生產(chǎn)低酒精水果飲料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生產(chǎn)具有減少酒精水平的發(fā)酵水果飲料，諸如葡萄酒和蘋果酒。特別地，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)具有減少酒精含量的飲料的方法，所述方法包括使用同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株和酵母菌株的反接種或共同接種。DSMZ 2756520130801
【專利說明】
生產(chǎn)低酒精水果飲料
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生產(chǎn)具有減少酒精水平的發(fā)酵水果飲料，諸如葡萄酒和蘋果酒。具體 地，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)具有減少酒精含量的飲料的方法，所述方法包括使用同型發(fā) 酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株和酵母菌株的反接種或共同接種。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)今，隨著消費者的社會意識和健康意識逐漸增強，其結(jié)果是在葡萄酒界高度需 求減少最終葡萄酒中酒精含量的解決手段。作為高濃度葡萄酒的替代品，具有減少酒精含 量的葡萄酒為消費者提供許多潛在的社會和健康益處。社會益處一般而言可能包括涉及酒 精的活動(例如商務(wù)午餐)之后的生產(chǎn)率和功能改善、駕駛事故風(fēng)險降低和更可接受的社會 行為。健康優(yōu)勢可能包括減少熱卡攝取量、減少酒精相關(guān)病痛和疾病風(fēng)險，以及對于懷孕婦 女的特殊益處。對于這些葡萄酒的生產(chǎn)者而言，存在著對于確定的市場和細(xì)分市場的刺激， 以及在許多國家適用降低的銷售稅和關(guān)稅(Pickering，2000)。
[0003] 自從20世紀(jì)早期以來就已經(jīng)獲得生產(chǎn)酒精減少的葡萄酒的方法。雖然當(dāng)今的商業(yè) 生產(chǎn)幾乎完全依賴基于使用膜和改良蒸餾的系統(tǒng)，但是文獻(xiàn)中已經(jīng)提出來大量可選方法。 這些方法總結(jié)于表1中（Pickering,2000)。
[0004] 表1.用于生產(chǎn)酒精減少的葡萄酒的當(dāng)前技術(shù)(摘自Pickering,2000和Schmidtke 等，2012)
[0006] 當(dāng)使用未成熟水果和/或經(jīng)稀釋果汁/葡萄汁時，由于風(fēng)味前體的濃度降低，因此 會損害最終葡萄酒的風(fēng)味。乙醇的機械去除往往是一個嚴(yán)苛的過程，其影響葡萄酒的總體 化學(xué)組成，并從而也影響葡萄酒的感官分析和體驗。
[0007] 到目前為止已經(jīng)開展了許多工作，采用生物學(xué)方法減少糖。已經(jīng)探索了五種不同 的方法：1)在使用酵母屬（Saccharomyces sp .)發(fā)酵的過程中對葡萄汁充氣，將糖轉(zhuǎn)化為 C〇2、水和生物質(zhì)；2)在使用非酵母屬(non-Saccharomyces sp.)發(fā)酵的過程中對葡萄汁充 氣，將糖轉(zhuǎn)化為C〇2、水和生物質(zhì);3)使用非酵母屬和酵母屬依次發(fā)酵;4)提前終止發(fā)酵以生 產(chǎn)甜葡萄酒;和5)遺傳改良的葡萄酒釀酒酵母菌株以改變乙醇產(chǎn)量。
[0008] 自1989年以來就探索在使用酵母屬發(fā)酵的過程中通過對葡萄汁充氣以降低酒精 百分比。已經(jīng)描述了一種用于制備低糖或無糖果汁的方法，其基于用酵母連續(xù)或半連續(xù)培 養(yǎng)，使用的條件導(dǎo)致糖代謝為C02和水而不是乙醇，并從而通過分離生物質(zhì)而回收無酒精、 無糖或低糖的果汁(Kaeppeli，1989) Arossmann等（1991)描述了一種用于生產(chǎn)低酒精飲料 的類似系統(tǒng)，其中以可控方式向發(fā)酵液中添加氧氣，以使得糖轉(zhuǎn)化為水和C02。當(dāng)達(dá)到所需 的殘留酒精水平時中斷氧氣供應(yīng)，然后將酵母從發(fā)酵液中分離，并且最終微量過濾發(fā)酵液 以便產(chǎn)生澄清的液體產(chǎn)物。
[0009] 通過篩選豐富廣泛的酵母物種，Kolb等（ 1993)發(fā)現(xiàn)樹干畢赤酵母（Pichia stipitis)特別適用于去除果汁中的糖。他們的主張包括在20小時內(nèi)除去50%以上的果汁 中的糖，以及對于果汁的感官品質(zhì)和功能品質(zhì)產(chǎn)生最小的副作用。通過使用精選酵母菌株 調(diào)查改變充氣和溫度水平對于米勒-圖高(Muller-Thurgau)葡萄汁中糖減少和酒精產(chǎn)生的 影響獲得了類似結(jié)果（Smith等，1995)。七種酵母菌株顯示令人滿意的結(jié)果，其中三種菌株 引起酒精顯著減少：樹干畢赤酵母（Pichia stipitis)、熱帶假絲酵母（Candida tropical is)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。通過將減少糖含量的短期受控充 氣與使用葡萄酒活性干酵母進(jìn)行厭氧發(fā)酵相結(jié)合，產(chǎn)生具有可接受味道和酒精減少25至 30%的葡萄酒。然而，這些葡萄酒呈現(xiàn)深金黃色，顯示氧化，這在葡萄酒中通常是不期望的。
[0010]對于含有葡萄酒釀酒酵母菌株的非酵母屬物種的混合起子培養(yǎng)物的更多調(diào)查表 明，酒精百分比（v/v)能夠減少0 · 2-0 · 7% (Ciani和Ferraro，1996 ;Ferraro等，2000 ;Erten 和Campbell，2001;Ciani等，2006;Garcia等，2010;Maygar和Toth，2011;Comitini等，2011; Di Maio等，2012;Sadoudi等，2012)。在澳大利亞葡萄酒研究所(AWRI)近期的一篇發(fā)表文獻(xiàn) 中，對于屬于24個不同屬的50個不同非酵母屬分離株實施了評估，評估他們在與葡萄酒釀 酒酵母菌株一起用于依次接種方案中時產(chǎn)生具有降低酒精濃度的葡萄酒的能力 (Contreras等，2013)。先接種美極梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)AWRIl 149后接 種葡萄酒釀酒酵母菌株的依次接種是最好的組合，其能夠比單一接種物葡萄酒酵母對照產(chǎn) 生具有更低乙醇濃度的葡萄酒。采用AWRI1149的依次發(fā)酵在霞多麗(Chardonnay)和西拉 (Shiraz)中分別產(chǎn)生具有減少0.9% (v/v)和1.6% (v/v)(對應(yīng)于7.1 g/L和12.6g/L)的乙醇 濃度的葡萄酒。
[0011 ]在葡萄酒生產(chǎn)中降低乙醇的另一個方法是使用遺傳改良的酵母菌株(Kutyna等， 2010)。然而，隨著現(xiàn)在的消費者不愿意在葡萄酒中使用GM0酵母菌株，目前認(rèn)為這一可選方 法不可商業(yè)化實施。
