在葉中具有改變量的一種或多種生物堿的煙草植物及使用此類植物的方法【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)提供了涉及生物堿在煙草中從根到葉的轉(zhuǎn)運(yùn)的多個(gè)序列、使用此類序列的方法、攜帶對(duì)此類序列的修飾的煙草植物、以及從此類植物制造的煙草產(chǎn)品?！緦＠f(shuō)明】在葉中具有改變量的一種或多種生物堿的煙草植物及使用此類植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明公開(kāi)一般性地涉及煙草植物。[0002]背景[0003]人們一直試圖培育低生物堿的煙草品種。然而，這樣的品種大多生成低質(zhì)量的葉，尚無(wú)具有降低的葉生物堿含量的商業(yè)煙草品系。因此，需要鑒定這樣的煙草基因，可調(diào)變其表達(dá)使得煙葉中的生物堿概貌，尤其是葉的煙堿類生物堿概貌能夠得以改變。[0004]概述[0005]描述了涉及生物堿在煙草中從根到葉的轉(zhuǎn)運(yùn)的多個(gè)序列。還描述了使用這類序列的方法。[0006]在一個(gè)方面，提供了煙草雜種、品種、品系、或栽培種。這樣的煙草雜種、品種、品系、或栽培種包括具有在諸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源核酸中的突變的植物。在一些實(shí)施方案中，來(lái)自所述植物的煙葉相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的植物的煙葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量降低。在一些實(shí)施方案中，來(lái)自所述植物的調(diào)制葉相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的植物的調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種煙草特異性亞硝胺(TSNA)的量降低。還提供了由這樣的煙草雜種、品種、品系、或栽培種產(chǎn)生的種子，其中所述種子包括在具有諸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的序列的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源核酸中的突變。[0007]在另一方面，提供了產(chǎn)生煙草植物的方法。這樣的方法一般包括下列步驟:在普通煙草(Nicotianatabacum)細(xì)胞中誘導(dǎo)突變以產(chǎn)生誘變細(xì)胞，從該誘變細(xì)胞獲得一株或多株植物，和從所述植物中鑒定包含在諸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源核酸中的突變的至少一株植物。這種方法可進(jìn)一步包括鑒定至少一株包含顯示至少一種生物堿的量降低的葉(相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的植物的葉）的植物。這種方法還可包括鑒定至少一株這樣的植物，其中所得的調(diào)制葉相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的植物的調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種TSNA量降低。[0008]誘變可使用化學(xué)誘變劑或電離輻射來(lái)誘導(dǎo)。代表性的化學(xué)誘變劑包括但不限于，亞硝酸、疊氮化鈉、吖啶橙、溴化乙錠、和乙基甲磺酸(EMS)。代表性的電離輻射包括但不限于，X射線、γ射線、快中子照射、和UV照射?？梢允褂肨ALEN或鋅指技術(shù)誘導(dǎo)突變。[0009]在另一方面，提供了生產(chǎn)煙草植物的方法。這種方法也包括使第一煙草品系的至少一株植物與第二煙草品系的至少一株植物雜交以及選擇具有突變的后代煙草植物的步驟。通常，第一煙草品系的植物在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源核酸中，諸如具有SEQIDN0:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的序列的內(nèi)源核酸中具有突變。這種方法可進(jìn)一步包括選擇具有展現(xiàn)出至少一種生物堿量降低的葉(相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的植物的葉）的后代煙草植物。這種方法還可包括選擇其中調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種TSNA量降低(相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的植物的調(diào)制葉）的后代煙草植物。[0010]在另一方面，提供了煙草產(chǎn)品。這種煙草產(chǎn)品一般包括來(lái)自這樣的煙草植物的調(diào)制葉，所述煙草植物在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源核酸中，例如在具有SEQIDN0:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的序列的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源核酸中具有突變。在一些實(shí)施方案中，所述煙草產(chǎn)品內(nèi)包含的調(diào)制葉相對(duì)于包含在來(lái)自缺乏突變的植物的煙草產(chǎn)品內(nèi)的調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量降低。在一些實(shí)施方案中，所述煙草產(chǎn)品內(nèi)的調(diào)制葉相對(duì)于包含在來(lái)自缺乏突變的植物的煙草產(chǎn)品內(nèi)的調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種TSNA的量降低。[0011]在另一方面，提供了生產(chǎn)煙草產(chǎn)品的方法。這種方法通常包括提供來(lái)自煙草植物的調(diào)制葉，以及利用所述調(diào)制葉制造煙草產(chǎn)品，所述煙草植物在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源核酸中，例如具有如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的序列中具有突變。在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)制葉相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的植物的調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量降低。在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)制葉相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的植物的調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種TSNA的量降低。[0012]如本文中所述的突變可以是，但不限于，點(diǎn)突變、插入、缺失、或取代。[0013]在又一個(gè)方面，提供了包含植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因煙草植物。一般來(lái)說(shuō)，表達(dá)載體包含至少25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度并且與諸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的序列具有至少91%序列同一性的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)所述核酸分子的煙草植物的葉，核酸分子的表達(dá)導(dǎo)致葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量降低。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)所述核酸分子的煙草植物的調(diào)制葉，核酸分子的表達(dá)導(dǎo)致調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種TSNA的量降低。還提供了由這種轉(zhuǎn)基因煙草植物產(chǎn)生的種子，其中種子包含所述表達(dá)載體。[0014]在一個(gè)方面，提供了轉(zhuǎn)基因煙草植物，其包含長(zhǎng)度至少為25個(gè)核苷酸的異源核酸分子，其中所述核酸分子在嚴(yán)格條件下與諸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列雜交。在一些實(shí)施方案中，所述異源核酸分子的表達(dá)導(dǎo)致葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量降低(相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)該異源核酸分子的煙草植物的葉）。在一些實(shí)施方案中，所述異源核酸分子的表達(dá)導(dǎo)致調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種TSNA的量降低(相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)該異源核酸分子的煙草植物的調(diào)制葉）。還提供了由此類轉(zhuǎn)基因煙草植物產(chǎn)生的種子，其中所述種子包含所述異源核酸分子。[0015]在一個(gè)方面，提供了包含載體的來(lái)自轉(zhuǎn)基因煙草植物的葉。通常，載體包含與諸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列的25個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸具有至少91%序列同一性的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，核酸分子的表達(dá)導(dǎo)致葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)所述核酸分子的煙草植物的葉降低。在一些實(shí)施方案中，核酸分子的表達(dá)導(dǎo)致調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種TSNA的量相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)所述核酸分子的煙草植物的調(diào)制葉降低。[0016]在另一方面，提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法。這樣的方法一般包括在植物中表達(dá)轉(zhuǎn)基因。所述轉(zhuǎn)基因編碼抑制諸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列表達(dá)雙鏈RNA分子。所述雙鏈RNA分子包含與諸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的序列具有至少91%或更大的序列同一性的至少25個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)導(dǎo)致植物的葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因的植物的葉降低。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)導(dǎo)致調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種TSNA的量相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)所述核酸分子的植物的調(diào)制葉的降低。在一些實(shí)施方案中，雙鏈RNA分子具有諸如SEQIDNO:51-56的序列。[0017]在另一方面，提供了改變煙草植物中的葉成分的方法。這種方法通常包括將與啟動(dòng)子可操作連接的異源核酸分子導(dǎo)入煙草細(xì)胞中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞、以及從所述轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因煙草植物的步驟。一般來(lái)說(shuō)，所述異源核酸分子包含至少25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度并且與諸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列具有至少91%序列同一性。這樣的轉(zhuǎn)基因煙草植物展現(xiàn)出改變的葉成分。這樣的方法可進(jìn)一步包括選擇至少一株這樣的轉(zhuǎn)基因煙草植物，該植物具有展現(xiàn)出至少一種生物堿的量降低(相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)異源核酸分子的煙草植物的葉）的葉。此類方法可進(jìn)一步包括選擇至少一株這樣的轉(zhuǎn)基因煙草植物，該植物的調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種TSNA的量降低(相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)異源核酸分子的煙草植物的調(diào)制葉）。[0018]在另一方面，提供了包含載體的來(lái)自轉(zhuǎn)基因煙草植物的調(diào)制煙葉。