一種宮頸癌細胞檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于硼摻雜石墨烯量子點的宮頸癌細胞檢測試劑盒，屬于生物檢測領域。所述宮頸癌細胞檢測試劑盒包括試劑A、B和C，試劑A為硼摻雜石墨烯量子點溶液，試劑B為硝酸鈰溶液，試劑C為腺苷三磷酸溶液。所述試劑盒選擇堿性磷酸酶作為檢測的靶向目標，采用硼摻雜石墨烯量子點為熒光探針，通過量子點熒光分析方法實現(xiàn)了宮頸癌細胞表面堿性磷酸酶快速、高效的檢測，可以用在醫(yī)藥領域檢測宮頸癌細胞的及其濃度，具有易操作、檢測結果準確率高、靈敏度高、成本低廉等優(yōu)點。
【專利說明】
一種宮頸癌細胞檢測試劑盒
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，特別是涉及一種宮頸癌細胞檢測試劑盒，屬于生物檢測技術領域。
【背景技術】
[0002]宮頸癌是目前嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤疾病，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，全世界每年約有宮頸癌新發(fā)病例50萬，約有26萬婦女死于該病。85%的新發(fā)病例發(fā)生在發(fā)展中國家，其中我國每年宮頸癌新發(fā)病例約占全世界發(fā)病總數(shù)的1/3。因此，發(fā)展高效便捷、高靈敏的宮頸癌細胞檢測方法對于宮頸癌的早期診斷具有重要意義。
[0003]傳統(tǒng)的宮頸癌診斷方法包括宮頸碘試驗、陰道鏡檢查、宮頸攝影、子宮頸脫落細胞學檢查、HPV檢測、宮頸錐形切除術和宮頸管活體組織檢查等(佟麗等，宮頸癌的預防及早期診斷.Chinese and Foreign Medical Research(中外醫(yī)學研究)，2011,09(I)，112-113)。傳統(tǒng)檢查方法固然有其實用性，但也存在弊端，如操作復雜、檢測結果準確率低、需要大型儀器、檢測成本高。而光譜技術由于其具有靈敏度高的特點被廣泛用于疾病的檢測領域。其中，熒光光譜法具有信息量大、響應速度快、靈敏度高、操作簡單、成本低廉、光學抗干擾能力強等優(yōu)點，而備受人們關注。傳統(tǒng)的熒光發(fā)光試劑是染料分子，如異硫氰酸熒光素FITC(Xiuhan Yang，Xiaochuan Wang,Xiaomin Zhang.CapilIary zone electrophoresisseparat1n of low concentrat1n stimulants in human urine with laser-1nducedfluorescence detect1n.Analytica Chimica Acta，2005，549( 1-2) ,81-87.)、花菁染料Cy3、Cy5等，它們有著一些不可避免的缺點，例如:光化學穩(wěn)定性差，易發(fā)生光漂白與光降解，從而不利于較長時間的觀察。另外，傳統(tǒng)染料分子激發(fā)光譜窄，發(fā)射光譜寬，易受到復雜生命體系中生物大分子自發(fā)熒光的干擾。因此，設計并開發(fā)新的熒光檢測試劑成為目前人們研究的熱點。
[0004]隨著量子點研究的深入，量子點優(yōu)異的光學性能(如帶寬窄、量子產(chǎn)率高、熒光信號穩(wěn)定、熒光壽命長等)使其越來越多的應用于細胞及蛋白質成像的研究，而且取得了很好的成果。其中碳材料量子點因其具有優(yōu)異的光學性能、良好的生物相容性及發(fā)射波長易調(diào)控等特點，成為在細胞檢測中常用的熒光檢測材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種基于硼摻雜石墨烯量子點(B-GQDs)的宮頸癌細胞檢測試劑盒，可通過B-GQDs熒光信號的變化實現(xiàn)宮頸癌細胞及其濃度的快速、靈敏、高效檢測。
[0006]為了實現(xiàn)上述發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
[0007]—種宮頸癌細胞檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括試劑A、B和C，其中試劑A為硼摻雜石墨烯量子點(B-GQDs)溶液，試劑B為硝酸鈰溶液，試劑C為腺苷三磷酸(ATP)溶液。