[0012] 目前，所提到的方法的商業(yè)應(yīng)用有限。主要問題是與高濃度葡萄酒相比感官品質(zhì) 降低。特別地，已經(jīng)報道了風(fēng)味失調(diào)和"酒體"缺失的問題。導(dǎo)致風(fēng)味分布失調(diào)的主要風(fēng)味化 合物是乙酸乙酯，在使用目前方法生產(chǎn)的酒精減少的葡萄酒中通常發(fā)現(xiàn)其以非常高的濃度 存在。這些改變的感官特性能夠作為產(chǎn)生酒精減少的葡萄酒所需的加工過程的結(jié)果，或者 作為乙醇含量減少的直接結(jié)果而出現(xiàn)。獲得酒精減少的葡萄酒的生物學(xué)方法的主要特征是 使用非酵母屬酵母菌株時可能形成異味物質(zhì)（過高的乙酸濃度或乙酸乙酯濃度）或者在使 用充氣技術(shù)時最終葡萄酒氧化，從而導(dǎo)致不期望的感官特性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于在不損失葡萄酒的感官品質(zhì)的情況下 減少發(fā)酵水果飲料中酒精含量的替代性方法。
[0014] 該技術(shù)方案基于發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在酵母發(fā)酵之前接種或與酵母發(fā)酵同時接 種同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株(被稱為第I和II組)時，與僅利用酵母的發(fā)酵制造 的葡萄酒相比，葡萄酒中的酒精含量能夠降低至少0.5% (v/v)。
[0015] 發(fā)明人觀察到乳酸菌使用葡萄汁中的糖以形成乳酸（和其他代謝物)而不產(chǎn)生乙 醇。這樣，最終葡萄酒中的乙醇能夠減少，而對風(fēng)味分布沒有任何消極影響。
[0016] 而且，似乎這些葡萄酒中的果香以及口感都增強了。
[0017]此外，蘋果酸也可能由測試的同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳桿菌屬菌株轉(zhuǎn)化為乳 酸，這意味著在酒精發(fā)酵過程中發(fā)生了蘋果酸乳酸發(fā)酵(MLF)。
[0018] 這意味著，通過使用這一新技術(shù)，葡萄酒釀酒商能夠減少酒精并同時完成MLF，而 不損害風(fēng)味。
[0019] 與目前通過使用氧氣與酵母屬或非酵母屬酵母的組合或者通過使用具有降低的 糖生成乙醇的轉(zhuǎn)化率的非酵母屬菌株以降低酒精的一流生物學(xué)方法相比，本發(fā)明的技術(shù)將 同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株與葡萄酒酵母一起用于反接種(在用酵母發(fā)酵之前接 種乳酸菌菌株)或共同接種(在用酵母發(fā)酵的同時接種乳酸菌菌株）中，其并未導(dǎo)致葡萄酒 氧化、風(fēng)味失調(diào)或口感缺失，反而甚至可能改善葡萄酒的風(fēng)味分布。
【具體實施方式】
[0020] 本發(fā)明的一個方面涉及一種用于產(chǎn)生具有減少酒精含量的飲料的方法，所述方法 包括以下步驟：
[0021] a)使用至少一種同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株接種和發(fā)酵果汁;和
[0022] b)在添加所述至少一種同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株的同時或者之后一 段時間之內(nèi)，使用至少一種酵母菌株發(fā)酵所述果汁以獲得與單獨用酵母菌株發(fā)酵的飲料相 比具有減少酒精含量的飲料。
[0023] 在一個優(yōu)選實施方案中，步驟b)中用酵母菌株發(fā)酵所述果汁在添加所述至少一種 同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株之后至少12小時，諸如24小時，諸如36小時，諸如48小 時，諸如60小時實施。
[0024] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，步驟b)中用酵母菌株發(fā)酵所述果汁在72小時之內(nèi)， 諸如在60小時之內(nèi)，諸如在48小時之內(nèi)，諸如在24小時之內(nèi)，諸如在12小時之內(nèi)實施。
[0025] 本發(fā)明的另一個方面涉及一種可以通過根據(jù)前述方面的方法獲得的飲料。
[0026] 在另一個方面，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)具有減少酒精含量的飲料的方法，所述 方法包括以下步驟：
[0027] a)使用同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株接種和發(fā)酵果汁;和
[0028] b)同時或在足以將至少一部分糖轉(zhuǎn)化為乳酸或其他代謝物的一段時間之后，使用 酵母菌株發(fā)酵果汁，以獲得與單獨用酵母菌株發(fā)酵的飲料相比具有減少酒精含量的飲料。
[0029] 如本文所用的術(shù)語飲料中"減少酒精含量"涉及與在相同條件下但不添加同型發(fā) 酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株制備的飲料相比飲料中的酒精濃度較低。
[0030] 如本文所用的術(shù)語"汁"表示從葡萄或其他水果中榨出的未發(fā)酵或發(fā)酵果汁。
[0031] 如本文所用，術(shù)語"葡萄酒"是指其中通過酒精發(fā)酵產(chǎn)生的酒精量是至少4% (v/v) 的汁，包括但不限于發(fā)酵的葡萄汁(紅葡萄酒、白葡萄酒、含汽葡萄酒等)和蘋果酒(基于來 自蘋果、梨、桃等的果汁的發(fā)酵果汁）。如果酒精發(fā)酵結(jié)束則該葡萄酒可能已經(jīng)達(dá)到其最大 酒精水平。酒精含量由與總體積相關(guān)的酒精體積表示。
[0032] 同型發(fā)酵乳酸菌發(fā)酵葡萄糖和/或果糖，以乳酸作為主要副產(chǎn)物。
[0033]異型發(fā)酵乳酸菌發(fā)酵葡萄糖和/或果糖，以乳酸、乙醇/乙酸和二氧化碳作為副產(chǎn) 物。兼性異型發(fā)酵乳酸菌僅在特定條件下或自特異底物才能產(chǎn)生二氧化碳和其他副產(chǎn)物。 [0034]同型發(fā)酵和兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株的菌組包括以下菌株：嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus)、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei)、副干酪乳桿菌 (Lactobacillus paracasei )、卷曲乳桿菌（Lactobaci 1 lus crispatus)、彎曲乳桿菌 (Lactobacillus curvatus)、德氏乳桿菌（Lactobaci 1 lus delbrueckii )、雞乳桿菌 (Lactobacillus gal 1 inarum)、加氏乳桿菌（Lactobaci 1 lus gasseri )、瑞士乳桿菌 (Lactobacillus helveticus)、詹氏乳桿菌（Lactobacillus jensenii)、約氏乳桿菌 (Lactobacillus johnsonii)、馬乳酒樣乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens)、戊糖 乳桿菌(Lactobacillus pentosus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳桿 菌（Lactobacillus rhamnosus)、清酒乳桿菌（Lactobaci 1 lus sake)、唾液乳桿菌 (Lactobacillus salivarius)、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)、腸膜狀明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、有害片球菌 (Pediococcus damnosus)、糊精片球菌（Pediococcus dextrinicus)、戊糖片球菌 (Pediococcus pentocaceus)、小片球菌（Pediococcus parvulus)和嗜熱鏈球菌 (Streptococcus thermophilus)〇
[0035] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在步驟a)中使用至少兩種或兩種以上同型發(fā)酵和兼性 異型發(fā)酵乳酸菌菌株，諸如2、3、4、5或5種以上同型發(fā)酵和兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株接種和 發(fā)酵所述果汁。
[0036] 在一個優(yōu)選實施方案中，所述同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌是同型發(fā)酵或兼性 異型發(fā)酵乳桿菌屬菌株。
[0037] 在一個優(yōu)選實施方案中，所述同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳桿菌屬菌株選自由植物 乳桿菌和副干酪乳桿菌菌株組成的組。
[0038] 在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，所述同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳桿菌屬菌株是 植物乳桿菌菌株。
[0039]優(yōu)選地，所述植物乳桿菌菌株選自由以保藏號DSM 27565保藏在德國微生物和細(xì) 胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)的植物乳桿菌菌株CHCC12399和其突變體菌株組成的組，其中所 述突變體菌株通過使用所述保藏菌株作為起始材料而獲得，并且其中所述突變體菌株在使 用酵母菌株發(fā)酵果汁之前或同時用于接種和發(fā)酵果汁時，與單獨使用酵母菌株發(fā)酵的飲料 相比減少飲料中的酒精含量。
[0040] 在本文語境中，術(shù)語"突變體菌株"應(yīng)該被理解為通過例如遺傳工程、放射和/或化 學(xué)處理、和/或選擇、適應(yīng)、篩選等技術(shù)手段衍生自本發(fā)明菌株的菌株。優(yōu)選所述突變體是功 能等價的突變體，例如與母菌株具有基本上相同或者改善的特性(例如，根據(jù)本發(fā)明的方法 在使用酵母菌株發(fā)酵果汁之前或同時用于接種和發(fā)酵果汁時，與單獨使用酵母菌株發(fā)酵的 飲料相比減少飲料中酒精含量的能力）的突變體。這樣的突變體是本發(fā)明的一部分。特別 地，術(shù)語"突變體菌株"是指通過對本發(fā)明的菌株進(jìn)行任何常規(guī)使用的誘變處理而獲得的菌 株，所述常規(guī)使用的誘變處理包括用化學(xué)誘變劑諸如甲基磺酸乙酯(EMS)或者N-甲基-N'- 硝基-N-亞硝基胍(NTG)處理、UV光處理，或者是指自發(fā)存在的突變體。一個突變體可能經(jīng)歷 了多種誘變處理(單一的處理應(yīng)該被理解為一個誘變步驟緊接著一個篩選/選擇步驟），但 是目前優(yōu)選實施不超過20、不超過10或不超過5種處理。在一個目前優(yōu)選的突變體中，細(xì)菌 基因組中低于1 %，或低于0.1%，低于0.01%，低于0.001 %或者甚至低于0.0001 %的核苷 酸與母菌株相比已經(jīng)被改變(諸如通過取代、插入、缺失或其組合）。
[0041] 下文的實施例中顯示，當(dāng)細(xì)菌以相對低濃度接種時，步驟a)中接種的細(xì)菌的量決 定了足以將至少一部分糖轉(zhuǎn)化為乳酸的時間段。此外，顯示了當(dāng)細(xì)菌以相對高濃度接種時， 有可能將細(xì)菌和酵母共同接種并且仍然能減少飲料中的酒精含量。
[0042] 因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株以至 少1 X 104CFU/ml，諸如至少5 X 104CFU/ml、諸如至少1 X 105CFU/ml、諸如至少5 X 105CFU/ml、 諸如至少1 X l〇6CFU/ml、諸如至少5 X 106CFU/ml、諸如至少1 X 107CFU/ml的量接種，并且在 用酵母菌株發(fā)酵之前將所述果汁發(fā)酵足以將至少一部分糖轉(zhuǎn)化為乳酸或其他代謝物的一 段時間。
[0043] 優(yōu)選地，足以將至少一部分糖轉(zhuǎn)化為乳酸或其他代謝物的一段時間是至少12小 時、諸如至少24小時、諸如至少36小時、諸如至少48小時、諸如至少52小時、諸如至少60小 時、諸如至少72小時。
[0044] 在一個更優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)化為乳酸或其他代謝物的所述一部分糖是至少 5g/L、諸如至少10g/L、諸如至少15g/L、諸如至少20g/L。
[0045] 在另一個優(yōu)選實施方案中，所述同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株以至少1 X 104CFU/ml，諸如至少5 X 104CFU/ml、諸如至少 1 X 105CFU/ml、諸如至少5 X 105CFU/ml、諸如 至少 1 X 106CFU/ml、諸如至少5 X 106CFU/ml、諸如至少 1 X 107CFU/ml、諸如至少5 X 107CFU/ ml、諸如至少IX 108CFU/ml的量接種，并且用乳酸菌菌株和酵母菌株同時發(fā)酵所述果汁。
[0046] 在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株是植物 乳桿菌菌株。
[0047] 在一個優(yōu)選的實施方案中，用酵母菌株發(fā)酵所述果汁，所述酵母菌株以至少IX 105CFU/ml，諸如至少5 X 105CFU/ml的量在步驟b)中的酵母發(fā)酵開始時接種。
[0048]在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述果汁在步驟b)中用本地酵母（indigenous yeast)自然發(fā)酵。