通常，載體包含與諸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列的25個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸具有至少91%序列同一性（例如，至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性）的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，核酸分子的表達(dá)導(dǎo)致葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量降低（相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)所述核酸分子的煙草植物的葉）。在一些實(shí)施方案中，核酸分子的表達(dá)導(dǎo)致調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種TSNA的量降低（相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)所述核酸分子的煙草植物的調(diào)制葉）。在一些實(shí)施方案中，所述核酸呈有義取向，而在一些實(shí)施方案中，所述核酸呈反義取向。[0019]在又另一個(gè)方面，提供了包含植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因煙草植物。通常，表達(dá)載體包含與諸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的序列、或與這些序列的編碼功能多肽的任何片段具有至少95%序列同一性的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)所述核酸分子或其功能片段的煙草植物的葉，核酸分子或其功能片段的表達(dá)導(dǎo)致葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量增加。還提供了由這種轉(zhuǎn)基因煙草植物產(chǎn)生的種子，其中所述種子包含所述表達(dá)載體。[0020]在另一個(gè)方面，提供了包含異源核酸分子的轉(zhuǎn)基因煙草植物。通常，所述核酸分子在嚴(yán)格條件下與諸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列、或其編碼功能多肽的片段雜交。在一些實(shí)施方案中，異源核酸分子或其功能片段的表達(dá)導(dǎo)致葉相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)異源核酸分子或其功能片段的煙草植物的葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量增加。還提供了由這種轉(zhuǎn)基因煙草植物產(chǎn)生的種子，其中所述種子包含異源核酸分子。[0021]在一個(gè)方面，提供了包含載體的來(lái)自轉(zhuǎn)基因煙草植物的葉。典型地，此類載體包含與諸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列、或其編碼功能多肽的片段具有至少95%序列同一性的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，核酸分子或其功能片段的表達(dá)導(dǎo)致葉相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)所述核酸分子或其功能片段的煙草植物的葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量的增加。[0022]在另一方面，提供了改變煙草植物中的葉成分的方法。此類方法一般包括將與啟動(dòng)子可操作連接的異源核酸分子導(dǎo)入煙草細(xì)胞中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞、以及從所述轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因煙草植物的步驟，其中所述轉(zhuǎn)基因植物具有改變的葉成分。所述異源核酸分子一般與諸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列、或其編碼功能多肽的片段具有至少95%的序列同一性。此類方法可進(jìn)一步包括選擇至少一株這樣的轉(zhuǎn)基因煙草植物:該植物具有相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)異源核酸分子或其功能片段的煙草植物的葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量增加的葉。在一些實(shí)施方案中，使用粒子轟擊、土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA攝取、或電穿孔，將異源核酸分子導(dǎo)入煙草細(xì)胞中。[0023]在一個(gè)方面，提供了包含載體的來(lái)自轉(zhuǎn)基因煙草植物的調(diào)制煙葉。一般來(lái)說(shuō)，所述載體包含與諸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列、或其編碼功能多肽的片段具有至少95%序列同一性的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，核酸分子或其功能片段導(dǎo)致煙葉相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)所述核酸分子或其功能片段的煙草植物的葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量增加。[0024]代表性的生物堿包括但不限于，煙堿、降煙堿、新煙堿、麥斯明(myosmine)、和新煙草堿。一般來(lái)說(shuō)，采用高效液相色譜(HPLC)-質(zhì)譜法(MS)或高效薄層色譜法(HPTLC)確定一種或多種生物堿的量。[0025]適合于在本文中描述的方法中使用的煙草植物可以是白肋煙型(Burleytype)、深色型（darktype)、烤煙型（flue-curedtype)、馬里蘭型（Marylandtype)、或東方型(Orientaltype)。適合于在本文中描述的方法中使用的煙草植物一般來(lái)自普通煙草，并且可來(lái)自任何數(shù)目的普通煙草品種。品種可以是BU64、CC101、CC200、CC13、CC27、CC33、CC35、CC37、CC65、CC67、CC301、CC400、CC500、CC600、CC700、CC800、CC900、CC1063、Coker176、Coker319、Coker371Gold、Coker48、CU263、DF911、Galpao煙草、GL26H、GL338、GL350、GL395、GL600、GL737、GL939、GL973、GF157、GF318、RJR901、HB04P、K149、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925、PVH1118、PVH1452、PVH2110、PVH2254、PVH2275、VA116、VA119、KDH959、KT200、KT204LC、KY10、KY14、KY160、KY17、KY171、KY907、KY907LC、ΚΤΥ14χL8LC、LittleCrittenden、McNair373、McNair944、msKY14xL8、NarrowLeafMadole、NC100、NC102、NC2000、NC291、NC297、NC299、NC3、NC4、NC5、NC6、NC7、NC606、NC71、NC72、NC810、NCBH129、NC2002、NealSmithMadole、OXFORD207、'Perique'煙草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R610、R630、R7-11、R7-12、RG17、RG81、RGH51、RGH4、RGH51、RS1410、Speight168、Speight172、Speight179、Speight210、Speight220、Speight225、Speight227、Speight234、SpeightG_28、SpeightG-70、SpeightH-6、SpeightH20、SpeightNF3、TI1406、TI1269、TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LC、TND94、TND950、TR(TomRosson)Madole、VA309、或VA359〇[0026]在另一方面，提供了篩選植物的方法。此類方法一般包括提供來(lái)自如本文所述的突變植物的植物材料，和確定植物組織中一種或多種生物堿的量。在一些實(shí)施方案中，植物組織為葉。在一些實(shí)施方案中，植物組織為根。此類方法可進(jìn)一步包括確定植物組織中一種或多種TSNA的量。[0027]除非另外定義，本文中所用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與主題方法和組合物所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解相同的含義。下文中描述了合適的方法和材料，但類似于或等同于本文中所描述者的方法和材料也可以用于實(shí)施或測(cè)試主題方法和組合物。另外，材料、方法和實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的，并且不意圖構(gòu)成限定。本文中所提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他參考文獻(xiàn)都通過(guò)提述完整并入。【附圖說(shuō)明】[0028]圖1為本文中所述的新Nup序列與先前已知的普通煙草Nupl和Nup2的比對(duì)。Nupl預(yù)測(cè)的跨膜螺旋由方框表示。[0029]圖2為本文中描述的四種新的MDR序列與代表性MDR多肽(登錄號(hào)XP_004233862)的比對(duì)。加框的區(qū)域表示保守性ATP酶結(jié)構(gòu)域。[0030]圖3為新的MATE序列與普通煙草MATE1的比對(duì)。方框指示預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域;預(yù)測(cè)的N端定位顯示為陰影，其中預(yù)測(cè)的保守性切割位點(diǎn)以箭頭示出。[0031]圖4A為新的MDR序列之一的C11099與來(lái)自番茄的推定的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B家族成員8類似物的比對(duì)，圖4B為鑒定的其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列之一的C43677與來(lái)自番茄的雙向糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SWEET12類似物的比對(duì)。[0032]圖5為顯示花煙草和普通煙草的葉和根中煙堿的量的曲線圖。[0033]圖6為用于在如本文所述的轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)RNAi分子的構(gòu)建體的示意圖。[0034]圖7為用于TALEN誘變的構(gòu)建體的示意圖。[0035]圖8A為在采用浮盤方案進(jìn)行煙堿補(bǔ)料之后葉和根煙堿含量的比率，圖8B為個(gè)體植物的根和葉煙堿含量。[0036]圖9A為在采用無(wú)底盆補(bǔ)料方案進(jìn)行煙堿補(bǔ)料之后個(gè)體植物的葉煙堿含量，圖9B為相同植物在補(bǔ)料前后的葉煙堿含量。[0037]發(fā)明詳述[0038]先前人們修飾產(chǎn)生低生物堿煙草品種的途徑的嘗試有時(shí)導(dǎo)致葉的質(zhì)量較低。目前尚不存在這樣的商業(yè)煙草品系，其具有降低的葉生物堿含量，而與含有標(biāo)準(zhǔn)生物堿含量的調(diào)制葉(例如，來(lái)自野生型煙草植物的葉)相比，又能提供相同質(zhì)量的調(diào)制葉。[0039]本公開(kāi)的基礎(chǔ)是從普通煙草發(fā)現(xiàn)了編碼生物堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和調(diào)節(jié)多肽的新核酸。在本文中描述和表征了這些核酸SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90以及由它們編碼的多肽SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91。在此發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，可在普通煙草中調(diào)變這些核酸序列的表達(dá)水平和/或這些多肽的功能，并評(píng)估由此對(duì)植物中生物堿轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。調(diào)變多肽功能和/或基因表達(dá)可改進(jìn)煙葉和所得煙草產(chǎn)品中的生物堿組成的控制。[0040]核酸和多肽[0041]本文中提供了新的核酸(參見(jiàn)，例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)。如本文中使用的，核酸可包括DNA和RNA，并且包括含有一種或多種核苷酸類似物或骨架修飾的核酸。核酸可以是單鏈或雙鏈的，一般取決于其預(yù)期用途。本文中提供的新的核酸編碼新的多肽（參見(jiàn)，例如，SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91)。[0042]還提供了分別與SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90不同的核酸以及與SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91和不同的多肽。