娃片層19中產(chǎn)生耗盡層，電子和空穴被耗盡層的內(nèi)電場(chǎng)分離，同時(shí)耗盡層外的電子空穴對(duì)中的一部分總能在未重新復(fù)合前擴(kuò)散進(jìn)入耗盡層，此過程中電子空穴對(duì)的移動(dòng)形成光生電流。具體地說，鎖相放大器12通過位于其上的對(duì)電極信號(hào)端子CE施加交流電壓小信號(hào)到鉬絲電極14上，同時(shí)它的工作電極信號(hào)端子WE與歐姆接觸層20相連，能夠檢測(cè)半導(dǎo)體芯片的響應(yīng)電流信號(hào)，根據(jù)這一電流信號(hào)大小就能換算得到上述回路中的阻抗大?。缓銐簝x13通過位于其上的參考電極信號(hào)端子RE施加直流偏置電壓信號(hào)到Ag/AgCl電極15上，使半導(dǎo)體內(nèi)部產(chǎn)生耗盡層；經(jīng)過激光聚焦物鏡8聚焦后的激光束照射到半導(dǎo)體芯片的下表面，使得該照射位置的局部光生電流變大。當(dāng)樣品細(xì)胞17在半導(dǎo)體芯片上表面貼附、伸展形成致密連接時(shí)，會(huì)阻礙檢測(cè)回路和激光照射區(qū)域的電流信號(hào)通過，使得測(cè)量得到的回路阻抗值變大。反之當(dāng)樣品細(xì)胞17從半導(dǎo)體芯片上表面脫附或遷移到別處時(shí)，原激光照射位置的阻抗值將變小。將激光照射在沒有細(xì)胞貼附的位置時(shí)測(cè)得的阻抗值記作基準(zhǔn)阻抗值，將激光照射在有細(xì)胞貼附的位置時(shí)測(cè)得的阻抗值記作細(xì)胞阻抗值，利用本發(fā)明的系統(tǒng)及方法就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的貼附和遷移行為的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。如圖3所示，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明的系統(tǒng)對(duì)傷口愈合進(jìn)行動(dòng)態(tài)細(xì)胞阻抗成像的方法。該方法的具體實(shí)施步驟包括
1、將樣品細(xì)胞17種植到傳感器單元4的上表面，即絕緣層18的上表面，并培養(yǎng)2-4
天;
2、使用醫(yī)用移液槍或者手術(shù)刀或者其它尖端尺寸微小并且較硬的無細(xì)胞毒性的工具， 在傳感器單元4上表面刮擦取走一部分細(xì)胞，形成傷口 22 ；
3、激光二極管控制器9發(fā)射的激光束由光導(dǎo)管7傳導(dǎo)至激光聚焦物鏡8，并由激光聚焦物鏡8聚焦后照射到傳感器單元4的下表面；
4、載物臺(tái)控制器10控制電動(dòng)載物臺(tái)6連同固定在其上的加熱片5和傳感器單元4一起水平移動(dòng)至激光照射的位置上沒有樣品細(xì)胞17貼附的位置，鎖相放大器12對(duì)此位置進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算得到的阻抗值作為基準(zhǔn)阻抗值，記作Ztl ；
5、載物臺(tái)控制器10控制電動(dòng)載物臺(tái)6連同固定在其上的加熱片5和傳感器單元4一起在水平平面內(nèi)自動(dòng)移動(dòng)，形成一系列激光照射位置，每次移動(dòng)的距離小于單個(gè)細(xì)胞尺度；
6、鎖相放大器12對(duì)上述每一激光照射位置進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算得到這些點(diǎn)的細(xì)胞阻抗值 Z1-, Z2 > Z3 > Z4 > Z5-,......；