[0049] 使用的酵母可以是用于飲料或食品工業(yè)中的任意類型的酵母。實例包括例如克魯 維畢赤酵母(Pichia kluyveri )、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母 (Saccharomyces pastorianus)、貝酵母（Saccharomyces bayanus)、德爾布有抱圓酵母 (Torulaspora delbruecki i)、或耐熱克魯維酵母（Kluyveromyces thermotolerans)等。
[0050] 用于葡萄酒生產(chǎn)中的典型酵母來自酵母科(子囊菌類酵母）。通常使用來自酵母屬 的酵母(例如釀酒酵母種類）。使用的其他酵母來自同樣的酵母科，但來自其他屬諸如克魯 維酵母屬(例如耐熱克魯維酵母種類)和有孢圓酵母屬(例如德爾布有孢圓酵母種類）。
[0051] 對于果汁的接種，可以使用純酵母培養(yǎng)物（即僅含有一種酵母類型的培養(yǎng)物），但 也可以使用兩種或兩種以上酵母類型的混合培養(yǎng)物作為接種菌。
[0052]在一個優(yōu)選實施方案中，在步驟b)中用至少兩種或兩種以上酵母菌株，諸如2、3、 4、5或5種以上酵母菌株接種和發(fā)酵所述果汁。
[0053]根據(jù)本發(fā)明的方法使得飲料的酒精濃度顯著減少：
[0054] 本文中的實施例1顯示酒精濃度從9.5%(￥八）、9.0%(￥八）和10.2%(￥八)減少 1 % (v/v)以上。
[0055] 本文中的實施例2顯示酒精濃度從10.2 % (v/v)減少1 % (v/v)以上。
[0056] 本文中的實施例3顯示酒精濃度從10.05% (v/v)減少0.95%、0.55%和1.4%。 [0057] 本文中的實施例4顯示酒精濃度從14.14% (v/v)和13.25% (v/v)分別減少1.1 % (v/v^Ρ0·9%(v/v)。
[0058] 本文中的實施例5顯示酒精濃度從8.45% (v/v)減少0.6% (v/v)。
[0059] 因此，在一個優(yōu)選實施方案中，所述飲料的酒精濃度比在同等條件下但不添加同 型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株所制備的飲料的酒精濃度低至少0.5% (v/v)，諸如至少 0.75% (v/v)、諸如至少1% (v/v)、諸如至少1.25% (v/v)、諸如至少1.5% (v/v)、諸如至少 1.75% (v/v)、諸如至少2% (v/v)、諸如至少2.5% (v/v)、諸如至少3% (v/v)。
[0060] 本發(fā)明的另一方面涉及一種通過根據(jù)前述方面的方法所獲得的飲料。
[0061] 此外，本發(fā)明的一個方面涉及一種植物乳桿菌菌株，其選自由以保藏號DSM 27565 保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)的植物乳桿菌菌株CHCC12399和其突變體 菌株組成的組，其中所述突變體菌株通過使用所述保藏菌株作為起始材料而獲得，并且其 中所述突變體菌株在使用酵母菌株發(fā)酵果汁之前或同時用于接種和發(fā)酵果汁時，與單獨使 用酵母菌株發(fā)酵的飲料相比減少飲料中的酒精含量。
[0062] 另一個方面涉及同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株的用途，其用于減少飲料中 的酒精含量。
[0063] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株是同型發(fā)酵 或兼性異型發(fā)酵乳桿菌屬菌株。
[0064] 優(yōu)選地，所述同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳桿菌屬菌株選自由植物乳桿菌菌株和副 干酪乳桿菌菌株組成的組。
[0065]在一個優(yōu)選的實施方案中，所述植物乳桿菌菌株選自由以保藏號DSM 27565保藏 在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)的植物乳桿菌菌株CHCC12399和其突變體菌株 組成的組，其中所述突變體菌株通過使用所述保藏菌株作為起始材料而獲得，并且其中所 述突變體菌株在使用酵母菌株發(fā)酵果汁之前或同時用于接種和發(fā)酵果汁時，與單獨使用酵 母菌株發(fā)酵的飲料相比減少飲料中的酒精含量。
[0066] 本發(fā)明的另一個方面涉及一種試劑盒，其包括同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌 株和酵母菌株。
[0067] 在一個優(yōu)選實施方案中，所述同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌是同型發(fā)酵或兼性 異型發(fā)酵乳桿菌屬。
[0068] 在一個優(yōu)選實施方案中，所述同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳桿菌屬菌株選自由植物 乳桿菌菌株和副干酪乳桿菌菌株組成的組。
[0069]優(yōu)選地，所述植物乳桿菌菌株選自由以保藏號DSM 27565保藏在德國微生物和細(xì) 胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)的植物乳桿菌菌株CHCC12399和其突變體菌株組成的組，其中所 述突變體菌株通過使用所述保藏菌株作為起始材料而獲得，并且其中所述突變體菌株在使 用酵母菌株發(fā)酵果汁之前或同時用于接種和發(fā)酵果汁時，與單獨使用酵母菌株發(fā)酵的飲料 相比減少飲料中的酒精含量。
[0070] 在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括關(guān)于如何使用試劑盒生產(chǎn)具 有減少酒精含量的飲料的說明書。
[0071] 本文所用的術(shù)語"乳酸菌"表示革蘭氏陽性的微需氧或厭氧細(xì)菌，其發(fā)酵糖并產(chǎn)生 酸，包括乳酸(作為主要產(chǎn)生的酸）、乙酸和丙酸。工業(yè)上最有用的乳酸菌在"乳桿菌目"內(nèi)發(fā) 現(xiàn)，其包括乳球菌屬（Lactococcus spp.)、鏈球菌屬（Streptococcus spp.)、乳桿菌屬 (Lactobacillus spp·)、明串珠菌屬（Leuconostoc spp.)、片球菌屬（Pediococcus spp·)、 短桿菌屬（Brevibacterium spp·)、腸球菌屬（Enterococcus spp·)、丙酸桿菌屬 (Propionibacterium spp.)和酒球菌屬（Oenococcus spp.)〇
[0072]除非本文中另外指出或從上下文能夠清楚地推出與之相反，否則在描述本發(fā)明時 (特別是在以下權(quán)利要求書的上下文中）使用的術(shù)語"一個"和"所述"以及類似用詞應(yīng)理解 為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)兩種形式。因此，"一個"和"所述"可以表示至少一個或者一個或一個以 上。
[0073]除非另外指出，否則術(shù)語"包括"、"具有"、"包含"和"含有"應(yīng)理解為是開放式術(shù)語 (也就是指"包括，但不限于"）。除非本文中另外指出，否則本文中引用的數(shù)值范圍僅僅用作 分別參照落入此范圍內(nèi)的每個獨立值的簡略方法，并且每個獨立值均并入本說明書中，如 同它們單獨列舉在本文中一般。除非本文中另外指出或從下文能夠清楚地推出與之相反， 否則本文描述的所有方法可按照任何合適的順序進(jìn)行。除非另外要求，否則本文中使用的 任何以及所有實例或本文中提供的示例性語言（例如"諸如"）僅僅用來更好地說明本發(fā)明 而不對本發(fā)明的范圍造成限制。說明書中的任何語言均不應(yīng)理解為指示實施本發(fā)明所必要 的任何未要求的技術(shù)特征。