與SEQIDN0:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、S90#&SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91在序列上不同的核酸和多肽可分別與SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、S90#&SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91具有至少50%序列同一性（例如，至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性）。[0043]在計(jì)算序列同一性百分比時(shí)，將兩個(gè)序列比對(duì)，并確定兩個(gè)序列之間的核苷酸或氨基酸殘基的相同匹配數(shù)。相同匹配數(shù)除以比對(duì)區(qū)域的長(zhǎng)度（即，比對(duì)的核苷酸或氨基酸的數(shù)目），然后乘以1〇〇,得到序列同一性百分比的值。應(yīng)當(dāng)理解的是，比對(duì)區(qū)域的長(zhǎng)度可以是一個(gè)或兩個(gè)序列的一部分，至多為最短序列的全長(zhǎng)大小。同樣應(yīng)當(dāng)理解的是，單個(gè)序列可與一個(gè)以上的其他序列比對(duì)，因此在每個(gè)比對(duì)的區(qū)域上可具有不同的序列同一性百分比的值。[0044]可以使用計(jì)算機(jī)程序ClustalW和缺省參數(shù)進(jìn)行兩個(gè)或更多個(gè)序列的比對(duì)來(lái)確定序列同一性百分比，ClustalW可以讓核酸或多肽序列在序列全長(zhǎng)上進(jìn)行比對(duì)(全局比對(duì)）。Chenna等人，2003，NucleicAcidsRes.,31(13):3497_500<Χ1ι?8?&1?計(jì)算出查詢序列與一個(gè)或多個(gè)主題序列之間的最佳匹配，將它們進(jìn)行比對(duì)，如此可確定同一性、相似性和差異。在查詢序列和/或主題序列中可插入一個(gè)多個(gè)殘基空位，使序列比對(duì)最大化。對(duì)于核酸序列的快速兩兩比對(duì)，可使用缺省參數(shù)（即，字大小:2;窗口大小:4;評(píng)分方法:百分比;頂對(duì)角線數(shù):4;和空位罰分:5);對(duì)于多個(gè)核酸序列的比對(duì)，可使用下列參數(shù):空位開(kāi)放罰分:10.0;空位延伸罰分:5.0;和加權(quán)轉(zhuǎn)變:是。對(duì)于多肽序列的快速兩兩比對(duì)，可使用下列參數(shù):字大?。?;窗大小:5;評(píng)分方法:百分比；頂對(duì)角線數(shù):5;和空位罰分:3。對(duì)于多肽序列的多重比對(duì)，可使用下列參數(shù):權(quán)重矩陣:blosum;空位開(kāi)放罰分：10.0;空位延伸罰分:0.05;親水空位:開(kāi)啟；親水殘基:617、？1'〇、561'、48]1、48口、6111、6111、4找、和1^8;以及殘基特異性空位罰分：開(kāi)啟。例如，可以萬(wàn)維網(wǎng)上的的貝勒醫(yī)學(xué)院檢索網(wǎng)站（BaylorCollegeofMedicineSearchLauncherwebsite)和歐洲生物信息學(xué)研究所網(wǎng)站（EuropeanBioinformaticsInstitutewebsite)運(yùn)行ClustalWo[0045]可在核酸分子(例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)中導(dǎo)入變化，由此導(dǎo)致所編碼的多肽的氨基酸序列（例如，SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91)的變化。例如，可采用誘變(例如，定點(diǎn)誘變、PCR介導(dǎo)的誘變），或通過(guò)化學(xué)合成具有此類變化的核酸分子而在核酸編碼序列中導(dǎo)入變化。這種核酸變化可導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處的保守和/或非保守氨基酸取代。"保守氨基酸取代"是其中用具有相似側(cè)鏈的不同氨基酸殘基替換一個(gè)氨基酸殘基的取代(參見(jiàn)，例如Dayhoff等人（1978,inAtlasofProteinSequenceandStructure，5(Suppl·3):345-352)，其提供了氨基酸取代的頻率表），而非保守取代是其中用沒(méi)有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換氨基酸殘基的取代。[0046]如本文中使用的，"分離的"核酸分子是這樣的核酸分子(例如，cDNA或通過(guò)PCR或限制性核酸內(nèi)切酶消化所產(chǎn)生的基因組DNA片段）：其游離于在該分離核酸分子所來(lái)源的生物基因組中的天然位于該核酸分子一端或兩端的側(cè)翼的序列。這種分離的核酸分子通常被導(dǎo)入載體(例如，克隆載體、或表達(dá)載體）中，以便于操作或產(chǎn)生融合核酸分子，這將在下文更詳細(xì)地論述。另外，分離的核酸分子可包括工程化的核酸分子，如重組和合成的核酸分子。[0047]如本文中使用的，"純化的"多肽是已從天然地伴隨它的細(xì)胞組分中分離或純化出來(lái)的多肽。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)多肽按干重計(jì)至少70%(例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%)游離于與其天然伴隨的多肽或天然存在分子時(shí)，其被視為是"純化的"。由于化學(xué)合成的多肽自然地與天然伴隨它的組分相分離，所以合成多肽是"純化的"。[0048]可使用本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)分離核酸。例如，可使用任何方法分離核酸，所述方法包括但不限于，重組核酸技術(shù)、和/或聚合酶鏈反壓(PCR)。通用的PCR技術(shù)描述于例如PCRPrimer:ALaboratoryManual,Dieffenbach&Dveksler,Eds.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995。重組核酸技術(shù)包括例如，限制酶消化和連接，其可用于分離核酸。還可化學(xué)合成分離的核酸，其形式為單個(gè)核酸分子或?yàn)橐幌盗泄押塑账?。[0049]可通過(guò)已知的方法如DEAE離子交換、凝膠過(guò)濾、和羥基磷灰石色譜法，從天然來(lái)源(例如，生物樣品）中純化多肽。還可以通過(guò)例如在表達(dá)載體中表達(dá)核酸來(lái)純化多肽。另外，可通過(guò)化學(xué)合成獲得純化的多肽。可以采用任何適當(dāng)?shù)姆椒?，例如柱色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析來(lái)測(cè)量多肽的純度范圍。[0050]還提供了含有核酸(例如，編碼多肽的核酸）的載體?？缮藤?gòu)或可通過(guò)本領(lǐng)域中常規(guī)的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生載體，包括表達(dá)載體。含有核酸的載體可具有與這種核酸可操作連接的表達(dá)元件，并可進(jìn)一步包括編碼選擇標(biāo)志物(例如，抗生素抗性基因）的序列。含有核酸的載體可編碼嵌合或融合多肽（即，與異源多肽可操作連接的多肽，其可以在多肽的N端或C端）。代表性異源多肽為可在編碼的多肽的純化中使用的那些多肽(例如，6xHis標(biāo)簽，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST))。[0051]表達(dá)元件包括指導(dǎo)和調(diào)節(jié)核酸編碼序列的表達(dá)的核酸序列。表達(dá)元件的一個(gè)實(shí)例是啟動(dòng)子序列。表達(dá)元件還可包括調(diào)節(jié)核酸表達(dá)的內(nèi)含子、增強(qiáng)子序列、反應(yīng)元件、或誘導(dǎo)型元件。表達(dá)元件可以是細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物、或病毒來(lái)源的，并且載體可以含有不同來(lái)源的元件的組合。如本文中使用的，可操作連接意指啟動(dòng)子或其他表達(dá)元件相對(duì)于核酸以指導(dǎo)或調(diào)節(jié)核酸表達(dá)的這樣一種方式位于載體中（例如，合框）。眾多將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的體內(nèi)和體外方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括但不限于，電穿孔、磷酸鈣沉淀、聚乙二醇(PEG)轉(zhuǎn)化、熱激、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、顯微注射、和病毒介導(dǎo)的核酸轉(zhuǎn)移。[0052]如本文中描述的載體可導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。如本文中使用的，"宿主細(xì)胞"是指核酸導(dǎo)入其中的特定細(xì)胞，并且也包括攜帶載體的這種細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞。例如，核酸可以在諸如大腸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞中、或在昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CH0)或C0S細(xì)胞）中表達(dá)。其他適合的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。[0053]可以利用適當(dāng)?shù)墓押塑账釋?duì)（例如，引物）使用許多擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)核酸（參見(jiàn)，例如，PCRPrimer:ALaboratoryManual，1995，Dieffenbach&Dveksler，Eds·，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY;和美國(guó)專利Nos.4,683,195;4,683，202;4，800，159;和4，965，188)。針對(duì)原始PCR的許多改良已經(jīng)產(chǎn)生并可用來(lái)檢測(cè)核酸。[0054]還可利用雜交來(lái)檢測(cè)核酸。核酸之間的雜交由Sambrook等人詳細(xì)論述（1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY;部分7.37-7.57、9.47-9.57、11.7-11.8、和11.45-11.57)〇Sambrook等人公開(kāi)了針對(duì)小于約100個(gè)核苷酸的寡核苷酸探針的適當(dāng)?shù)腟outhern印跡條件(部分11.45-11.46)。利用部分11.46中提供的公式，可以計(jì)算出在長(zhǎng)度小于100個(gè)核苷酸的序列與第二序列之間的Tm。Sambrook等人另外公開(kāi)了針對(duì)大于約100個(gè)核苷酸的寡核苷酸探針的適當(dāng)?shù)腟outhern印跡條件（參見(jiàn)部分9.47-9.54)。利用Sambrook等人在部分9.50-9.51中提供的公式，可以計(jì)算出在長(zhǎng)度大于100個(gè)核苷酸的序列與第二序列之間的Tm。[0055]含有核酸的膜預(yù)雜交和雜交的條件、以及洗滌含有核酸的膜以去除過(guò)量的和非特異性結(jié)合的探針的條件可在雜交嚴(yán)格性中起著重要作用。適當(dāng)時(shí)，可以在中等或高嚴(yán)格條件下進(jìn)行這樣的雜交和洗滌。例如，通過(guò)降低洗滌溶液中的鹽濃度和/或通過(guò)增加進(jìn)行洗滌時(shí)的溫度，可以使洗滌條件更嚴(yán)格。僅僅作為舉例，高嚴(yán)格條件一般包括在0.2XSSC中在65°(：洗滌膜。[0056]另外，雜交量的解釋可受到例如標(biāo)記的寡核苷酸探針比活性、與探針雜交的模板核酸上的探針結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目、以及放射自顯影片或其他檢測(cè)介質(zhì)的暴露量的影響。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易理解的是，雖然可以采用許多雜交和洗滌條件來(lái)檢驗(yàn)探針核酸分子與固定的靶核酸的雜交，更重要的是檢驗(yàn)在相同雜交、洗滌、和暴露條件下探針與靶核酸的雜交。優(yōu)選的是，靶核酸在同一張膜上。[0057]如果核酸分子與一種核酸的雜交比與另一種核酸的雜交多至少5倍(例如，至少6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、或100倍），則所述核酸分子被認(rèn)為與這種核酸而不是與所述另一種核酸雜交?？芍苯釉谀ど匣蚴褂美鏟hosphorlmager或Densitometer(MolecularDynamics，Sunnyvale，CA)從放射自顯影片對(duì)雜交量進(jìn)行定量。[0058]可使用抗體檢測(cè)多肽。使用抗體檢測(cè)多肽的技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、WeStern印跡、免疫沉淀和免疫熒光。抗體可以是多克隆或單克隆的?？梢岳帽绢I(lǐng)域中熟知的方法產(chǎn)生對(duì)多肽具有特異性結(jié)合親和力的抗體?？衫帽绢I(lǐng)域已知的方法將抗體附接到諸如微量滴定板的固體支持物上。在多肽的存在下，形成抗體-多肽復(fù)合物。[0059]通常利用可檢測(cè)標(biāo)記來(lái)完成檢測(cè)（例如，擴(kuò)增產(chǎn)物、雜交復(fù)合物、或多肽的檢測(cè)）。術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記"旨在涵蓋直接標(biāo)記以及間接標(biāo)記的使用?？