7、將每一位置點(diǎn)的細(xì)胞阻抗值與基準(zhǔn)阻抗值作差再除以基準(zhǔn)阻抗值，作為細(xì)胞阻抗圖像的一個(gè)像素點(diǎn)的數(shù)值，如測(cè)量的第一個(gè)像素點(diǎn)的數(shù)值為( - Z0)/ Ztl，再將所有像素點(diǎn)按照相互間的實(shí)際位置關(guān)系組合成為一幅細(xì)胞阻抗圖像；CCD相機(jī)3拍照記錄下此時(shí)的細(xì)胞分布形態(tài)，作為對(duì)照?qǐng)D像；
8、重復(fù)上述步驟4，此時(shí)得到的基準(zhǔn)阻抗值為Ztl’；
9、計(jì)算細(xì)胞阻抗補(bǔ)償因子f=Zc// Ztl，用以補(bǔ)償由于樣品細(xì)胞17的總數(shù)目或者貼附情況等隨時(shí)間發(fā)生變化引入的單個(gè)像素點(diǎn)測(cè)量時(shí)相比于第一幅細(xì)胞阻抗圖像中該像素點(diǎn)的誤差；
10、重復(fù)上述步驟5-6，此時(shí)得到的細(xì)胞阻抗值為Z/、z2’、Z/、τ:、τ、……；
11、重復(fù)上述步驟7，將每一位置點(diǎn)的細(xì)胞阻抗值與基準(zhǔn)阻抗值作差再除以基準(zhǔn)阻抗值后再乘以細(xì)胞阻抗補(bǔ)償因子f，作為細(xì)胞阻抗圖像的一個(gè)像素點(diǎn)的數(shù)值，如此時(shí)得到的第一個(gè)像素點(diǎn)的數(shù)值將為(Z/ - Zc/)/ Ztl'再將所有像素點(diǎn)按照相互間的實(shí)際位置關(guān)系組合成為一幅細(xì)胞阻抗圖像；CCD相機(jī)3拍照記錄下此時(shí)的細(xì)胞分布形態(tài)，作為對(duì)照?qǐng)D像；
12、順序循環(huán)重復(fù)上述步驟8-11，直至步驟2中形成的人為傷口22愈合完成后停止，從而得到一系列反應(yīng)傷口愈合過程的時(shí)間上連續(xù)的細(xì)胞阻抗圖像及其對(duì)照?qǐng)D像。從圖3所示的其中一幅典型細(xì)胞阻抗圖像示意圖中可以看出，細(xì)胞阻抗圖像可以直觀地描繪出細(xì)胞貼附的全貌，包括細(xì)胞貼附的輪廓和傷口的形態(tài)以及大小。由于進(jìn)行了連續(xù)地繪圖，本發(fā)明的系統(tǒng)還能夠監(jiān)測(cè)傷口愈合的動(dòng)態(tài)參數(shù)，包括傷口愈合的速度、愈合的方向；進(jìn)一步的，本發(fā)明的系統(tǒng)還能夠定性和定量地評(píng)價(jià)傷口愈合的好壞；能夠評(píng)價(jià)和分析藥物、生化試劑或生物分子對(duì)傷口愈合的作用效果和作用機(jī)理。本發(fā)明所述系統(tǒng)及其方法并不限于上述具體實(shí)施方式
中的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案得到的其它實(shí)施方式，同樣屬于本發(fā)明的技術(shù)創(chuàng)新范圍。
權(quán)利要求
1.一種動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)傷口愈合的細(xì)胞阻抗成像系統(tǒng)，其特征在于，它包括光學(xué)顯微鏡(I)、 C⑶相機(jī)(3)、傳感器單元(4)、加熱片(5)、電動(dòng)載物臺(tái)(6)、光導(dǎo)管(7)、激光聚焦物鏡(8)、 激光二極管控制器(9)、載物臺(tái)控制器(10)、溫控儀(11)、鎖相放大器(12)和恒壓儀(13) 