植物乳桿菌ndc75017在制備微生物膜中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了植物乳桿菌NDC75017在制備微生物膜中的應(yīng)用，屬于微生物膜制備技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的植物乳桿菌NDC75017，于2011年11月8日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.5448。本發(fā)明所提供的植物乳桿菌具有很強的生物膜形成能力，其生物膜形成能力至少比其他10種78株乳酸菌的高出67％，并且在相同時間內(nèi)，利用該植物乳桿菌獲得的生物膜至少比其他乳酸菌厚51.6％。
【專利說明】
植物乳桿菌NDC75017在制備微生物膜中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物乳桿菌NDC75017在制備微生物膜中的應(yīng)用，屬于微生物膜制備技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌生物膜是一種具有功能性的、復(fù)雜的微生物群落，其附著在生物或非生物表 面上，并包裹于菌體自身分泌的胞外多聚物中，包括多糖、蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)酶、DNA、表面活性劑 及脂類等。
[0003] 在大多數(shù)生物膜中，微生物只占干重的10%，而生物膜中的基質(zhì)混合物則占了 90%左右。生物膜的基質(zhì)混合物主要是由微生物自身產(chǎn)生的胞外物質(zhì)組成，而生物膜細(xì)胞 則嵌在里面。此基質(zhì)是由不同類型的生物聚合物組成的，其被稱為胞外聚合物 (extracellular polymeric subss1:ances,EPS)。主要包括多糖、蛋白質(zhì)、DNA、RNA、表面活 性劑、脂質(zhì)和水等。它形成了生物膜的Ξ維結(jié)構(gòu)，并負(fù)責(zé)粘附于表面并支撐生物膜的內(nèi)部凝 聚力。生物膜的形成是完全不同于浮游狀態(tài)下的一種生活方式，由微生物分泌的生物膜胞 外復(fù)合物和彼此之間分子的相互作用尚未被定義，且運些復(fù)合物成分的貢獻(xiàn)在分子水平上 還知之甚少。
[0004] 乳酸菌生物膜能夠為細(xì)菌提供一個小的生境，是細(xì)菌在此環(huán)境下進(jìn)行能量代謝、 物質(zhì)交換等行為，產(chǎn)生的胞外聚合物能夠形成牢固的生物膜結(jié)構(gòu)并能粘附在宿主載體表 面，有助于其中的乳酸菌發(fā)揮其有益的功能，并能夠?qū)?xì)菌細(xì)胞起到保護(hù)的作用，抵抗外界 的壓力，如耐酸、抗氧化等。一直W來，生物膜的研究多集中在醫(yī)學(xué)、致病菌方面，主要關(guān)注 如何去除生物膜結(jié)構(gòu)，而對乳酸菌生物膜的研究還很少。乳酸菌因其具有多種益生功能而 廣泛的為人們使用，隨著人們生活水平的提高，健康問題的關(guān)注度越來越高。然而，由于乳 酸菌的種類多菌株數(shù)量巨大，并且微生物膜產(chǎn)生能力各異，甚至有很多菌株沒有微生物膜 的產(chǎn)生能力。因此，目前尚缺少沒有具有較強微生物成膜能力的乳酸菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種成膜能力強的乳酸菌，該乳酸菌為植物 乳桿菌NDC 75017。該植物乳桿菌于2011年11月8日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏號為CGMCC NO.5448。
[0006] 本發(fā)明還提供了一種利用植物乳桿菌NDC 75017制備微生物膜的方法，該方法的 步驟如下：
[0007] 1)活化植物乳桿菌NDC 75017，傳代培養(yǎng)至第Ξ代后調(diào)節(jié)菌液濃度至ODsoo?為2.0; [000引2)利用培養(yǎng)基對步驟1)所得的調(diào)節(jié)濃度后的菌液進(jìn)行稀釋，混勻后放置在培養(yǎng)容 器中在37°C下恒溫靜置厭氧培養(yǎng)24h;
[0009] 3)吸出步驟2)所得培養(yǎng)液中的菌液，在利用緩沖溶液對菌膜進(jìn)行振動沖洗，驚干 后利用甲醇進(jìn)行固定，固定后吸出甲醇自然風(fēng)干。
[0010] 優(yōu)選地，步驟2)所述培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。
[0011] 優(yōu)選地，步驟2)所述的對菌液進(jìn)行稀釋，是按照菌液:培養(yǎng)基= 1:100的體積比進(jìn) 行稀釋。