蓹z測(cè)標(biāo)記包括酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、和放射性物質(zhì)。[0060]本文中描述的某些核酸(例如，SEQIDN0:1、3、5、7、或82)預(yù)期編碼屬于煙堿攝取通透酶(nicotineuptakepermease,Nup)序列家族的多肽（例如，SEQID腸：2、4、6、8、或83)Jup多肽是更大的嘌呤通透酶家族的成員。參見(jiàn)，例如，Hildreth等人，2011，PNASUSA，108:18279-84。除了本文中公開(kāi)的新的Nup核酸和多肽序列之外，來(lái)自普通煙草的代表性Nupl和Nup2序列顯示在登錄號(hào)⑶174268.1和⑶174267.1中。[0061]本文中描述的某些核酸(例如，SEQID^):9、11、13、15、70、72、74、76、78、或80)預(yù)期編碼屬于多藥耐藥(MDR)序列家族的多肽(例如，SEQIDN0:10、12、14、16、71、73、75、77、79、或81)。多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)成一大類膜蛋白，存在于大多數(shù)生物的細(xì)胞中。這些蛋白結(jié)合多種具有潛在細(xì)胞毒作用的化合物，并通過(guò)一個(gè)ATP或質(zhì)子依賴性的過(guò)程將它們從細(xì)胞中去除（Zhelenova等人，2000，TrendsBiochem.Sci·，25:39-43)。從前將多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白劃分為四個(gè)超家族:ATP結(jié)合盒(ABC)超家族、主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族、小多重耐藥家族、耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化家族(下文更詳細(xì)地論述的MATE家族最近被鑒定為多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的第五超家族）。屬于ATP結(jié)合盒超家族和主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的外排栗蛋白是多藥耐藥性(MDR)的最突出的促成因素。[0062]本文中描述的某些核酸（例如，SEQIDN0:17、19、21、23、25、27、29、31、86、88、或90)預(yù)期編碼屬于多藥和毒性化合物外排型(MATE)序列家族的多肽(例如，SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、87、89、或91)。MATE多肽家族的特征是:存在12個(gè)推定的跨膜區(qū)段，以及不存在對(duì)其他多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族特異的"特征序列"（Brown等人，1999，Mol.Microbiol.，31:394-5)JATE蛋白被認(rèn)為用作質(zhì)子依賴性外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在細(xì)菌和植物中大量存在。[0063]本文中描述的某些核酸（例如，SEQIDN0:33和35)預(yù)期編碼屬于多向耐藥性(PDR)序列家族的多肽（例如，SEQID^):34和36)。參見(jiàn)，例如，]?〇〇118,2008，？131^3,229:53-711DR家族僅發(fā)現(xiàn)于真菌和植物中，最初在釀酒酵母中由于編碼非特異性藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因的表達(dá)增加而得以被表征。已鑒定了若干TOR多肽，它們賦予對(duì)一大組在功能和結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的毒性化合物(例如，抗真菌和抗癌藥物）的抗性，并轉(zhuǎn)運(yùn)弱有機(jī)酸。另外，已在若干植物物種(包括，例如，擬南芥和水稻）中鑒定了多種TOR基因。[0064]具有降低的葉中生物堿量的植物及制造方法[0065]提供了在一種或多種如本文中描述的內(nèi)源核酸(例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)中具有突變的煙草雜種、品種、品系、或栽培種。來(lái)自在一種或多種內(nèi)源核酸（例如，SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)中具有突變的植物的葉可展現(xiàn)出至少一種生物堿量的降低(例如，與來(lái)自沒(méi)有所述突變的植物的葉相比）。另外，來(lái)自在一種或多種內(nèi)源核酸（例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)中具有突變的植物的葉可展現(xiàn)出至少一種煙草特異性亞硝胺(TSNA)量的降低(例如，與來(lái)自沒(méi)有所述突變的植物的葉相比）。[0066]本文中提及的生物堿一般包括吡啶生物堿類，包括煙堿、降煙堿、新煙堿、麥斯明、和新煙草堿。參見(jiàn)，例如，Sheng等人，2005，Chromatographia，62:63-8JSNA在調(diào)制過(guò)程中產(chǎn)生。亞硝酸鹽可能由于細(xì)菌還原硝酸鹽而累積，而亞硝酸鹽(亞硝基化物質(zhì)的來(lái)源）與生物堿之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而形成TSNA。代表性TSNA包括，例如，Ν'-亞硝基降煙堿(NNN)、4-(甲基亞硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N'_亞硝基新煙草堿(NAT)、N'_亞硝基新煙堿(NAB)、和4-(甲基亞硝基氨基)-卜(3-吡啶基)-1-丁醛(NNAL)。[0067]檢測(cè)生物堿或TSNA的方法以及確定一種或多種生物堿或TSNA量的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可采用高效液相色譜（HPLC)-質(zhì)譜法（MS)(HPLC-MS)或高效薄層色譜法(HPTLC)來(lái)檢測(cè)一種或多種生物堿的存在和/或確定一種或多種生物堿的量。另外，可采用多種色譜方法(例如，氣相色譜/熱能分析(GC/TEA)、液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)、和離子色譜法（1C))來(lái)檢測(cè)一種或多種TSNA的存在和/或確定一種或多種TSNA的量。[0068]制造具有突變的煙草植物的方法是本領(lǐng)域已知的。突變可以是隨機(jī)突變或靶向突變。對(duì)于隨機(jī)誘變，可使用例如化學(xué)誘變劑、電離輻射、或快中子轟擊使細(xì)胞(例如，普通煙草細(xì)胞)誘變(參見(jiàn)，例如，Li等人，2001，PlantJ.,27:235-42)。代表性化學(xué)誘變劑包括但不限于，亞硝酸、疊氮化鈉、吖啶橙、溴化乙錠、和甲磺酸乙酯(EMS)，而代表性電離輻射包括但不限于，X射線、γ射線、快中子照射、和UV照射。針對(duì)每種植物組織類型以實(shí)驗(yàn)方式確定誘變性化學(xué)品或輻射的劑量，以獲得在閾值水平（以致死或生殖不育為特征）以下的突變頻率?；陬A(yù)期的突變頻率，估計(jì)誘變處理所產(chǎn)生的％代種子的數(shù)目或％植物群的大小。對(duì)于靶向誘變，代表性技術(shù)包括TALEN(參見(jiàn)，例如，Li等人，2011，NucleicAcidsRes.,39(14):6315-25)或鋅指（參見(jiàn)，例如，Wright等人，2005，ThePlantJ.,44:693-705)。無(wú)論是隨機(jī)還是靶向，突變可以是點(diǎn)突變、插入、缺失、取代、或其組合。[0069]多肽中的保守結(jié)構(gòu)域?qū)τ诙嚯牡墓δ芤约凹?xì)胞或亞細(xì)胞定位可能是重要的。圖1顯示了包括本文描述的新Nup序列在內(nèi)的若干Nup序列的比對(duì)，其中方框指示預(yù)測(cè)的跨膜螺旋。圖2顯示了包括本文中描述的新MDR序列在內(nèi)的若干MDR序列與方框所指示的保守性ATP酶結(jié)構(gòu)域的比對(duì)。圖3顯示了包括本文中描述的新的MATE序列在內(nèi)的若干MATE序列的比對(duì)。圖3中的方框指示預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域，其中預(yù)測(cè)的N端信號(hào)肽顯示為陰影，預(yù)測(cè)的保守性切害酸點(diǎn)以箭頭示出。另外，圖4A顯示了在新的MD序列之一的C11099與來(lái)自番茄的推定的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B家族成員8類似物序列之間的比對(duì)。如下文表5中所示的，這些序列在核苷酸水平上具有84%序列同一性，且在氨基酸水平上具有85%序列同一性。此外，圖4B顯示了在下述二者之間的比對(duì):標(biāo)示為"其他"轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列的一種新序列C43677,與來(lái)自番茄的雙向糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SWEET12類似物序列。如下文表8中所示，這些序列在核苷酸水平上的具有71%序列同一性，在氨基酸水平上具有67%序列同一性。[0070]如本文中論述的，可以使一個(gè)或多個(gè)核苷酸突變，使得編碼的多肽的表達(dá)和/或功能相對(duì)于相應(yīng)的野生型多肽的表達(dá)和/或功能發(fā)生改變。應(yīng)當(dāng)理解的是，例如，在一個(gè)或多個(gè)高度保守區(qū)域(參見(jiàn)，例如，在圖1、2、3、和4中所示的比對(duì)）中的突變很可能會(huì)改變多肽的功能，而在這些保守區(qū)域之外的突變很可能對(duì)多肽功能影響很小或沒(méi)有影響。另外，單個(gè)核苷酸突變可產(chǎn)生終止密碼子，導(dǎo)致截短的多肽，并且取決于截短的程度，可導(dǎo)致功能喪失。[0071]優(yōu)選地，在本文中公開(kāi)的新核酸之一中的突變導(dǎo)致包含所述突變的煙草植物中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性降低或甚至完全消除。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼序列中的突變的適合類型包括但不限于，核苷酸的插入、核苷酸的缺失、或野生型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼序列中的轉(zhuǎn)換或顛換。編碼序列中的突變可導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、和/或在編碼的多肽中的非保守氨基酸取代。在一些情況下，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼序列包含一個(gè)以上的突變或一種以上類型的突變。[0072]例如，編碼序列中的氨基酸插入或缺失可能破壞所編碼的多肽的構(gòu)象。氨基酸插入或缺失還可能破壞對(duì)于識(shí)別結(jié)合配體（即，被轉(zhuǎn)運(yùn)的分子)或?qū)τ诙嚯牡幕钚裕?，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性)而言重要的部位。本領(lǐng)域已知，與較小量的氨基酸插入或缺失相比，較大量的連續(xù)氨基酸插入或缺失更可能致使基因產(chǎn)物無(wú)功能。另外，一個(gè)或多個(gè)突變(例如，點(diǎn)突變)可改變轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽的定位、導(dǎo)入終止密碼子以產(chǎn)生截短的多肽、或破壞多肽內(nèi)的活性部位或結(jié)構(gòu)域(例如，催化部位或結(jié)構(gòu)域、結(jié)合部位或結(jié)構(gòu)域）。[0073]僅僅作為舉例，MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列（例如，圖3;例如，C9954(SEQIDN0:26)、C46276(SEQIDN0:22)、C48594(SEQIDN0:24)、和DC38072(SEQIDN0:20))可被突變，將殘基24處的帶電氨基酸改變?yōu)椴粠щ姲被帷＿@樣的突變可破壞轉(zhuǎn)運(yùn)多肽通常向細(xì)胞表面上的靶向，從而可改變一種或多種生物堿在植物內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)(例如，進(jìn)入木質(zhì)部和/或從根到葉的轉(zhuǎn)運(yùn)）。另外，MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（例如，Cl1099(SEQIDNO:16))可被突變使得核苷酸124處的T改變?yōu)锳，從而在第八個(gè)氨基酸殘基之后產(chǎn)生終止密碼子。這樣的突變將會(huì)顯著降低或基本上消除植物中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽;可類似地對(duì)本文中公開(kāi)的任何轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列施加導(dǎo)入終止密碼子的突變。此外，MDR(例如，圖2和4A)和PDR(例如，SEQIDN0:33-36)多肽家族的轉(zhuǎn)運(yùn)需要ATP水解;ATP酶結(jié)構(gòu)域是高度保守的，并且水解需要的氨基酸殘基是已知的（例如，位于圖2的殘基676-682處的WalkerA氨基酸基序(GXXGXGK))。