[0074]除非本文中另外指出或從上下文能夠清楚地推出與之相反，否則上述技術(shù)特征、 方面和實施方案在其所有可能的變化中的任意組合也涵蓋在本發(fā)明中。
【附圖說明】
[0075]圖1顯示在雷司令(Riesling)果汁中與釀酒酵母葡萄酒酵母一起的植物乳桿菌菌 株CHCC12399不同接種劑量的蘋果酸乳酸活性。顯示僅用釀酒酵母葡萄酒酵母的發(fā)酵作為 對照。
[0076]圖2描繪用植物乳桿菌菌株CHCC12399的不同接種方案生產(chǎn)的雷司令葡萄酒中的 酒精終水平。植物乳桿菌接種24小時之后添加釀酒酵母葡萄酒酵母。顯示僅用釀酒酵母葡 萄酒酵母的發(fā)酵作為對照。
[0077]圖3顯示在雷司令果汁中與釀酒酵母葡萄酒酵母共同接種的植物乳桿菌菌株 CHCC12399的蘋果酸乳酸活性。顯示僅用釀酒酵母葡萄酒酵母的發(fā)酵作為對照。
[0078]圖4描繪使用植物乳桿菌菌株CHCC12399與釀酒酵母葡萄酒酵母共同接種的雷司 令果汁的發(fā)酵過程中酒精的產(chǎn)生。顯示僅用釀酒酵母葡萄酒酵母的發(fā)酵作為對照。
[0079]圖5顯示最終的霞多麗葡萄酒的風(fēng)味分析。對于對照霞多麗葡萄酒(僅酵母屬葡萄 酒酵母;霞多麗對照)和添加了植物乳桿菌菌株CHCC12399的霞多麗葡萄酒(霞多麗L. pi)兩 種葡萄酒都顯示了 11種風(fēng)味化合物的最終水平。
[0080]圖6描繪最終的墨爾樂(Merlot)葡萄酒的風(fēng)味分析。對于對照墨爾樂葡萄酒(僅酵 母屬葡萄酒酵母;墨爾樂對照)和添加了植物乳桿菌菌株CHCC12399的墨爾樂(墨爾樂L. pi) 兩種葡萄酒都顯示了 11種風(fēng)味化合物的最終水平。
[0081] 圖7顯示最終的霞多麗葡萄酒的感官分析。霞多麗154測試是添加了植物乳桿菌菌 株CHCC12399的霞多麗葡萄酒，且霞多麗157對照是對照葡萄酒(僅酵母屬葡萄酒酵母）。
[0082] 圖8描繪最終的霞多麗葡萄酒的感官描述分析。霞多麗154測試是添加了植物乳桿 菌菌株CHCC12399的霞多麗葡萄酒，且霞多麗157對照是對照葡萄酒（僅酵母屬葡萄酒酵 母)。
[0083] 圖9顯示在用植物乳桿菌菌株CHCC12399(NoVA)和不同時間點添加的Merit葡萄酒 酵母發(fā)酵匈牙利白葡萄汁的過程中的乳桿菌細(xì)胞計數(shù)。
[0084] 圖10描繪在用植物乳桿菌菌株CHCC12399(NoVA)和不同時間點添加的Merit葡萄 酒酵母發(fā)酵匈牙利白葡萄汁的過程中的酵母細(xì)胞計數(shù)。
[0085] 圖11顯示在用植物乳桿菌菌株CHCC12399(NoVA)和不同時間點添加的Merit葡萄 酒酵母發(fā)酵匈牙利白葡萄汁的過程中的葡萄糖濃度。
[0086] 圖12描繪在用植物乳桿菌菌株CHCC12399(NoVA)和不同時間點添加的Merit葡萄 酒酵母發(fā)酵匈牙利白葡萄汁的過程中的果糖濃度。
[0087] 圖13顯示在用植物乳桿菌菌株CHCC12399(NoVA)和不同時間點添加的Merit葡萄 酒酵母發(fā)酵匈牙利白葡萄汁的過程中的葡萄糖和果糖濃度。
[0088] 圖14描繪在用植物乳桿菌菌株CHCC12399(NoVA)和不同時間點添加的Merit葡萄 酒酵母發(fā)酵匈牙利白葡萄汁的過程中的蘋果酸濃度。
[0089] 圖15顯示在用植物乳桿菌菌株CHCC12399(NoVA)和不同時間點添加的Merit葡萄 酒酵母發(fā)酵匈牙利白葡萄汁的過程中的乳酸濃度。
[0090] 圖16顯示在用植物乳桿菌菌株CHCC12399(NoVA)和不同時間點添加的Merit葡萄 酒酵母發(fā)酵匈牙利白葡萄汁的過程中的乙醇產(chǎn)量。
[0091] 實施例
[0092] 材料和方法
[0093] 發(fā)酵設(shè)置
[0094]實驗室規(guī)模的發(fā)酵試驗在200mL葡萄汁中進(jìn)行。使用四種不同的葡萄汁:意大利白 葡萄汁、意大利紅葡萄汁、雷司令葡萄汁和匈牙利白葡萄汁。所有的發(fā)酵都在20°C進(jìn)行直至 完成(糖含量<l〇g/L)。以從5 X 106至5 X 107CFU/ml范圍內(nèi)的不同通接種水平接種從南非葡 萄汁中分離的植物乳桿菌菌株CHCC12399、另一種植物乳桿菌菌株、或副干酪乳桿菌菌株。 釀酒酵母葡萄酒酵母以1 X l〇6CFU/ml接種。
[0095] 頂空GC-FID分析
[0096] 使用頂空氣相色譜法與火焰電離檢測聯(lián)用(GC-FID)來測量發(fā)酵產(chǎn)物中的酯和高 級醇。將發(fā)酵樣品離心，然后將2ml收集到小瓶中。然后使用具有頂空取樣器的經(jīng)校準(zhǔn) Perkin Elmer GC系統(tǒng)對樣品進(jìn)行分析。該GC配置有DB-WAXETR柱(長度，30m;內(nèi)徑，0.25mm; 層厚度，〇 · 5μηι;德國的安捷倫科技公司(Agilent Technologies，Germany))。使用分流-非 分流進(jìn)樣器并保持在180 °C。將樣品在注射前(針的溫度：110°C )在頂空自動取樣器中在70 °C加熱30分鐘。使用氦氣作為載氣。60°C下開始后，2分鐘后將烘箱溫度以45°C/分鐘從60°C 升高到230°C并且最終在230°C保持5分鐘。在GC程序期間，維持載氣(He)的恒定流速（10毫 升/分鐘）。分別將FID溫度在220°C下保持恒定。使用Turbochrom軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。 [0097] 感官分析
[0098]由專業(yè)品嘗小組實施感官分析。 _9] 最終葡萄酒參數(shù)分析
[0100]使用Oenof〇ss?設(shè)備，根據(jù)制造商的流程實施乙醇、總糖（葡萄糖+果糖）、總酸 (TA)、揮發(fā)性酸(VA)、pH和蘋果酸分析。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和由例如Castellari等 (2000. An improved HPLC method for the analysis of organic acids, carbohydrates,and alcohols in grape must and wines. Journal of Liquid Chromatography&Related Technologies 23( 13);第2047-2056頁）所描述的方法使用HPLC 測量乳酸、葡萄糖、果糖和乙酸濃度。
[0101] 結(jié)果
[0102] 實施例1:使用植物乳桿菌菌株CHCC12399和釀酒酵母葡萄酒酵母菌株反接種葡萄 汁。
[0103] 第一實驗使用從低于pH 3.5的葡萄汁中分離的植物乳桿菌菌株CHCC12399實施。 使用植物乳桿菌菌株的實驗室試驗在意大利紅葡萄汁和意大利白葡萄汁兩者中實施。此處 使用的植物乳桿菌菌株是冷凍形式的產(chǎn)品(冷凍的沉淀）。
[0104] 在與葡萄酒釀酒酵母的反接種中以若干劑量(從5 X 106至5 X 107CFU/ml范圍內(nèi)）接 種植物乳桿菌，所述葡萄酒釀酒酵母以1 X l〇6CFU/ml水平在72小時之后接種。發(fā)酵體積是 200ml。葡萄汁的初始參數(shù)描述于表2中。