[0012] 優(yōu)選地，步驟3)所述振動沖洗，是利用PBS緩沖溶液對菌膜沖洗4次，每次振動 Imin。
[OOU]優(yōu)選地，步驟3)所述利用甲醇進(jìn)行固定，是利用99%的甲醇固定15min。
[0014] 所述的方法的具體步驟如下：
[0015] 1)活化植物乳桿菌NDC 75017，傳代培養(yǎng)至第Ξ代后調(diào)節(jié)菌液濃度至0〇6日日?為2.0;
[0016] 2)利用MRS培養(yǎng)基對步驟1)所得的調(diào)節(jié)濃度后的菌液進(jìn)行稀釋，稀釋是按照菌液： MRS培養(yǎng)基= 1:100的體積比進(jìn)行，混勻后放置在培養(yǎng)容器中在37Γ下恒溫靜置厭氧培養(yǎng) 24h；
[0017] 3)吸出步驟2)所得培養(yǎng)液中的菌液，在利用PBS緩沖溶液對菌膜沖洗4次，每次振 動Imin，驚干后利用99 %的甲醇進(jìn)行固定Imin，固定后吸出甲醇自然風(fēng)干。
[0018] W上所述任一方法可W在制備醫(yī)療產(chǎn)品、調(diào)味品和包裝材料中應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明獲得的有益效果：
[0020] 發(fā)明人在利用植物乳桿菌NDC 75017發(fā)酵生產(chǎn)副產(chǎn)物的過程中，偶然間發(fā)現(xiàn)該菌 株具有很強的成膜能力?；诖?，發(fā)明人將該菌種與其他從乳制品中分離出來的、
【申請人】自 己保藏W及向中國普通微生物保藏中屯、購買的共10種79株乳酸菌的成膜能力進(jìn)行篩選。結(jié) 果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌NDC 75017的成膜能力明顯高于其他乳酸菌的成膜能力，該菌株十分適 合在制備微生物膜中應(yīng)用。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0022] W下實施例中所用試劑、材料、方法和儀器，未經(jīng)特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑、 材料、方法和儀器，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W通過商業(yè)渠道獲得。
[0023] 本發(fā)明所用的植物乳桿菌ND口5017是
【申請人】在專利CN 102550670 A中公開的保 藏菌種。其他發(fā)明人獲得的菌種公眾可向
【申請人】索取，具體所用的乳酸菌及來源如表1所 /J、- 〇
[0024] 表1本發(fā)明所用乳酸菌的種類及來源
[0025]
[0026]
[0027] 實施例1菌株的純化與活化
[0028] 菌株保藏在-80°C冰箱中，取出菌株甘油管，按3%的接種量接種到新鮮的MRS液體 培養(yǎng)基中，37Γ恒溫培養(yǎng)14h，之后用接種環(huán)薩取菌液進(jìn)行Ξ區(qū)劃線，放入培養(yǎng)箱中37Γ恒 溫培養(yǎng)4她，在平板中挑取典型的單菌落接種于新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中恒溫37Γ培養(yǎng)1地， 繼代培養(yǎng)至Ξ代菌液，此為之后的工作菌液。
[0029] 實施例2菌株成膜能力的篩選
[0030] 將Ξ代菌液的菌濃度調(diào)節(jié)至0D6日日nm=2.0,之后按1:100比例稀釋于MRS培養(yǎng)基中， 混勻，取20化L加入96孔中，每組3個平行，置于37°C條件下恒溫靜置厭氧培養(yǎng)24h，96孔板四 周邊緣孔不作為試驗孔，加入等體積的PBS，等體積的MRS培養(yǎng)基為空白對照。24h后，將培養(yǎng) 好的菌液吸出，加入25化L PBS沖洗4次，每次間隔，前后、左右各振動Imin W除去未吸附的 菌體，自然干，之后加入20化1 99%的甲醇固定15min，吸出，自然干，加入20化1 1%結(jié)晶紫 染色5min，之后將結(jié)晶紫吸出，用滅菌水將未吸附的結(jié)晶紫沖洗干凈，自然干，160化33% 冰醋酸溶解吸附在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的結(jié)晶紫，混勻靜置15min，最后用酶標(biāo)儀測定ODs7〇nm 下的吸光值。
[0031] 當(dāng)0D57q?值超過1時，需要進(jìn)行校正，用33%的冰醋酸進(jìn)行稀釋，得到的數(shù)值乘W稀 釋倍數(shù)。所有的生物膜檢測試驗均在不同時間重復(fù)3次。