因此，MDR多肽（例如，DC3222(SEQIDN0:10)、C11099(SEQIDN0:16)、DC62783(SEQIDN0:12)JPDC26451(SEQIDN0:14))或PDR多肽（例如，C53160(SEQIDN0:34)、C22474(SEQIDN0:36))可在WalkerA基序內(nèi)突變(例如，在保守賴氨酸(K)氨基酸處），結(jié)果將產(chǎn)生不能水解ATP并且不能進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)或至少缺乏轉(zhuǎn)運(yùn)能力的多肽。[0074]對(duì)于非保守氨基酸取代，一種類型的氨基酸可替換為不同類型的氨基酸。非保守取代可實(shí)質(zhì)性地改變基因產(chǎn)物的電荷或疏水性。非保守氨基酸取代還可實(shí)質(zhì)性地改變殘基側(cè)鏈的體積，例如，將丙氨酸殘基取代為異亮氨酸殘基。非保守取代的實(shí)例包括堿性氨基酸取代為非極性氨基酸，或極性氨基酸取代為酸性氨基酸。[0075]轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽等跨膜多肽含有決定所述多肽定位在細(xì)胞內(nèi)何處的特定序列。例如，先前描述的MATE1蛋白含有將其靶向到液泡上的序列，而本文描述的新MATE序列具有不同的N端結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)圖3中的比對(duì)）。在多肽插入膜之后，靶肽序列常常被切割(例如，通過(guò)識(shí)別特異性核苷酸基序的特異性蛋白酶）。通過(guò)突變靶序列或切割基序，可以改變多肽的靶向。[0076]誘變之后，從誘變的細(xì)胞再生Mo植物，并且可以篩選這些植物或這個(gè)群體的后續(xù)世代(例如，MhMhMs，等)在感興趣序列（例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)中的突變?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中的常規(guī)方法(例如，雜交、擴(kuò)增、其組合)或通過(guò)評(píng)估表型（例如，檢測(cè)和/或確定根和/或葉中的一種或多種生物堿和/或一種或多種TSNA的量)篩選攜帶感興趣序列中的突變的植物。通常，與缺乏突變的相應(yīng)植物(例如，具有相同品種背景者)相比，在本文中公開(kāi)的一個(gè)或多個(gè)核酸序列（例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)中存在突變導(dǎo)致突變植物的葉中一種或多種生物堿和/或突變植物的調(diào)制葉中一種或多種TSNA的降低。[0077]如本文中使用的，"降低的"或"降低"是指相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的煙草植物的類似處理的煙葉（例如，青的或調(diào)制的），在青葉或調(diào)制葉中一種或多種生物堿、和/或青葉或調(diào)制葉中一種或多種TSNA的量減少(例如，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性減少）至少約5%到約95%(例如，約5%到約10%、約5%到約20%、約5%到約50%、約5%到約75%、約10%到約25%、約10%到約50%、約10%到約90%、約20%到約40%、約20%到約60%、約20%到約80%、約25%到約75%、約50%到約75%、約50%到約85%、約50%到約95%、以及約75%到約95%)。如本文中使用的，統(tǒng)計(jì)顯著性是指采用統(tǒng)計(jì)顯著性的適當(dāng)量度時(shí)（例如，單尾雙樣本t檢驗(yàn)）的p值小于0.05，例如，p值小于0.025或p值小于0.01。[0078]111煙草植物對(duì)于突變等位基因來(lái)說(shuō)可以是雜合且展現(xiàn)出野生型表型。在這樣的情況下，這種植物的第一代自花授粉后代的至少一部分展現(xiàn)出野生型表型?；蛘?，草植物可具有突變體等位基因并展現(xiàn)出突變體表型。這樣的植物可以是雜合的，但由于諸如負(fù)顯性抑制之類的現(xiàn)象，盡管存在野生型等位基因亦展現(xiàn)出突變體表型；或者由于在兩個(gè)等位基因中的獨(dú)立誘導(dǎo)的突變，這樣的植物可以是純合的。[0079]攜帶突變體等位基因的煙草植物可在植物育種計(jì)劃中使用，以建立新的且有用的栽培種、品系、品種和雜種。因此，在一些實(shí)施方案中，使含有至少一個(gè)突變的％、M2、M3或更后的世代的煙草植物與第二普通煙草植物雜交，并鑒定出其中存在突變的雜交后代。應(yīng)當(dāng)理解的是，第二普通煙草植物可以是本文中描述的物種和品種之一。還應(yīng)當(dāng)理解的是，第二普通煙草植物可含有與其雜交的植物相同的突變、不同的突變、或在該基因座處為野生型。另外地或可替代地，第二煙草品系可展現(xiàn)出表型性狀，如抗病性、高產(chǎn)量、高分級(jí)指標(biāo)、可烤性(curabi1ity)、烘烤質(zhì)量、機(jī)械收割、保持能力、葉子質(zhì)量、高度、植物成熟(例如，早期成熟、早期到中期成熟、中期成熟、中期到晚期成熟、或晚期成熟）；莖長(zhǎng)(例如，短、中等的或長(zhǎng)莖）；和/或每株植物的葉子數(shù)量(例如，葉子數(shù)量少(例如5-10片葉子）、中等(例如11-15片葉子）、或多(例如16-21片葉子）。[0080]采用已知的程序進(jìn)行育種?？梢栽跇?biāo)記輔助選擇(MAS)育種計(jì)劃中采用DNA指紋圖譜、SNP或類似技術(shù)，將突變體基因轉(zhuǎn)移到或選育到如本文中所述的其他煙草中。可采用本文中描述的方法篩查雜交后代是否有突變，并且可以選擇在本文描述的核酸序列（例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)中具有突變的植物。例如，可使用本文中列出的技術(shù)之一，采用從本文中描述的序列或其片段開(kāi)發(fā)的標(biāo)記來(lái)篩選F2S回交世代植物。還可以篩選來(lái)自后代植物的葉(青的或調(diào)制的，視情況而定）的一種或多種生物堿和/或一種或多種TSNA的量，并可選擇相比于缺乏突變的相應(yīng)植物具有降低量的那些植物。鑒定為具有突變體等位基因和/或突變體表型的植物可以回交或自花授粉，以建立第二種群供篩選?？梢灾貜?fù)回交或其他育種程序，直到輪回親本的期望表型得以回收時(shí)為止。[0081]成功的回交產(chǎn)生能育的并在需要時(shí)可與親本之一回交的Fi植物。在一些實(shí)施方案中，利用標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，采用基于本文中公開(kāi)的核酸序列的引物的PCR)篩選F2世代中的植物種群是否有突變或變體基因表達(dá)。然后使選出的植物與親本之一雜交，并使第一回交(BQ)世代植物自花授粉以產(chǎn)生B&F2種群，對(duì)該種群再次篩選變體基因表達(dá)。重復(fù)回交、自花授粉、和篩選的過(guò)程，例如至少重復(fù)四次，直到最后篩選產(chǎn)生能育的并與輪回親本合理地相似的植物時(shí)為止。在需要時(shí)使此植物自花授粉，隨后再次篩選后代，以證實(shí)所述植物含有突變并展現(xiàn)出變體基因表達(dá)?？刹捎脴?biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生選擇植物的原原種(breeder'sseed)，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括，例如田間試驗(yàn)、無(wú)效狀態(tài)的證實(shí)、和/或?qū)θ~(例如，調(diào)制葉)進(jìn)行化學(xué)分析用來(lái)確定生物堿水平。[0082]采用本文中描述的突變體煙草植物的植物育種計(jì)劃的結(jié)果是新的且有用的栽培種、品種、品系、和雜種。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"品種"是指植物的群體，這些植物有共同的恒定特征，使它們與同一物種的其他植物區(qū)分開(kāi)來(lái)。品種常常以商品形式銷售，盡管不總是如此。品種具有一種或多種獨(dú)特性狀，但品種的另一特征是個(gè)體之間有非常小的總體變異。通過(guò)若干世代的自花授粉和選擇、或利用組織或細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)從單親本進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖，可以建立"純系"品種。與品種不同，"品系"最常表示一組以非商業(yè)方式，例如在植物研究中應(yīng)用的植物。品系就感興趣的一個(gè)或多個(gè)性狀而言在個(gè)體之間顯示出很小的變異，不過(guò)就其他性狀而言在個(gè)體之間可能存在一定變異。[0083]一個(gè)品種可實(shí)質(zhì)衍生自另一個(gè)品系或品種。正如國(guó)際植物新品種保護(hù)公約（1961年12月2日，在1972年11月10日、1978年10月23日、和1991年3月19日在日內(nèi)瓦修訂)定義，種"實(shí)質(zhì)衍生"自初始品種，條件是:a)它主要是衍生自初始品種、或衍生自主要衍生自初始品種的品種，同時(shí)保留表達(dá)由初始品種的基因型或基因型組合導(dǎo)致的關(guān)鍵特性;b)它與初始品種明顯可區(qū)分;并且c)除衍生行為導(dǎo)致的差異外，在由初始品種的基因型或基因型組合導(dǎo)致的關(guān)鍵特性的表達(dá)上與初始品種相同。例如，實(shí)質(zhì)衍生的品種可以通過(guò)天然或誘導(dǎo)的突變體、體細(xì)胞克隆變體、來(lái)自原始品種的變體個(gè)體植物的選擇、回交、或轉(zhuǎn)化而獲得。[0084]可以通過(guò)阻止第一品種的母本植物（即，種子親本）自花授粉、容許來(lái)自第二品種的父本植物的花粉對(duì)母本植物授精、并允許?:雜交種子在雌性植物上形成，來(lái)產(chǎn)生煙草雜種?？梢酝ㄟ^(guò)在花發(fā)育早期使花去雄來(lái)阻止雌性植物的自花授粉?；蛘撸梢圆捎媚撤N形式的雄性不育來(lái)阻止母本植物上的花粉形成。例如，可以通過(guò)細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)、細(xì)胞核雄性不育、遺傳雄性不育、分子雄性不育（其中轉(zhuǎn)基因抑制了小孢子發(fā)生和/或花粉形成）、或自身不相容性來(lái)產(chǎn)生雄性不育。含有CMS的母本植物特別有用。在母本植物是CMS的實(shí)施方案中，父本植物一般含有育性恢復(fù)基因以確保F:雜種是可育的。在母本是CMS的其他實(shí)施方案中，可使用不含育性恢復(fù)基因的父本。由這種親本產(chǎn)生的Fi雜種是雄性不育的。雄性不育雜種的種子可與雄性可育的種子間種以在所得雄性不育植物上提供結(jié)實(shí)用的花粉。[0085]本文所述的品種、品系和栽培種可用于形成單交煙草?:雜種。在這樣的實(shí)施方案中，可將親本品種的植株培養(yǎng)成基本上均一的鄰接群體，以便于父本植物天然異花授粉至母本植物。通過(guò)常規(guī)手段選擇性地收獲母本植物上形成的F2種子。也可以大批量培養(yǎng)兩個(gè)親本植物品種，并收獲母本上形成的^雜種種子和因自花授粉而在父本上形成的種子的混合物?；蛘撸蛇M(jìn)行三元雜交，其中將單交h雜種用作母本，并與另一不同的父本雜交。又或者，可產(chǎn)生雙雜交種，其中兩個(gè)不同單交的？:后代自身進(jìn)行雜交。當(dāng)形成雙雜交種時(shí)，自身不相容性對(duì)于防止母本的自花授粉可能特別有用。[0086]在本文中描述的方法中使用的煙草植物可以是白肋煙型、深色型、烤煙型、馬里蘭型、或東方型。在本文中描述的方法中使用的煙草植物一般來(lái)自普通煙草，并且可來(lái)自多個(gè)普通煙草品種。品種可以是BU64、CC101、CC200、CC13、CC27、CC33、CC35、CC37、CC65、CC67、CC301、CC400、CC500、CC600、CC700、CC800、CC900、CC1063、Coker176、Coker319、Coker371Gold、Coker48、CU263、DF911、Galpao煙草、GL26H、GL338、GL350、GL395、GL600、GL737、GL939、GL973、GF157、GF318、RJR901、HB04P、K149、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925、PVH1118、PVH1452、PVH2110、PVH2254、PVH2275、VA116、VA119、KDH959、KT200、KT204LC、KY10、KY14、KY160、KY17、KY171、KY907、KY907LC、KTY14xL8LC、LittleCrittenden、McNair373、McNair944、msKY14xL8、NarrowLeafMadole、NC100、NC102、NC2000、NC291、NC297、NC299、NC3、NC4、NC5、NC6、NC7、NC606、NC71、NC72、NC810、NCBH129、NC2002、NealSmithMadole、0XF0RD207、'Perique'煙草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R610、R630、R7-ll、R7-12、RG17、RG81、RGH51、RGH4、RGH51、RS1410、Speight168、Speight172、Speight179、Speight210、Speight220、Speight225、Speight227、Speight234、SpeightG_28、SpeightG_70、SpeightH_6、SpeightH20、SpeightNF3、TI1406、TI1269、TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LC、TND94、TND950、TR(TomRosson)Madole、VA309、或VA359〇[0087]除了突變之外，另一種可降低煙葉中生物堿量的方式是使用抑制性RNA(例如，RNAi)。因此，提供了含有編碼至少一個(gè)RNAi分子的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物，所述RNAi分子在表達(dá)時(shí)使本文中描述的內(nèi)源核酸(例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)中的至少之一沉默。