[0105] 表2.紅葡萄汁和白葡萄汁的初始參數(shù)
[0106]
[0107] *Glu/Fru =葡萄糖和果糖的總和
[0108] #TA =總酸度
[0109] 林*VA =揮發(fā)性酸度
[0110]對于每種葡萄汁總計測試了 4種條件：
[0111] -對照:僅添加釀酒酵母
[0112] -5 X 106CFU/ml植物乳桿菌CHCC12399+72h之后的釀酒酵母
[0113] -1 X 107CFU/ml植物乳桿菌CHCC12399+72h之后的釀酒酵母
[0114] -5 X 107CFU/ml植物乳桿菌CHCC12399+72h之后的釀酒酵母
[0115] 當(dāng)發(fā)酵完成時（當(dāng)糖耗盡），測量酒精水平和其他葡萄酒相關(guān)參數(shù)(表3和表4)。
[0116]表3.紅葡萄酒中的最終葡萄酒參數(shù)
[0118] 表4.白葡萄酒中的最終葡萄酒參數(shù)
[0119]
[0120] 從表3和表4中可以清楚看出，與對照葡萄酒相比，用每毫升5 X107CFU的植物乳桿 菌接種的葡萄酒的酒精減少% (v/V)，而且這種情況在紅葡萄酒和白葡萄酒中都存在。 有意思的是，植物乳桿菌的劑量似乎對于達(dá)到較低的酒精百分比極其重要，因為接種IX 107CFU/ml對于酒精水平不產(chǎn)生顯著影響。從表4中也可以看出，添加植物乳桿菌對于乳酸 產(chǎn)生不具有消極影響，因為在對照和所有劑量的植物乳桿菌之間濃度是類似的。然而，相信 較低的植物乳桿菌劑量也將減少酒精，這取決于后來接種酵母的時間。植物乳桿菌單獨發(fā) 酵的時間越長，則轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗峄蚱渌x物的糖就越多。也可清楚看出在添加植物乳桿菌 時沒有產(chǎn)生更多的乙酸。
[0121] 由于從蘋果酸產(chǎn)生了比理論上可能產(chǎn)生的更多的乳酸，一部分葡萄糖和果糖被轉(zhuǎn) 化為乳酸，剩下較少的糖被轉(zhuǎn)化為乙醇(表5)。如表5中可見，植物乳桿菌在第一個24小時內(nèi) 已經(jīng)消耗16g/L以上的糖(葡萄糖和果糖）。這是非常令人驚訝的，因為預(yù)期在這些條件下將 僅消耗蘋果酸。1 %的乙醇(v/v)對應(yīng)于16g/L被植物乳桿菌消耗的糖。如果所有的糖都被轉(zhuǎn) 化為乳酸，那么應(yīng)該形成至少16g/L乳酸。由于情況并非如此，因此要么從葡萄糖形成了其 他代謝產(chǎn)物，要么乳酸與存在于發(fā)酵過程中的其他代謝產(chǎn)物反應(yīng)以形成另外一組代謝產(chǎn) 物。
[0122]表5.接種植物乳桿菌之后24小時，添加葡萄酒酵母之前測量糖
[0124] *Glu/Fru =葡萄糖和果糖的總和
[0125] 為了確認(rèn)需要5X107CFU/ml的植物乳桿菌以將葡萄酒中的最終酒精百分比減少 1% (v/v)，實施了另一組實驗。在這一實驗中，測試了介于1 X l〇7CFU/ml植物乳桿菌和5X 107CFU/ml植物乳桿菌之間的接種水平對于乙醇產(chǎn)生的影響。由于72小時之后添加葡萄酒 酵母在商業(yè)上不可行，因而在24小時之后添加葡萄酒酵母。在這一情況下，將雷司令果汁用 于發(fā)酵實驗。雷司令果汁的初始參數(shù)列于表6中。
[0126] 表6.雷司令葡萄汁的初始參數(shù)
[0127]
[0128] *Glu/Fru =葡萄糖和果糖的總和
[0129] #ΤΑ =總酸度
[0130] 林*VA =揮發(fā)性酸度
[0131 ]以6種不同的接種劑量在雷司令葡萄汁中添加植物乳桿菌：2 X 107CFU/ml、2.5 X 107CFU/ml、3 X 107CFU/ml、3 · 5 X 107CFU/ml、4 X 107CFU/ml和5 X 107CFU/ml。24小時之后，將 葡萄酒釀酒酵母菌株（IX l〇6CFU/ml)添加到葡萄汁中以完成發(fā)酵。發(fā)酵體積為200ml且發(fā) 酵溫度為20 °C。最終葡萄酒參數(shù)顯示于表6中。蘋果酸乳酸發(fā)酵(MLF)的表現(xiàn)和最終乙醇水 平描繪于圖1和圖2中。
[0132]表7.雷司令葡萄酒中的最終葡萄酒參數(shù)。
[0134] *Glu/Fru =葡萄糖和果糖的總和
[0135] #TA =總酸度
[0136] 林*VA =揮發(fā)性酸度
[0137] 表7和圖2中的結(jié)果清楚地顯示需要5 X107CFU/ml植物乳桿菌以將乙醇百分比減 少1 % (v/v)。然而，從3.5 X 107CFU/ml的接種水平開始，最終葡萄酒中的乙醇水平就減少 了。除此之外，圖1顯示通過以所有劑量接種植物乳桿菌發(fā)酵的最初三天期間發(fā)生了MLF。
[0138] 實施例2:使用植物乳桿菌菌株CHCC12399和釀酒酵母葡萄酒酵母菌株共同接種葡 萄汁。
[0139] 由于在所謂的共同接種中較容易一起添加植物乳桿菌和酵母二者，因而測試了通 過將植物乳桿菌和酵母屬葡萄酒酵母共同接種能否降低最終葡萄酒中的乙醇百分比。這 樣，葡萄酒釀造商能夠在葡萄酒發(fā)酵開始時就都添加植物乳桿菌和葡萄酒酵母二者，其使 得該新技術(shù)更易于以商業(yè)方式使用。
[0140] 對于這一實驗，使用如表5中所描述的同樣的雷司令果汁。將植物乳桿菌以5 X 107CFU/ml的接種劑量，與釀酒酵母葡萄酒酵母(lX106CFU/ml) -起添加。在20°C進(jìn)行發(fā)酵。 蘋果酸乳酸發(fā)酵(MLF)活性和乙醇生產(chǎn)顯示于圖3和圖4中。
[0141] 圖3和圖4清楚地顯示，將植物乳桿菌與釀酒酵母葡萄酒酵母共同接種導(dǎo)致最終酒 精減少1 % (v/V)。在使用共同接種時蘋果酸也能夠完全降解。這意味著在酒精發(fā)酵過程中， 將植物乳桿菌與釀酒酵母以合適的劑量一起共同接種導(dǎo)致最終酒精減少1 % (v/v)，同時 MLF完成。
[0142] 實施例3:分別使用植物乳桿菌菌株CHCC12399、植物乳桿菌菌株LPL-1或副干酪乳 桿菌菌株LPA-1與釀酒酵母葡萄酒酵母菌株反接種葡萄汁。
[0143] 為了調(diào)查降低酒精含量的這一特性是否是菌株特異的和/或物種特異的，測試了 植物乳桿菌的另一個菌株LPL-1和副干酪乳桿菌菌株LPA-1減少酒精的情況(參見表8)。使 用與之前相同的流程，其中釀酒酵母葡萄酒酵母在24小時之后添加。以5 X107CFU/ml的比 例接種乳桿菌菌株，并且以1 X l〇6CFU/ml的比例添加酵母。
[0144] 表8.使用3種不同的乳桿菌菌株和對照發(fā)酵的雷司令葡萄酒中的最終葡萄酒參數(shù)
[0146] *Glu/Fru =葡萄糖和果糖的總和
[0147] #ΤΑ =總酸度
[0148] 林*VA =揮發(fā)性酸度
[0149] 從表8中可以非常清楚地看出，所有測試的乳桿菌屬都能減少酒精至少0.5%。然 而，似乎只有植物乳桿菌具有減少酒精和徹底降解蘋果酸的組合特性。
[0150]實施例4:使用植物乳桿菌菌株CHCC12399和釀酒酵母葡萄酒酵母菌株反接種-- 現(xiàn)場試驗。
[0151] 在這些實驗中，測試了其是否在現(xiàn)場也有效。在葡萄酒制造廠中設(shè)置兩個試驗，其 中在兩種不同的葡萄品種中測試了葡萄酒植物乳桿菌菌株CHCC12399:白葡萄品種霞多麗 和紅葡萄品種墨爾樂。在現(xiàn)場試驗中，也測試了由乳桿菌屬引起的酒精減少如何影響最終 葡萄酒的風(fēng)味分布，因為這是將非酵母屬酵母或充氣用于減少酒精的主要負(fù)面問題。