[0008]本發(fā)明提出的基于硼摻雜石墨烯量子點的宮頸癌細胞檢測試劑盒，該試劑盒的檢測對象為宮頸癌細胞膜表面的堿性磷酸酶，這是一種廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織的一種酶，它的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系。例如，堿性磷酸酶在宮頸癌細胞中呈高水平表達，且其表達水平隨著宮頸癌病情的發(fā)生發(fā)展而呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，但在正常宮頸細胞表面則呈低表達。
【申請人】研究發(fā)現(xiàn)，Ce(NO3)3誘發(fā)B-GQDs的熒光信號淬滅，但將B-GQDs與Ce(NO3)3的混合體系與宮頸癌細胞作用，在ATP存在時B-GQDs的熒光信號恢復，且熒光信號恢復的程度與宮頸癌細胞的濃度呈正比，從而實現(xiàn)宮頸癌細胞的檢測。
[0009]因此，本發(fā)明選擇堿性磷酸酶作為宮頸癌細胞檢測的靶向目標，采用硼摻雜石墨烯量子點為熒光探針，通過構建硼摻雜石墨烯量子點-淬滅劑-腺苷三磷酸復合試劑，實現(xiàn)宮頸癌細胞的高靈敏檢測。與石墨烯量子點相比，硼摻雜石墨烯量子點(B-GQDs)具有更高的量子廣率，有利于檢測靈敏度的提尚。
[0010]本發(fā)明所述的試劑盒的檢測原理是:硼摻雜石墨烯量子點(B-GQDs)具有強的熒光信號，在鈰離子Ce3+存在時，由于Ce3+和B-GQDs量子點表面的羧基(-COOHMt用而導致熒光信號淬滅;在宮頸癌細胞體系中，加入腺苷三磷酸(ATP)刺激細胞表面的堿性磷酸酶水解釋放出磷酸根(P043—)，游離出的P043—取代-COOH與Ce3+離子結合從而導致B-GQDs的熒光恢復。根據(jù)B-GQDs熒光信號恢復檢測宮頸癌細胞，并可根據(jù)熒光強度實現(xiàn)宮頸癌細胞濃度的檢測。
[0011]所述的試劑A內(nèi)還包括三羥基氨基甲烷-鹽酸(TBS)緩沖液(優(yōu)選地，濃度為0.lmol/L,pH 7.4)。
[0012]所述的硼摻雜石墨烯量子點，其粒徑大小為3?8nm?？梢圆捎矛F(xiàn)有技術中已知的方法合成，如實施例采用恒電位計時電流法合成。有關硼摻雜石墨烯量子點的合成，可參見文南犬(Zetan Fan,Yunchao Li,Xiaohong Li,Louzhen Fan,Shixin Zhou,Decai Fang,andShihe Yang Surrounding media sensitive photoluminescence of boron-dopedgrapheme quantum dots for highly fluorescent dyed crystals，chemical sensingand b1imaging.Carron 2014,70,149-156.)0
[0013]優(yōu)選地，所述的檢測試劑盒中，所述的試劑A為B-GQDs分散在三羥基氨基甲烷-鹽酸(TBS)緩沖液中得到量子點溶液，濃度為15yg/mL，TBS緩沖液濃度為0.1moI/L，pH 7.4;所述試劑B中硝酸鈰的濃度為20mmol/L;試劑C中腺苷三磷酸濃度為20mmol/L。
[0014]采用所述的檢測試劑盒檢測宮頸癌細胞(HeLa)，檢測步驟具體如下:
[0015]1、配制試劑A:將硼摻雜的石墨烯量子點(B-GQDs)分散在TBS緩沖液中得到量子點溶液；
[0016]2、配制試劑B:將一定量Ce(NO3)3溶解在二次水中，制成溶液；
[0017]3、配制試劑C:將一定量ATP溶解在二次水中，制成溶液；
[0018]4、向試劑A中加入試劑B，記錄B-GQDs的熒光信號F0;
[0019]5、取試劑A、試劑B，混合均勻后加入試劑C制成混合試劑，將混合試劑與宮頸癌細胞HeLa(濃度1-1OVmL)在37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h;用TBS緩沖液洗去剩余的試劑后用胰酶消解HeLa細胞，記錄該體系的熒光信號Fi;