如本文中描述的，來(lái)自這種轉(zhuǎn)基因植物的葉展現(xiàn)出至少一種生物堿量的降低(例如，與來(lái)自缺乏或不表達(dá)RNAi的植物的葉相比）。另外，來(lái)自這種轉(zhuǎn)基因植物的葉展現(xiàn)出至少一種煙草特異性亞硝胺(TSNA)量的降低(例如，與來(lái)自缺乏或不表達(dá)RNAi的植物的葉相比）。[0088]RNAi技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，是轉(zhuǎn)錄后基因沉默的非常有效的形式。RNAi分子一般含有長(zhǎng)度約18個(gè)核苷酸(例如，長(zhǎng)度約19或20個(gè)核苷酸），乃至長(zhǎng)度約700個(gè)核苷酸的核苷酸序列，在有義和反義方向均與靶基因互補(bǔ)。有義和反義鏈可通過(guò)短"環(huán)"序列(例如，長(zhǎng)度約5個(gè)核苷酸到長(zhǎng)度約800個(gè)核苷酸)連接，并表達(dá)為單個(gè)轉(zhuǎn)錄本，或者有義和反義鏈可在不同的載體或構(gòu)建體上遞送到靶細(xì)胞中并在其中的表達(dá)。許多公司提供RNAi設(shè)計(jì)與合成服務(wù)(例如，LifeTechnologies，AppliedBiosystems)，針對(duì)本文中描述的若干新序列的代表性RNAi分子提供在SEQIDN0:51-56中。[0089]可利用植物表達(dá)載體來(lái)表達(dá)RNAi分子。RNAi分子一般在長(zhǎng)度上為至少25個(gè)核苷酸并與本文中公開(kāi)的核酸序列（例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)之一具有至少91%序列同一性(例如，至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性），或者在嚴(yán)格條件下與本文中公開(kāi)的核酸序列(例如，SEQIDΝΟ:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)之一雜交。在嚴(yán)格條件下的雜交如上文所述。[0090]將核酸(例如，異源核酸）導(dǎo)入植物細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如粒子轟擊、土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，參見(jiàn)，例如，Yoo等人(2007，Nature?仰切(3〇18,2(7):1565-72))、脂質(zhì)體介導(dǎo)的0嫩攝取、或電穿孔。轉(zhuǎn)化之后，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞可被再生為轉(zhuǎn)基因煙草植物。如本文中描述的，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)導(dǎo)致葉中展現(xiàn)出至少一種生物堿的量減少，和/或所得的調(diào)制葉中至少一種TSNA的量降低，相對(duì)于來(lái)自不表達(dá)轉(zhuǎn)基因的植物的葉?？梢詫?duì)再生的轉(zhuǎn)基因植物的葉篩選調(diào)制葉中一種或多種生物堿和/或一種或多種TSNA的量，并且可以選擇與相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因植物相比在所得調(diào)制葉中具有降低量的至少一種生物堿和/或至少一種TSNA的植物，以供在例如本文論述的育種計(jì)劃中使用。[0091]賦予諸如除草劑抗性(有時(shí)被稱為除草劑耐受性）、抗蟲(chóng)性、或脅迫耐受性之類的性狀的核酸也可存在于本文描述的新的煙草植物中。賦予針對(duì)抑制生長(zhǎng)點(diǎn)或分生組織的除草劑(例如咪唑啉酮或磺酰脲)的抗性的基因可能是適合的。這個(gè)類別中的示例性基因編碼突變體ALS和AHAS酶，如在例如美國(guó)專利Nos.5，767，366和5，928，937中描述的。美國(guó)專利Nos.4，761，373和5，013，659涉及抵抗不同的咪唑啉酮或磺酰脲除草劑的植物。美國(guó)專利No.4,975,374涉及含有編碼抵抗除草劑的抑制作用的突變體谷氨酰胺合成酶(GS)的基因的植物細(xì)胞和植物，已知這些除草劑(例如膦絲菌素和甲硫氨酸亞砜亞胺)抑制GS。美國(guó)專利No.5，162,602公開(kāi)了抵抗環(huán)己二酮和芳氧苯氧丙酸除草劑的抑制作用的植物。[0092]抗草甘膦的基因也是適合的。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利Nos.4，940，835和4，769，061。這樣的基因可賦予對(duì)草甘膦除草劑組合物的抗性，所述組合物包含但不限于草甘膦鹽類，如三甲基硫鹽、異丙胺鹽、鈉鹽、鉀鹽和銨鹽。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利如8.6,451，735和6,451，732。抵抗磷酰基化合物(例如草銨膦或膦絲菌素、以及吡啶氧基丙酸或苯氧基丙酸和環(huán)己酮）的基因也是適合的。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利如8.5,879,903;5,276,268;和5,561，236;以及歐洲申請(qǐng)No.0242246。[0093]其他適合的除草劑包括抑制光合作用的那些，例如三嗪和苯基氰(腈水解酶）。參見(jiàn)美國(guó)專利No.4，810，648。其他適合的除草劑包括2，2-二氯丙酸、稀禾定、吡氟氯禾靈、咪唑啉酮除草劑、磺酰脲除草劑、三唑嘧啶除草劑、均三嗪除草劑以及溴草腈。其他適合者為對(duì)原卟啉原氧化酶(protox)酶賦予抗性的除草劑。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.6，084，155和US20010016956。[0094]可得到對(duì)例如鱗翅目昆蟲(chóng)之類的昆蟲(chóng)賦予抗性的多種基因。示例性基因包括編碼截短的CrylA(b)和CrylA(c)毒素的那些基因。參見(jiàn)，例如，描述于美國(guó)專利Nos.5,545,565;6,166,302以及5,164,180中的基因。參見(jiàn)例如，Vaeck等人，1997，Nature,328:33-37和Fischhoff等人，1987，NatureBiotechnology，5:807-813。特別有用的是編碼展現(xiàn)出針對(duì)煙草天蛾（tobaccohornworm);煙芽夜蛾（煙草姐蟲(chóng)）和/或煙草斜紋夜蛾（tobaccocutworm)的殺蟲(chóng)活性的毒素的基因。[0095]具有增加的葉生物堿量的植物及制造方法[0096]可以在植物中過(guò)表達(dá)本文中描述的序列以增加葉中一種或多種生物堿(和/或一種或多種TSNA)的量。因此，提供了轉(zhuǎn)基因煙草植物、或來(lái)自這種植物的葉，所述植物經(jīng)過(guò)本文中描述的在能驅(qū)動(dòng)植物中表達(dá)的啟動(dòng)子(例如，植物啟動(dòng)子）的控制之下的核酸分子(例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)或其功能片段的轉(zhuǎn)化。如本文中論述的，在植物表達(dá)載體中的核酸分子可具有與本文中描述的序列不同的序列，其不同可表示為序列同一性百分比（例如，相對(duì)于SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)或基于所述序列與SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90雜交的條件。[0097]作為利用全長(zhǎng)序列的替代方案，可以采用編碼具有期望功能性的多肽片段(在本文中稱為"功能片段"）的序列的一部分。當(dāng)采用核酸時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解的是，具有功能性的并不是核酸片段，而是被編碼的多肽片段?；诒疚闹械陌l(fā)明公開(kāi)在以及在圖1、2、3和4中所示的比對(duì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)測(cè)能夠賦予期望的功能性的多肽的部分(例如，一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域)。[0098]在轉(zhuǎn)化之后，轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞可被再生為轉(zhuǎn)基因煙草植物?？梢詫?duì)再生的煙草植物的葉篩選一種或多種生物堿的量，并且可以選擇與相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因植物中的量相比至少一種生物堿的量有所增加的植物，以供在例如本文論述的育種計(jì)劃中使用。，核酸分子或其功能片段的表達(dá)可導(dǎo)致葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量相比來(lái)自不表達(dá)所述核酸分子或其功能片段的煙草植物的葉有所增加。還可將賦予除草劑抗性、抗蟲(chóng)性、或脅迫耐受性的核酸導(dǎo)入這樣的煙草植物中。_9]煙草產(chǎn)品和制造方法[0100]本文中描述的方法允許改變煙草植物中的葉成分。如本文中描述的，改變?nèi)~成分是指降低或增加葉中至少一種生物堿的量。如本文中描述的，這樣的方法可包括誘變(例如，隨機(jī)或靶向的)或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物(例如，利用RNAi或過(guò)表達(dá)）。[0101]來(lái)自這樣的煙草的葉（例如，具有一種或多種生物堿量的降低或增加)可以調(diào)制、陳化、回潮和/或發(fā)酵。調(diào)制煙草的方法是熟知的，包括例如晾制、熏制、調(diào)制和曬制。陳化也是已知的，并且一般在木桶（例如，大桶)或硬紙盒中在約10%到約25%的含濕量在壓實(shí)條件下進(jìn)行幾年(例如，2到5年）（參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利如.4,516,590和5,372，149)?；爻崩绨ㄈ鏤S2004/0118422或US2005/0178398中描述的加熱、蒸發(fā)水分或巴氏消毒步驟，而發(fā)酵的典型特征為高初始含濕量、產(chǎn)熱、和10%到20%的干重?fù)p失。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利Nos.4,528，993、4,660，577、4,848,373和5,372,149。在需要時(shí)，煙草還可以進(jìn)一步加工（例如，切割、膨脹、混合、研磨或粉碎），并用于煙草產(chǎn)品中。[0102]煙草產(chǎn)品是本領(lǐng)域已知的，并且包括任何從煙草制成或衍生的旨在用于人類消費(fèi)的產(chǎn)品，包括煙草產(chǎn)品的任何組分、部分、或輔助用品。代表性煙草產(chǎn)品包括但不限于，無(wú)煙煙草產(chǎn)品、煙草衍生的煙堿產(chǎn)品、小雪前、無(wú)通氣凹槽(non-ventilatedrecess)過(guò)濾嘴香煙、通氣凹槽(ventedrecess)過(guò)濾嘴香煙、雪茄、鼻煙、煙斗煙草、雪茄煙草、香煙煙草、咀嚼煙草、煙葉、煙絲、和切碎煙草。代表性無(wú)煙煙草產(chǎn)品包括，例如，咀嚼煙草、濕鼻煙(snus)、煙袋(pouch)、煙膜(film)、煙片（tablet)、涂層煙釘(coateddowel)、煙桿(rod)，等等。代表性香煙和其他煙制品包括，例如，包括濾芯或桿元件在內(nèi)的煙制品，其中可以點(diǎn)燃抽吸的材料桿元件可包括在煙草混合物之內(nèi)的調(diào)制煙草。除了本文中描述的生物堿降低的煙草之外，煙草產(chǎn)品還可包含其他成分，例如但不限于，粘合劑、增塑劑、穩(wěn)定劑、和/或調(diào)味劑。參見(jiàn)，例如，US2005/0244521、US2006/0191548、US2012/0024301、US2012/0031414、和US2012/0031416,為煙草產(chǎn)品的實(shí)例。[0103]將在下列實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例并不限制權(quán)利要求書(shū)中記載的主題方法和組合物的范圍。實(shí)施例[0104]實(shí)施例1一生物堿從根到葉的轉(zhuǎn)運(yùn)[0105]以前的研究已顯示，花煙草，普通煙草的一種親緣植物，不轉(zhuǎn)運(yùn)生物堿到葉(Pakdeechanuan等人，2012，PlantCellPhysiol·，53(7):1247-54)。這種表型的證實(shí)如圖5中所示。還測(cè)試了花煙草在打頂(topping)之后能夠轉(zhuǎn)運(yùn)生物堿的可能性。參見(jiàn)表1。所有測(cè)試情形下均未發(fā)現(xiàn)生物堿轉(zhuǎn)運(yùn)到葉。[0106]表1.打頂和未打頂?shù)幕煵莸娜~和根的生物堿含量[0107][0108]L0Q，定量限;ND，未檢測(cè)到[0109]實(shí)施例2-RNA制備和測(cè)序[0110]在打頂之前和之后從花煙草植物的根組織采集RNA，利用來(lái)自Illumina的True-SeqLibraryConstructionKit建立RNA測(cè)序文庫(kù)。利用IlluminaMiSeq平臺(tái)完成花煙草RNA的測(cè)序。測(cè)序進(jìn)程以150個(gè)周期的雙端讀段參數(shù)進(jìn)行，并使用E-基因毛細(xì)管電泳儀確定文庫(kù)質(zhì)量和平均大小。通過(guò)ArrayXpress(Raleigh，NC)進(jìn)行的RNA深度測(cè)序，確定TN90煙草中的根特異性基因表達(dá)。[0111]在測(cè)序之后，修整所得序列，并將品質(zhì)得分高于30的讀段裝配為重疊群。然后將單獨(dú)的序列讀段回貼(map)到這些重疊群上。