[0032] 采用微孔板半定量法（具體方法請參見Srdjan Stepanovic,Dragana Vukovic, Ivana Dakic,,et al.A modified microtiter-plate[J].Journal of Microbiological Methods. 2000,40:175-179.)對表1的79株乳酸菌的生物膜形成能力進(jìn)行判定，判定標(biāo)準(zhǔn)如 下： OD <ODc 不拉附 ODc<OD<2x〇Dc 弱私附
[0033] 2'、OL)c<OD<4x〇Dc 中拇阿 4x〇D(<OD 站巧附
[0034] 測定的結(jié)果如表2所示。
[0035] 表2不同乳酸菌菌株的生物膜形成能力
[0036]
[0037
[0038]由表2可知，選取的79株乳酸菌中，無生物膜形成能力的菌株為5株，其中1株鼠李 糖乳桿菌、4株干酪乳桿菌;生物膜形成能力弱的菌株為12株，其中1株植物乳桿菌、11株干 酪乳桿菌;生物膜形成能力中等的菌株為35株，其中5株植物乳桿菌、2株乳明串珠菌、2株彎 曲乳桿菌、1株嗜酸乳桿菌、2株短乳桿菌和23株干酪乳桿菌;而生物膜形成能力強的菌株為 27株，其中1株植物乳桿菌、3株副干酪乳桿菌、2株羅伊氏乳桿菌、1株布氏乳桿菌和20株干 酪乳桿菌。
[0039] 在27株生物膜形成能力強的乳酸菌株中，植物乳桿菌NDC 75017的生物膜形成能 力明顯高于其他26種乳酸菌，比生物膜形成能力第二好的干酪乳桿菌TD012高出67.23%。 相比于同種的植物乳桿菌，NDC 75017的生物膜形成能力更是第二好的植物乳桿菌98-2的 5.96 倍。
[0040] 雖然本發(fā)明已W較佳的實施例公開如上，但其并非用W限定本發(fā)明，任何熟悉此 技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可W做各種改動和修飾，因此本發(fā)明的保護(hù) 范圍應(yīng)該W權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 植物乳桿菌(L. plantarum)NDC75017在制備微生物膜中的應(yīng)用。2. -種利用植物乳桿菌NDC 75017制備微生物膜的方法，其特征在于，步驟如下： 1) 活化植物乳桿菌NDC 75017，傳代培養(yǎng)至第三代后調(diào)節(jié)菌液濃度至OD6QQnmS2.0; 2) 利用培養(yǎng)基對步驟1)所得的調(diào)節(jié)濃度后的菌液進(jìn)行稀釋，混勻后放置在培養(yǎng)容器中 在37 °C下恒溫靜置厭氧培養(yǎng)24h; 3) 吸出步驟2)所得培養(yǎng)液中的菌液，在利用緩沖溶液對菌膜進(jìn)行振動沖洗，晾干后利 用甲醇進(jìn)行固定，固定后吸出甲醇自然風(fēng)干。3. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)所述培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的對菌液進(jìn)行稀釋，是按照菌 液:培養(yǎng)基=1:1 〇〇的體積比進(jìn)行稀釋。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3)所述振動沖洗，是利用PBS緩沖溶液 對菌膜沖洗4次，每次振動lmin。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3)所述利用甲醇進(jìn)行固定，是利用 99%的甲醇固定15min。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，具體步驟如下： 1) 活化植物乳桿菌NDC 75017，傳代培養(yǎng)至第三代后調(diào)節(jié)菌液濃度至OD6QQnmS2.0; 2) 利用MRS培養(yǎng)基對步驟1)所得的調(diào)節(jié)濃度后的菌液進(jìn)行稀釋，稀釋是按照菌液:MRS 培養(yǎng)基= 1:100的體積比進(jìn)行，混勻后放置在培養(yǎng)容器中在37°C下恒溫靜置厭氧培養(yǎng)24h; 3) 吸出步驟2)所得培養(yǎng)液中的菌液，在利用PBS緩沖溶液對菌膜沖洗4次，每次振動 lmin，瞭干后利用99 %的甲醇進(jìn)行固定lmin，固定后吸出甲醇自然風(fēng)干。8. 權(quán)利要求2-7所述任一方法在制備醫(yī)療產(chǎn)品、調(diào)味品和包裝材料中應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/25GK106011008SQ201610402986
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】劉鵬, 遲濤, 方景泉, 孟炯
【申請人】黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院