[0152] 在所有情況下，在發(fā)酵開始時以5 X 106CFU/ml劑量將植物乳桿菌添加到葡萄上或 者添加到葡萄汁中，并且在24小時之后添加酵母。霞多麗試驗在450hL發(fā)酵罐中進(jìn)行，并且 墨爾樂試驗在200hL發(fā)酵罐中實施。在所有情況下，初始糖含量幾乎相同并且存在通過僅添 加酵母屬葡萄酒酵母而進(jìn)行的對照發(fā)酵。結(jié)果顯示于表9中。
[0153] 表9.在使用和不使用葡萄酒植物乳桿菌菌株發(fā)酵的葡萄酒試驗中的最終葡萄酒 參數(shù)。24小時之后添加葡萄酒酵母。對照發(fā)酵是僅使用酵母屬葡萄酒酵母的發(fā)酵。
[0155] *Glu/Fru =葡萄糖和果糖的總和
[0156] **ΤΑ =總酸度
[0157] 林*VA =揮發(fā)性酸度
[0158] 表9中的結(jié)果顯示，在所有現(xiàn)場試驗中，葡萄酒植物乳桿菌都能以至少0.8% (v/v) 降低最終酒精百分比，并且這具有非常低的接種比例（5X106CFU/ml)。這意味著所提出的 使用乳桿菌菌株以減少酒精至少0.5%的技術(shù)在大規(guī)模下也有效。
[0159] 分析來自表9的葡萄酒的風(fēng)味分布。此外，由專業(yè)的感官評價小組分析霞多麗葡萄 酒，以調(diào)查最終的葡萄酒與對照葡萄酒相比在風(fēng)味分布方面是否可以接受。該感官評價小 組由10人組成，他們針對每個特征對葡萄酒評分1至5分。
[0160] 使用頂空-GC-FID實施的風(fēng)味分析結(jié)果顯示于圖5和圖6中。感官分析結(jié)果顯示于 圖7和圖8中。
[0161] 從圖5和圖6中可以看出，霞多麗對照的風(fēng)味分布與用植物乳桿菌接種的霞多麗相 比看起來非常類似。特別是乙酸乙酯在兩種葡萄酒中非常類似并且甚至在添加植物乳桿菌 的霞多麗中會稍微少一些，而乙酸乙酯是添加非酵母屬菌株時的主要問題組分。墨爾樂葡 萄酒也是一樣的，并且在本文中風(fēng)味分布看起來也非常類似。
[0162] 從感官分析可以非常清楚地看到，與對照葡萄酒相比，添加植物乳桿菌的霞多麗 葡萄酒肯定沒有缺陷。如圖7中所示，測試葡萄酒更灼熱，但與對照葡萄酒相比在測試葡萄 酒中總的芳香濃郁度和復(fù)雜度更優(yōu)選。這在描述性分析中已經(jīng)確認(rèn)，其中添加植物乳桿菌 的霞多麗葡萄酒與對照葡萄酒相比更具有果味特性(葡萄柚、菠蘿、芒果）。
[0163] 實施例5:在匈牙利白葡萄汁中在使用植物乳桿菌菌株CHCC12399接種和使用墨爾 樂葡萄酒酵母接種之間進(jìn)行不同時間段的反接種。
[0164] 為了調(diào)查植物乳桿菌菌株CHCC12399在葡萄酒發(fā)酵開始時通過將葡萄糖和/或果 糖還原為乳酸而減少酒精的潛力，在具有下述特征(表10)的匈牙利白葡萄汁中實施實驗。
[0165] 表10.匈牙利白葡萄汁參數(shù)：
[0167] 發(fā)酵設(shè)置描述于表11中。本文也顯示使用了6種不同的設(shè)置:在發(fā)酵開始時添加植 物乳桿菌菌株CHCC12399(N〇VA)，并在之后的不同時間點添加酵母。作為對照發(fā)酵，僅接種 酵母(實驗11和12)。使用的酵母是以1 X 106CFU/ml濃度接種的墨樂爾酵母。在20°C實施發(fā) 酵。
[0168] 表11.發(fā)酵設(shè)置
[0170]發(fā)酵進(jìn)行到糖耗盡。在發(fā)酵期間，采集樣品對糖和酸進(jìn)行Oenofoss測量以及HPLC 測量。
[0171] 通過將乳桿菌厭氧接種在含有那他霉素(natamyxin)(0.075g/L;來自DSM Food Specialities B.V.的Delvocide)的葡萄汁瓊脂(GJ5;77.5g/L葡萄汁濃縮物(K V Saft VW1:0)，22.4g/L酵母提取物（Bio Springer)，0.6g/L_T你.(6(6:.11.(1)80(Sigma-Aldrich)，0· lg/ L MnS04，H20(Merck)，15g/L瓊脂（S0-BI-GEL)溶于自來水中）上而分析乳桿菌的生活力。將 平板在30°C孵育3天然后計數(shù)。
[0172] 通過在標(biāo)準(zhǔn)YGC(酵母提取物、葡萄糖、氯霉素)瓊脂平板上接種而分析酵母的生活 力。將平板在30°C孵育2天然后計數(shù)。
[0173] 顯示的結(jié)果不包含實驗編號9和10,因為在這些樣品中開始了酵母天然發(fā)酵，因此 認(rèn)為他們是不準(zhǔn)確的。在實驗編號7和8中也開始了天然發(fā)酵，但是其在添加植物乳桿菌菌 株CHCC12399(N〇Va)之后72小時接種Merit酵母時結(jié)束。乳桿菌和酵母細(xì)胞計數(shù)分別呈現(xiàn)于 圖9和圖10中。糖和酸的測量結(jié)果顯示于圖11-15中。
[0174] 從圖9和圖10顯示的結(jié)果可以清楚地看出，植物乳桿菌在除使用共同接種的實驗 以外的所有實驗中均生長，在使用共同接種的實驗中細(xì)胞計數(shù)不隨時間改變。這能夠由酵 母計數(shù)在第一天就已經(jīng)非常高的事實來解釋，這意味著植物乳桿菌菌株CHCC12399沒有時 間生長。雖然蘋果酸在第2天之后被完全消耗，但植物乳桿菌菌株CHCC12399(N〇Va)仍具有 活力（圖14)。
[0175] 發(fā)酵期間的乙醇濃度顯示于圖16中并且最終的乙醇濃度顯示于表12中。
[0176] 表12.所有葡萄酒的最終乙醇濃度
[0178] 從表12中的最終乙醇濃度可以非常清楚看出，以5X107CFU/ml濃度添加植物乳桿 菌菌株CHCC12399(N〇VA)和在添加酵母之前2天或3天發(fā)酵能夠減少酒精水平。在這情況下， 3天之后接種酵母減少酒精最多，其中最終酒精減少為0.6%乙醇(v/v)。
[0179] 從圖11-14中也可以清楚看出，蘋果酸需要首先被消耗，在植物乳桿菌菌株 CHCC12399(N〇VA)開始消耗糖之前。對于所有不同的情況，蘋果酸在2天之內(nèi)被消耗。即使對 于植物乳桿菌菌株CHCC12399和酵母的共同接種，蘋果酸也在開始發(fā)酵之后的2天內(nèi)被消 耗。從蘋果酸和糖(果糖)兩者都產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致在后續(xù)添加酵母時乳酸產(chǎn)量較高。在僅添加 了酵母的對照發(fā)酵中幾乎沒有乳酸產(chǎn)生。
[0180] 從表13中單一糖的結(jié)果也可以清楚看出，植物乳桿菌菌株CHCC12399(N〇VA)優(yōu)選 果糖勝過葡萄糖。
[0181] 表13.N〇Va的糖消耗(以g/L計），在添加酵母之前測量
[0183]在添加酵母之前，植物乳桿菌菌株CHCC12399消耗果糖但不消耗葡萄糖，但在開始 酒精發(fā)酵期間也必須消耗更多果糖(和/或葡萄糖），以便減少酒精水平達(dá)0.6%。
[0184] 結(jié)論
[0185] 從這一實驗可以清楚看出，植物乳桿菌菌株CHCC12399能夠通過反接種減少最終 葡萄酒中的酒精。結(jié)果顯示蘋果酸首先被同化，在植物乳桿菌菌株CHCC12399開始同化糖之 前。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌菌株CHCC12399將果糖作為主要糖來消耗，并且在這種情況 下似乎不消耗葡萄糖。