測(cè)序進(jìn)程1生成了針對(duì)總共69Mb序列數(shù)據(jù)的460萬(wàn)個(gè)回貼讀段，測(cè)序進(jìn)程2生成了針對(duì)總共37.5Mb序列數(shù)據(jù)的250萬(wàn)個(gè)回貼讀段。這產(chǎn)生了106.5Mb序列讀段，供花煙草基因表達(dá)分析中使用。[0112]通過(guò)與具有95%序列同一性截止值的本塞姆氏煙草參考基因組相比較，確定全長(zhǎng)編碼序列。全長(zhǎng)編碼序列和由此編碼的預(yù)測(cè)多肽顯示在SEQIDN0:1-50和70-91中。[0113]實(shí)施例3-表達(dá)水平的分析[0114]分析TN90和花煙草基因表達(dá)數(shù)據(jù)，以鑒定相比于普通煙草在花煙草中差異表達(dá)或未檢出的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因?；谂c其他組織的表達(dá)差異，針對(duì)根特異性表達(dá)將TN90表達(dá)數(shù)據(jù)過(guò)濾（>9倍以上的基因表達(dá)，p值〈0.000001)。然后針對(duì)高的根表達(dá)(在打頂之后>100個(gè)讀段)將結(jié)果過(guò)濾。然后針對(duì)基因本體論(G0)術(shù)語(yǔ)將基因過(guò)濾，所述術(shù)語(yǔ)表示次級(jí)代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（例如，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)運(yùn)"結(jié)合"藥物"或"噪呤"用于過(guò)濾結(jié)果）。利用相同的G0標(biāo)準(zhǔn)，將兩個(gè)獨(dú)立的測(cè)序輪次中在花煙草中未檢出的基因過(guò)濾。然后比較這些數(shù)據(jù)集，以確定落入所有三個(gè)類別的基因（即，（i)高的根特異性表達(dá)、（ii)G0標(biāo)準(zhǔn)、和(iii)在花煙草中不表達(dá)）。[0115]在表2中列出這些基因、以及它們?cè)赥N90煙草中的表達(dá)水平。[0116]表2.在TN90中的基因表達(dá)[0118]*，打頂之后的小時(shí)數(shù);ND=未檢出[0119]還分析了花煙草基因相對(duì)于TN90表達(dá)的表達(dá)水平，以確定可能在花煙草中高表達(dá)、而不在普通煙草中高表達(dá)的調(diào)芐基因和/或生物合成基因。鑒定了四個(gè)靶標(biāo)，在表3中列出。[0120]表3.在花煙草中高表達(dá)的基因的表達(dá)[0121][0122][0123]a，在打頂之后72小時(shí)采集的根組織;*，打頂之后的小時(shí)數(shù)[0124]實(shí)施例4一序列比對(duì)[0125]預(yù)期涉及轉(zhuǎn)運(yùn)的基因落入五個(gè)主要類別:煙堿攝取通透酶(Nup)家族、多藥和毒性化合物外排型(MATE)家族、多藥耐藥(MDR)家族、和多向耐藥(PDR)家族、以及一組無(wú)關(guān)基因。將核苷酸序列和預(yù)測(cè)的多肽序列與保藏在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較。這些比較的結(jié)果顯示在表4(Nup序列）、表5(MDR序列）、表6(MATE序列）、表7(PDR序列）、表8(其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列）、和表9(以高水平表達(dá)的花煙草基因）中。[0126]表4.Nup序列[0127][0128]表5.MDR序列[0131]表6.MATE序列[0133]表7.TOR序列[0134][0135]表8.其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列[0136][0137]表9.以高水平在花煙草中表達(dá)的基因[0138][0139]在花煙草中相對(duì)于普通煙草高表達(dá)的基因之一，C33728,似乎是富含AC的結(jié)合因子(ACBF)調(diào)節(jié)蛋白。這種多肽當(dāng)被轉(zhuǎn)移到煙草時(shí)，顯示出與來(lái)自豆類的異源性木質(zhì)部相關(guān)啟動(dòng)子的啟動(dòng)子中富含AC的重復(fù)區(qū)域結(jié)合，而且發(fā)現(xiàn)所述多肽在所有組織中表達(dá)，但最普遍地在植物的莖中表達(dá)(S6guin等人，1997，PlantMol.Biol.，35(3):281-91)。該多肽含有三個(gè)不同的預(yù)測(cè)的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)可能涉及基因活化的富谷氨酰胺區(qū)域。這些預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)域在下文的SEQIDN0:50中以下劃線表示。N端結(jié)構(gòu)域富含谷氨酰胺。這種類型的結(jié)構(gòu)域架構(gòu)可見(jiàn)于許多剪接因子中（Lorkovic和Barta，2002，Nuc.AcidsRes.，30:623-35)〇[0141]實(shí)例5-RNAi品系開(kāi)發(fā)、質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)化[0142]為了評(píng)估候選基因的功能，產(chǎn)生了兩組轉(zhuǎn)基因植物，一組利用全長(zhǎng)編碼序列，一組利用RNAi序列（參見(jiàn)圖6)。為了表達(dá)全長(zhǎng)編碼序列或RNAi序列，使用了一種表達(dá)載體（SEQIDN0:21)，其具有CsVMV啟動(dòng)子和N0S終止子、以及一個(gè)帶有肌動(dòng)蛋白2啟動(dòng)子指導(dǎo)下的卡那霉素選擇標(biāo)志物(NPTII)并具備N0S終止子的盒。利用DNA轟擊或基因槍法，將攜帶感興趣轉(zhuǎn)基因的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入煙草葉盤中。參見(jiàn)，例如，Sanford等人，1993,MethodsEnzymol·，217:483-510;以及Okuzaki和Tabei，2012，PlantBiotechnology，29:307-310。[0143]簡(jiǎn)言之，如下所述將含有轉(zhuǎn)化盒的質(zhì)粒DNA包被在Ιμπι的金顆粒上(DNA/金）dym的金顆粒在180°C烘烤12小時(shí)，并制備儲(chǔ)液(40mg/ml)。為了制備用于10次射彈的混合物，在1·5ml的管中將100μ1的儲(chǔ)液與40μ1的表達(dá)載體DNA(lygAU)、100μ1的2·5MCaCl2、和40μ1的0.1Μ亞精胺混合。將混合物在13，000Xg下離心30秒，并用500μ1100%乙醇洗滌沉淀。DNA/金混合物懸浮在100μ1的水中，加10μ1到載體膜(macrocarrier)上，干燥，然后進(jìn)行轟擊。在]^S-lOOO/He系統(tǒng)（Bio-RadLaboratories，Hercules，CA，USA)中，米用1，100psi破裂盤在部分真空下(71ImmHg)對(duì)每個(gè)平板進(jìn)行兩次射彈轟擊。[0144]NarrowLeafMadole(NLM)和Tennessee90(TN90)煙草葉盤以RNAi構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，而花煙草的煙草葉盤以全長(zhǎng)候選基因構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將完整煙葉（約45X30mm長(zhǎng))置于MS培養(yǎng)基上過(guò)夜，在第二天用所述構(gòu)建體對(duì)葉盤進(jìn)行轟擊。然后將葉子切成小片（約5X5mm)，置于Τ0Μ培養(yǎng)基(含20g蔗糖/L;lmg/LIAA和2.5mg/LBAP的MS培養(yǎng)基）上在27°C培育3-5天，然后轉(zhuǎn)移到含300mg/l卡那霉素的Τ0Μ培養(yǎng)基(TOM-Kan)上培育。每2-3周將組織轉(zhuǎn)移至噺的TOM-Kan平板上，持續(xù)4-6周（27°C，16h光照）。在轟擊4-6周之后再生抗卡那霉素的初生芽。將芽轉(zhuǎn)移到MS卡那霉素平板上以生根。[0145]評(píng)估來(lái)自T1植物(及后續(xù)世代）的葉和/或根，以確定一種或多種生物堿和/或一種或多種TSNA的量。[0146]實(shí)施例6-RNAi分子的序列和表達(dá)構(gòu)建體[0147]RNAi分子序列在下文示出。加雙下劃線部分是環(huán)，其來(lái)自煙草QS基因序列。[0163]表達(dá)盒的序列顯示在下文，其中有關(guān)部分指示在左邊緣。還參見(jiàn)圖6。[0164]轉(zhuǎn)化盒序列（SEQIDN0:57):[0166]實(shí)施例7-隨機(jī)誘變和突變體的表征[0167]對(duì)于EMS突變，將一克(大約10,000粒種子)Tennessee90煙草(TN90)轉(zhuǎn)化種子在0.1%吐溫:?中洗滌十五分鐘，然后在30ml的ddH2〇中浸泡兩小時(shí)。然后將一百五十（150)μ1的0.5%EMS(Sigma，目錄號(hào)Μ-0880)混合到種子/ddH2〇溶液中，在罩子下在室溫(RT;大約20°C)溫育8-12小時(shí)（在30rpm旋轉(zhuǎn)）。然后從種子去除液體，并將液體混合到1MNaOH中過(guò)夜，以去污和處置。然后用l〇〇mlddH20洗滌種子兩次，每次2-4小時(shí)。然后將洗滌的種子懸浮在0.1%瓊脂:水溶液中。[0168]將瓊脂溶液中的EMS處理過(guò)的種子以約2000粒種子/淺箱均勻撒布在裝有浸水的Carolina'sChoiceTobaccoMix?(CarolinaSoilCompany，Kinston，NC)淺箱上。然后用塑料包裝覆蓋這些淺箱，置于生長(zhǎng)室中。一旦苗從土壤中萌出，即刺穿塑料包裝，以便讓濕度逐漸下降。兩周之后完全移除塑料包裝。將淺箱移動(dòng)到溫室，用NPK肥料進(jìn)行施肥。將苗插入浮盤中，培育至移植大小。將植物移植到田間。在生長(zhǎng)期間，植物進(jìn)行自花授粉，形成施種子。在成熟期，從每株植物收獲五個(gè)莢，對(duì)來(lái)自每株植物的種子集合給予單獨(dú)命名。這形成Μι種群。[0169]種植每株Mo植物的％種子的混合物，從％植物采集葉子并提取DNA。擴(kuò)增靶基因并測(cè)序，以便進(jìn)行突變鑒定。[0170]實(shí)施例8-使用TALEN的靶向誘變[0171]在特異性基因靶內(nèi)或在啟動(dòng)子序列內(nèi)發(fā)現(xiàn)了基因特異性TALEN識(shí)別序列，可用于靶向缺失或啟動(dòng)子插入以便降低基因表達(dá)或改變組織特異性表達(dá)。感興趣區(qū)域的序列顯示在下文（SEQIDN0:61-69)。在感興趣區(qū)域的相應(yīng)序列中，基因C22474(Pdr5b)的特異性靶序列以下劃線表示。感興趣的所有TALEN區(qū)域的位置示意性地顯示在圖7中。黃色條表示包含內(nèi)含子的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物。綠色表示標(biāo)記為啟動(dòng)子區(qū)域的上游區(qū)域?；谝阎幕蚪M序列信息，這些TALEN位點(diǎn)對(duì)于單基因靶是特異的。每個(gè)基因的TALEN區(qū)域1和2用來(lái)破壞啟動(dòng)子或編碼區(qū)的5'端，而其他區(qū)域只用來(lái)破壞編碼序列。[0190]將感興趣基因的革巴序列送到LifeTechnology(Carlsbad，CA)，以確定轉(zhuǎn)錄激活因子樣(TAL)效應(yīng)蛋白的可能結(jié)合位點(diǎn)序列。由LifeTechnology合成TAL并克隆到發(fā)明人的植物表達(dá)載體PALCS1中，用作入門載體。根據(jù)用途，可以采用五種不同的方案來(lái)產(chǎn)生誘變的煙草品系：1)將一個(gè)或多個(gè)入門載體(含有靶TAL的pALCSl)直接轉(zhuǎn)化到煙草原生質(zhì)體中，以產(chǎn)生隨機(jī)序列缺失或插入誘變煙草品系;2)將左右兩側(cè)由與靶插入序列同源的序列包夾的供體序列(例如，報(bào)告基因，例如，GUS基因）連同一個(gè)或多個(gè)入門載體(含靶TAL的pALCS1)共轉(zhuǎn)化到煙草原生質(zhì)體中，以產(chǎn)生含報(bào)告基因的誘變煙草品系;3)將包含具有點(diǎn)突變的靶TAL的供體序列連同一個(gè)或多個(gè)入門載體(含靶TAL的pALCSl)共轉(zhuǎn)化到煙草原生質(zhì)體中，以產(chǎn)生具有點(diǎn)突變的誘變煙草品系;4)含組織特異性啟動(dòng)子序列的供體序列，其產(chǎn)生以組織特異性方式表達(dá)內(nèi)源基因的突變體煙草品系;和5)含有上述供體序列與報(bào)告基因構(gòu)建體的組合的供體序列，其促進(jìn)突變體煙草的篩選。[0191]從生長(zhǎng)室中Magenta盒內(nèi)培植的TN90煙草的葉分離煙草原生質(zhì)體。將來(lái)自3-4周大的植物的充分展開(kāi)的葉（5cm)從葉中部切割成0.5到1mm的葉條。將葉條轉(zhuǎn)移到制備的酶溶液（1%纖維素酶R10、0.25%離析酶RHK0.4M甘露醇、20mMKCl、20mMMES(pH5.7)、10mMCaCl2、0.1%BSA)中，將葉條的兩個(gè)側(cè)面浸入。使用干燥器在黑暗中將葉條進(jìn)行真空浸潤(rùn)30分鐘，在沒(méi)有攪拌的條件下，在黑暗中在室溫繼續(xù)消化4小時(shí)到整夜。原生質(zhì)體在100μπι尼龍過(guò)濾器中過(guò)濾，用3mlLymphoprep進(jìn)行純化。用W5n溶液（154mMNaCl、125mMCaCl2、5mM1((：1、211^1^3、99111^/1葡萄糖，？!15.7)將原生質(zhì)體離心和洗滌，并以51105/1111的濃度懸浮在W5n溶液中。將原生質(zhì)體在冰上保持30分鐘，以便重力沉降到管的底部。移去W5n溶液，在室溫下使原生質(zhì)體重懸在P2溶液中。