等；其中，所述光學(xué)顯微鏡(I)的上部具有一個(gè)觀察物鏡(2);觀察物鏡(2)的鏡頭朝下，用于對(duì)進(jìn)入(XD相機(jī)(3)的光束進(jìn)行聚焦；(XD相機(jī)(3)裝配在光學(xué)顯微鏡(I)的上方,用于拍攝圖像或者影像；傳感器單元(4)由環(huán)氧樹脂膠結(jié)劑固定在加熱片(5)的上表面，用于測(cè)量細(xì)胞阻抗；加熱片(5)放置在電動(dòng)載物臺(tái)(6)的上表面，并由電動(dòng)載物臺(tái)(6)上的玻片夾固定，用于給傳感器單元(4)加熱，加熱片(5)的中心具有一方形通光孔；電動(dòng)載物臺(tái)(6)裝配在光學(xué)顯微鏡(I)的中部，正面朝上，用于承載傳感器單元(4)和加熱片(5)，電動(dòng)載物臺(tái)(6)的中心具有一方形通光孔；光導(dǎo)管(7)裝配在光學(xué)顯微鏡(I)的下部基座上，用于向上傳導(dǎo)激光束；激光聚焦物鏡(8)裝配在光導(dǎo)管(7)上方，鏡頭朝上，用于聚焦激光束；激光二極管控制器(9)與光導(dǎo)管(7)相連；載物臺(tái)控制器(10)與電動(dòng)載物臺(tái)(6)相連；溫控儀(11) 與加熱片(5)相連，用于控制加熱片(5)發(fā)熱，維持傳感器單元(4)的溫度恒定；鎖相放大器 (12)與傳感器單元(4)相連，用于給傳感器單元(4)施加激勵(lì)信號(hào)，同時(shí)檢測(cè)響應(yīng)信號(hào)；恒壓儀(13 )與傳感器單元(4 )相連，用于給傳感器單元(4 )施加恒定電壓信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)傷口愈合的細(xì)胞阻抗成像系統(tǒng)，其特征在于，所述傳感器單元(4)包括鉬絲電極(14)、Ag/AgCl電極(15)和電解液-絕緣層-半導(dǎo)體結(jié)構(gòu)的半導(dǎo)體芯片；該芯片的結(jié)構(gòu)又包括絕緣層(18)、摻雜雜質(zhì)的硅片層(19)、歐姆接觸層(20) 等；鉬絲電極(14)與鎖相放大器(12)相連，Ag/AgCl電極(15)與恒壓儀(13)相連，樣品細(xì)胞(17)和細(xì)胞培養(yǎng)液(16)置于絕緣層(18)上，鉬絲電極(14)和Ag/AgCl電極(15)均插入細(xì)胞培養(yǎng)液(16)中，分別用作細(xì)胞阻抗測(cè)量時(shí)的對(duì)電極和參考電極；摻雜雜質(zhì)的硅片層 (19)通過雜質(zhì)摻雜成為P型或N型半導(dǎo)體；絕緣層(18)通過熱氧化生長在摻雜雜質(zhì)的硅片層(19)的上表面；歐姆接觸層(20)通過濺射沉積在摻雜雜質(zhì)的硅片層(19)的下表面。
3.一種應(yīng)用權(quán)利要求I所述系統(tǒng)對(duì)傷口愈合進(jìn)行動(dòng)態(tài)細(xì)胞阻抗成像的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)將樣品細(xì)胞(17)種植到傳感器單元(4)的上表面，即絕緣層(18)的上表面，并培養(yǎng)2-4天；(2)使用醫(yī)用移液槍或者手術(shù)刀或者其它尖端尺寸微小并且較硬的無細(xì)胞毒性的工具，在傳感器單元(4)上表面刮擦取走一部分細(xì)胞，形成傷口(22)；(3)激光二極管控制器(9)發(fā)射的激光束由光導(dǎo)管(7)傳導(dǎo)至激光聚焦物鏡(8)，并由激光聚焦物鏡(8)聚焦后照射到傳感器單元(4)的下表面；(4)載物臺(tái)控制器(10)控制電動(dòng)載物臺(tái)(6)連同固定在其上的加熱片(5)和傳感器單元(4) 一起水平移動(dòng)至激光照射的位置上沒有樣品細(xì)胞(17)貼附的位置，鎖相放大器(12) 對(duì)此位置進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算得到的阻抗值作為基準(zhǔn)阻抗值，記作Ztl ；(5)載物臺(tái)控制器(10)控制電動(dòng)載物臺(tái)(6)連同固定在其上的加熱片(5)和傳感器單元(4) 一起在水平平面內(nèi)自動(dòng)移動(dòng)，形成一系列激光照射位置，每次移動(dòng)的距離小于單個(gè)細(xì)胞尺度；(6)鎖相放大器(12)對(duì)上述每一激光照射位置進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算得到這些點(diǎn)的細(xì)胞阻抗(7)將每一位置點(diǎn)的細(xì)胞阻抗值與基準(zhǔn)阻抗值作差再除以基準(zhǔn)阻抗值，作為細(xì)胞阻抗圖像的一個(gè)像素點(diǎn)的數(shù)值，如測(cè)量的第一個(gè)像素點(diǎn)的數(shù)值為(Z1- Z0)/ Ztl，再將所有像素點(diǎn)按照相互間的實(shí)際位置關(guān)系組合成為一幅細(xì)胞阻抗圖像；CCD相機(jī)(3)拍照記錄下此時(shí)的細(xì)胞分布形態(tài)，作為對(duì)照?qǐng)D像；(8)重復(fù)上述步驟4，此時(shí)得到的基準(zhǔn)阻抗值為Ztl’；(9)計(jì)算細(xì)胞阻抗補(bǔ)償因子f=Z0V Ztl，用以補(bǔ)償由于樣品細(xì)胞(17)的總數(shù)目或者貼附情況等隨時(shí)間發(fā)生變化引入的單個(gè)像素點(diǎn)測(cè)量時(shí)相比于第一幅細(xì)胞阻抗圖像中該像素點(diǎn)的誤差；(10)重復(fù)上述步驟5-6，此時(shí)得到的細(xì)胞阻抗值為Z/、Z2’、Z3,、I、Z5’、……；(11)重復(fù)上述步驟7，將每一位置點(diǎn)的細(xì)胞阻抗值與基準(zhǔn)阻抗值作差再除以基準(zhǔn)阻抗值后再乘以細(xì)胞阻抗補(bǔ)償因子f，作為細(xì)胞阻抗圖像的一個(gè)像素點(diǎn)的數(shù)值，如此時(shí)得到的第一個(gè)像素點(diǎn)的數(shù)值將為f (Z/- Z0O/ Ztl'再將所有像素點(diǎn)按照相互間的實(shí)際位置關(guān)系組合成為一幅細(xì)胞阻抗圖像；CCD相機(jī)(3)拍照記錄下此時(shí)的細(xì)胞分布形態(tài)，作為對(duì)照?qǐng)D像；(12)順序循環(huán)重復(fù)上述步驟8-11，直至步驟2中形成的人為傷口(22)愈合完成后停止，從而得到一系列反應(yīng)傷口愈合過程的時(shí)間上連續(xù)的細(xì)胞阻抗圖像及其對(duì)照?qǐng)D像。
全文摘要
本發(fā)明公開了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)傷口愈合的細(xì)胞阻抗成像系統(tǒng)及方法，所述傷口愈合包括傷口形成后細(xì)胞脫離其原先貼附的位置發(fā)生遷移運(yùn)動(dòng)，在新的位置重新貼附并和周圍細(xì)胞形成致密連接，最終完成傷口愈合的整個(gè)動(dòng)態(tài)過程。利用本發(fā)明可以測(cè)量得到以細(xì)胞阻抗值相對(duì)基準(zhǔn)阻抗值的變化率作為像素點(diǎn)內(nèi)容的一系列高分辨率數(shù)值圖像，從而研究、分析與傷口愈合相關(guān)的細(xì)胞和分子機(jī)理。
文檔編號(hào)G01N21/84GK102586092SQ20121002954
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月10日
發(fā)明者吳成雄, 周潔, 哈達(dá), 王平, 胡寧 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)