[0186] 保藏和專業(yè)技術(shù)人員獲得方案
[0187] 植物乳桿菌CHCC12399菌株于2013年8月1日以保藏編號DSM27565保藏在德國微生 物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，德國布倫瑞克英豪豐大街78郵編0_38124(〇61^8(3116 331111111111^ von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Inhoffenstr·7B，D_38124Braunschweig， Germany)〇
[0188] 根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約（Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure)的條款規(guī)定進(jìn)行了保藏。
[0189]
【申請人】請求所保藏微生物的樣品應(yīng)當(dāng)僅供經(jīng)
【申請人】批準(zhǔn)的專業(yè)技術(shù)人員獲得。
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【主權(quán)項】
1. 一種用于生產(chǎn)酒精含量減少的飲料的方法，所述方法包括以下步驟： a) 用至少一種同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株接種和發(fā)酵果汁;和 b) 在添加所述至少一種同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株之后的一段時間內(nèi)，用至 少一種酵母菌株發(fā)酵所述果汁以獲得與單獨用所述至少一種酵母菌株發(fā)酵的飲料相比酒 精含量減少的飲料， 其中所述至少一種同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株以至少I X l〇4CFU/ml的量接 種，并且在用所述至少一種酵母菌株發(fā)酵之前發(fā)酵所述果汁至少12小時。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一種同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌 株選自由植物乳桿菌(LactobaciIlus plantarum)菌株和副干酪乳桿菌(LactobaciIlus paracasei)菌株構(gòu)成的組。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述至少一種植物乳桿菌菌株選自由以保藏號DSM 27565保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)的植物乳桿菌菌株CHCC12399及其 突變體菌株構(gòu)成的組，其中所述突變體菌株通過使用所述保藏菌株作為起始材料而獲得， 并且其中在使用至少一種酵母菌株發(fā)酵果汁之前或同時接種和發(fā)酵所述果汁時，與單獨使 用所述至少一種酵母菌株發(fā)酵的飲料相比，所述突變體菌株減少飲料中的酒精含量。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項權(quán)利要求所述的方法，其中在添加所述至少一種同型發(fā) 酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株之后72小時之內(nèi)用b)中的酵母菌株發(fā)酵所述果汁。5. -種可通過根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項權(quán)利要求所述的方法獲得的飲料。6. -種植物乳桿菌菌株，其選自由以保藏號DSM 27565保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng) 物保藏中心(DSMZ)的植物乳桿菌菌株CHCC12399及其突變體菌株構(gòu)成的組，其中所述突變 體菌株通過使用所述保藏菌株作為起始材料而獲得，并且其中在使用至少一種酵母菌株發(fā) 酵果汁之前或同時接種和發(fā)酵所述果汁時，與單獨使用所述至少一種酵母菌株發(fā)酵的飲料 相比，所述突變體菌株減少飲料中的酒精含量。7. 至少一種同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株在生產(chǎn)與單獨使用酵母發(fā)酵的飲料 相比酒精含量減少的酵母發(fā)酵飲料中的用途。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述至少一種同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌 株選自由植物乳桿菌菌株和副干酪乳桿菌菌株構(gòu)成的組。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中所述至少一種植物乳桿菌菌株選自由以保藏號DSM 27565保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)的植物乳桿菌菌株CHCC12399及其 突變體菌株構(gòu)成的組，其中所述突變體菌株通過使用所述保藏菌株作為起始材料而獲得， 并且其中在使用至少一種酵母菌株發(fā)酵果汁之前或同時接種和發(fā)酵所述果汁時，與單獨使 用所述至少一種酵母菌株發(fā)酵的飲料相比，所述突變體菌株減少飲料中的酒精含量。10. -種試劑盒，其包括至少一種同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸菌菌株、至少一種酵母 菌株以及關(guān)于如何使用所述試劑盒生產(chǎn)具有酒精含量減少的飲料的說明書。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其中所述至少一種同型發(fā)酵或兼性異型發(fā)酵乳酸 菌菌株選自由植物乳桿菌菌株和副干酪乳桿菌菌株構(gòu)成的組。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中所述至少一種植物乳桿菌菌株選自由以保藏 號DSM 27565保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心（DSMZ)的植物乳桿菌菌株 CHCC12399及其突變體菌株構(gòu)成的組，其中所述突變體菌株通過使用所述保藏菌株作為起 始材料而獲得，并且其中在使用至少一種酵母菌株發(fā)酵果汁之前或同時接種和發(fā)酵所述果 汁時，與單獨使用所述至少一種酵母菌株發(fā)酵的飲料相比，所述突變體菌株減少飲料中的 酒精含量。
【文檔編號】C12R1/25GK105960450SQ201580005268
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2015年1月21日
【發(fā)明人】S·薩倫, N·愛德華, K·I·索爾恩森, 曼蘇爾·巴達(dá)奇, J·H·斯維格斯
【申請人】科.漢森有限公司