在15ml微量離心管中輕輕混合50μ1DNA(10-20yg的質(zhì)粒）、500μ1原生質(zhì)體(2xl05個(gè)原生質(zhì)體)和550μ1的PEG溶液(40%，v/v10ml4gPEG4000、0.2M甘露醇、0.1MCaCl2)，在室溫下溫育混合物5分鐘。[0192]離心沉淀原生質(zhì)體并將其重懸在lml2X8EN1(8EN1:沒(méi)有NH4N03的MS鹽、MS維生素、0.2%肌醇、4mMMES、lmg/lNAA、lmg/lΙΑΑ、0·5Μ甘露醇、0.5mg/lΒΑΡ、1·5%蔗糖）中。用等量的低熔點(diǎn)瓊脂(LMA)使轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體成凝膠狀，0.2ml的原生質(zhì)體LAM滴落形成珠子。珠子中加入10ml8ENl，7天后，取出5ml8EN1并添加5ml8EN2(具有0.25M甘露醇的8EN1);又過(guò)7天之后（第14天），取出10ml8EN2并添加10ml8EN2;再過(guò)7天（第21天），取出5ml8EN2并添加5ml8EN3(具有3%蔗糖而沒(méi)有甘露醇的8EN1);再過(guò)7天（第28天），取出10ml8EN3并添加10ml8EN3。將原生質(zhì)體保持兩周，直到微愈傷組織生長(zhǎng)時(shí)為止。愈傷組織轉(zhuǎn)移到NCM固體培養(yǎng)基上，直到達(dá)到約5mm時(shí)為止(通常約兩周）。愈傷組織轉(zhuǎn)移到TOM-Kan固體培養(yǎng)基上生根，并采用本文中描述的方法使轉(zhuǎn)化的煙草植物再生。[0193]表10.TAL效應(yīng)子結(jié)合位點(diǎn)序列[0194][0?95]加下劃線=TAL結(jié)合位點(diǎn)；TAL結(jié)合位點(diǎn)之間的非加下劃線區(qū)域=設(shè)計(jì)發(fā)生DNA切割的位置[0196]實(shí)施例9一篩選植物的生物堿含量調(diào)節(jié)[0197]在田間類似條件下的溫室中，在裝有Carolina'sChoiceTobaccoMix(CarolinaSoilCo.，Kinston，NC)10英寸盆中培育實(shí)施例5、6、7或8中鑒定的轉(zhuǎn)基因和突變體煙草植物。在開(kāi)花期，將植物打頂，并在2周之后從打開(kāi)的葉和根采集組織樣品。[0198]利用研缽及研件研磨組織。使用來(lái)自AristaLaboratories的認(rèn)證方案，通過(guò)氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用確定生物堿含量。確定煙堿、降煙堿、新煙堿及新煙草堿的量以及總生物堿的含量。[0199]實(shí)施例10-煙堿補(bǔ)加測(cè)定[0200]通過(guò)與肥水一道補(bǔ)加煙堿來(lái)提高煙堿的量，可以測(cè)試轉(zhuǎn)基因幼苗中的煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)，而且與等候內(nèi)源生物堿達(dá)到可測(cè)相比，表型確定可以大大提早。通過(guò)兩種獨(dú)立的方法進(jìn)行補(bǔ)加測(cè)定。在第一種方法中，幼苗轉(zhuǎn)移到Styrofoam浮盤中。讓這些植物在lOOpprn肥水(Pete'sProfessional)中生長(zhǎng)，直到根開(kāi)始從盤底出現(xiàn)時(shí)為止。然后使盤漂浮在加肥料的煙堿溶液（1禮煙堿、lOOpprn肥料）中，持續(xù)三天。收獲根和葉組織，并如上所述提取和分析生物堿。計(jì)算根和葉的煙堿含量以及葉與根煙堿水平的比值（圖8)。在第二種方法中，將植物轉(zhuǎn)移到4英寸盆。在根生長(zhǎng)至足以將土壤保持在一起之后，轉(zhuǎn)移到去底的4英寸盆中。生長(zhǎng)2周之后，用加肥料的煙堿溶液處理植物，每天兩次，持續(xù)2天。在補(bǔ)加煙堿之前和之后收獲葉子，并如前所述提取和分析生物堿。在補(bǔ)加之前和之后的葉煙堿含量顯示在圖9中。[0201]在表達(dá)靶向roR家族基因C22474的RNAi構(gòu)建體(PALCS-TDNA-R1)的兩種植物中發(fā)現(xiàn)煙堿水平降低:靶向MDR家族基因11099的RNAi構(gòu)建體(pALCS-TDNA-R2)的一種植物顯示出在飼喂之后的煙堿水平降低；并且靶向未分類基因C43677的RNAi構(gòu)建體(pALCS-TDNA-R4)的一種植物也顯示出葉中煙堿水平的降低。RNAi靶向位點(diǎn)的位置顯示在圖7中。[0202]實(shí)施例11一普通煙草與耳狀煙草的比較[0203]普通煙草來(lái)源于兩個(gè)不同的煙草屬譜系的雜交。花煙草代表不轉(zhuǎn)運(yùn)生物堿的林煙草譜系成員（參見(jiàn)以上實(shí)施例3)。耳狀煙草為其他譜系（絨毛狀煙草）的非轉(zhuǎn)運(yùn)成員。進(jìn)行RNA測(cè)序來(lái)確定在耳狀煙草中缺失但在普通煙草中以高水平存在的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因。[0204]簡(jiǎn)言之，打頂10天之后，從耳狀煙草和普通煙草TN90的根樣品采集根樣品。由AmbryGenetics(Aliso￥丨6]_〇,04)提取1?嫩并完成測(cè)序。1?熟測(cè)序產(chǎn)生了1.25億個(gè)序列讀段。生成耳狀煙草的從頭重疊群序列，并且使用以前從TN90獲得的基因組序列供比較。將序列讀段回貼到耳狀煙草的從頭重疊群序列，然后將剩余的未回貼讀段回貼到TN90基因組，得到一系列預(yù)期將不存在于耳狀煙草中的基因?；诨虮倔w論術(shù)語(yǔ)，選擇與次級(jí)代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的基因。這些基因在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平顯示在表11中。[0205]表11.在TN90中的基因表達(dá)[0207]*，打頂之后的小時(shí)數(shù);ND=未檢測(cè)到[0208]將核苷酸序列和預(yù)測(cè)的多肽序列與保藏在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較。這些比較的結(jié)果在表12中示出。[0209]表12.序列比對(duì)[0210][0211][0212]應(yīng)當(dāng)理解的是，雖然在本文中結(jié)合許多不同的方面描述了主題方法和組合物，但前述各個(gè)方面的說(shuō)明旨在展示而不是限制主題方法和組合物的范圍。其他方面、優(yōu)點(diǎn)、以及修改落在以下的權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)?！局鳈?quán)項(xiàng)】1.一種煙草雜種、品種、品系、或栽培種，其包括在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源核酸中具有突變的植物，所述內(nèi)源核酸具有選自SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、和90的序列。2.權(quán)利要求1的煙草雜種、品種、品系、或栽培種，其中來(lái)自所述植物的葉相對(duì)于來(lái)自缺少所述突變的植物的葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量降低。3.權(quán)利要求2的煙草雜種、品種、品系、或栽培種，其中來(lái)自所述植物的調(diào)制葉相對(duì)于來(lái)自缺少所述突變的植物的調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種煙草特異性亞硝胺(TSNA)的量降低。4.由權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的煙草雜種、品種、品系、或栽培種產(chǎn)生的種子，所述種子在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源核酸中包含突變，所述內(nèi)源核酸具有選自SEQIDΝΟ:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、和90的序列。5.-種制造煙草植物的方法，包括下列步驟：在普通煙草(Nicotianatabacum)細(xì)胞中誘導(dǎo)誘變以產(chǎn)生誘變細(xì)胞；獲得來(lái)自誘變細(xì)胞的一株或多株植物;和鑒定其中至少一株在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源核酸中包含突變的植物，所述內(nèi)源核酸具有選自SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、和90的序列。6.權(quán)利要求5的方法，進(jìn)一步包括鑒定其中至少一株包含這樣的葉的植物:所述葉相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的植物的葉展現(xiàn)出至少一種生物堿量降低。7.權(quán)利要求6的方法，進(jìn)一步包括鑒定其中至少一株包含這樣的葉的植物:所述葉在調(diào)制后，相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的植物的調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種TSNA量降低。8.權(quán)利要求5的方法，其中誘變是使用化學(xué)誘變劑或電離輻射誘導(dǎo)的。9.權(quán)利要求8的方法，其中化學(xué)誘變劑選自亞硝酸、疊氮化鈉、吖啶橙、溴化乙錠、和甲磺酸乙酯(EMS)。10.權(quán)利要求8的方法，其中電離輻射選自X射線、γ射線、快中子照射、和UV照射。11.權(quán)利要求5的方法，其中誘變是使用TALEN誘導(dǎo)的。12.權(quán)利要求5的方法，其中誘變是使用鋅指技術(shù)誘導(dǎo)的。13.-種產(chǎn)生煙草植物的方法，所述方法包括下列步驟：使第一煙草品系的至少一株植物與第二煙草品系的至少一株植物雜交，所述第一煙草品系的植物在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源核酸中具有突變，所述內(nèi)源核酸具有選自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、和90的序列；和選擇具有所述突變的后代煙草植物。14.權(quán)利要求13的方法，進(jìn)一步包括選擇包含這樣的葉的后代煙草植物:所述葉相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的植物的葉展現(xiàn)出至少一種生物堿量降低。15.權(quán)利要求14的方法，進(jìn)一步包括選擇包含這樣的葉的后代煙草植物:所述葉在調(diào)制后，相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的植物的調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種TSNA量降低。16.-種包含來(lái)自煙草植物的調(diào)制葉的煙草產(chǎn)品，所述所述煙草植物在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源核酸中具有突變，所述內(nèi)源核酸具有選自SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、和90的序列。17.權(quán)利要求16的煙草產(chǎn)品，其中所述葉相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的植物的葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量降低。18.權(quán)利要求17的煙草產(chǎn)品，其中所述調(diào)制葉相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的植物的調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種TSNA的量降低。19.一種產(chǎn)生煙草產(chǎn)品的方法，該方法包括：提供來(lái)自在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源核酸中具有突變的煙草植物的調(diào)制葉，所述內(nèi)源核酸具有選自SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、和90的序列；和利用所述調(diào)制葉制造煙草產(chǎn)品。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述調(diào)制葉相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的植物的調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種生物堿的量降低。21.權(quán)利要求19的方法，其中所述調(diào)制葉相對(duì)于來(lái)自缺乏突變的植物的調(diào)制葉展現(xiàn)出至少一種TSNA的量降低。22.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述突變選自點(diǎn)突變、插入、缺失、和取代。23.-種篩選植物的方法，其包括：提供來(lái)自權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的植物的植物材料;和確定植物組織中一種或多種生物堿的量。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述植物組織是葉。25.權(quán)利要求23的方法，其中所述植物組織是根。【文檔編號(hào)】A24B13/00GK105960460SQ201480075000【公開(kāi)日】2016年9月21日【申請(qǐng)日】2014年12月8日【發(fā)明人】J·弗雷德里克,Y·沈,D·許,U·瓦雷克,J·A·斯特里克蘭【申請(qǐng)人】奧馳亞客戶服務(wù)公司