[0020]6、建立B-GQDs檢測HeLa細胞濃度的工作曲線:在步驟5中，改變HeLa細胞的濃度，記錄不同已知HeLa細胞濃度下的熒光響應信號通Fi;計算出響應信號的差值AF( AF = F1-Fo);將所述的AF與HeLa細胞的濃度繪制成AF-c工作曲線，建立了基于B-GQDs的熒光響應的HeLa細胞濃度檢測工作曲線；
[0021 ] 7、檢測待測樣品中HeLa的濃度:取待測的HeLa細胞，按照與步驟6)相同的方法與試劑盒中的試劑作用并檢測其熒光信號，根據(jù)熒光信號強度，由步驟6)中得到的標準曲線計算得到待測HeLa細胞的濃度。
[0022]上述HeLa細胞的檢測方法，其線性范圍為10-106cell/mL;檢測限為10cell/mL。
[0023]進一步地，上述方法中，
[0024]步驟I)配制的試劑A，硼摻雜的石墨烯量子點的濃度為15yg/mL;
[0025 ] 步驟2)配制的試劑B，Ce (N03) 3的摩爾濃度為20mmo I/L ；
[0026]步驟3)配制的試劑C，ATP的摩爾濃度為20mmo 1/L。
[0027]上述方法中，熒光光譜儀的激發(fā)波長為380nm，發(fā)射波長為530nmo
[0028]采用本發(fā)明技術方案具有如下有益效果:
[0029]本發(fā)明的宮頸癌細胞檢測試劑盒，選擇堿性磷酸酶作為檢測的靶向目標，采用硼摻雜石墨烯量子點為熒光探針，通過構建硼摻雜石墨烯量子點-淬滅劑-腺苷三磷酸復合試劑，實現(xiàn)宮頸癌細胞的高靈敏檢測。與石墨烯量子點相比，硼摻雜石墨烯量子點(B-GQDs)具有更高的量子產(chǎn)率，有利于檢測靈敏度的提高。所述的檢測試劑盒克服了傳統(tǒng)的宮頸癌檢測方法以及熒光發(fā)光試劑的缺陷，通過量子點熒光分析方法實現(xiàn)了細胞表面堿性磷酸酶快速、高效的檢測，具有信息量大、響應速度快、靈敏度高、成本低廉、光學抗干擾能力強等優(yōu)點。采用的硼摻雜石墨烯量子點無需進行額外修飾，不需要使用價格比較昂貴、連接步驟繁瑣的有機或生化材料進行前處理，因此操作簡單。
【附圖說明】
[0030]圖1.本發(fā)明中試劑A硼摻雜石墨烯量子點B-GQDs的透射電鏡圖。
[0031 ]圖2.本發(fā)明中試劑A硼摻雜石墨烯量子點B-GQDs的XPS譜圖。
[0032]圖3.本發(fā)明中試劑盒的檢測原理圖。其中:曲線a是B-GQDs的熒光信號響應;b是加入試劑Ce(NO3)3后B-GQDs的熒光信號響應;c是將試劑盒中的混合溶液A、B及C與HeLa細胞作用后的熒光響應信號。
[0033]圖4.本發(fā)明中B-GQDs的熒光強度隨HeLa細胞濃度(O-1O6CelVmL)變化的熒光光譜圖。
[0034]圖5.本發(fā)明中HeLa細胞濃度檢測的工作曲線。
【具體實施方式】
[0035]實施例1試劑盒的配制
[0036](I)B-GQDs 的制備
[0037]通過電化學工作站(CHI660B)采用恒電位計時電流法合成硼摻雜石墨烯量子點(B-GQDs) ο具體方法是:配制0.1moI/L的硼砂水溶液，取20mL作為電解液。以高純石墨棒作為工作電極，鉑絲電極作為對電極，甘汞電極作為參比電極，工作電位為3V。反應2小時后，將溶液通過0.22μηι的濾膜過濾，除去石墨稀片層。將上述溶液通過3500Da透析袋透析24h，除去溶液中Na+和B4O72—，得到B-GQDs。所得的B-GQDS分布均勻，其粒徑大小在3_8nm(圖1);對其元素分析發(fā)現(xiàn)其中含有B元素，含量為3.2 % (圖2)。
[0038](2)試劑A的配制:將上述合成B-GQDs分散在TBS緩沖液(濃度為0.lmol/L，pH值為7.4)中，得到量子點溶液，其中B-GQDs濃度為15yg/mL;
[0039](3)試劑B的配制:將一定量Ce(NO3)3溶解在二次水中，制得濃度為20mmol/L硝酸鈰溶液；
[0040](4)試劑C的配制:將一定量ATP溶解在二次水中，制得濃度為20mmol/L ATP溶液。實施例2熒光性能評價
[0041 ]通過熒光光譜儀檢測B-GQDs溶液研究其熒光性能;其中激發(fā)波長為380nm，發(fā)射波長為530nm。
[0042]B-GQDs熒光性能評價:將實施例1配制的量子點溶液分散到TBS緩沖液(濃度為
0.1mol/L，pH值為7.4)中，其中B-GQDS濃度為15μg/mL，檢測該溶液的熒光光譜(圖3中曲線a)，將焚光信號記為Fo。
[0043]試劑B對B-GQDs的熒光淬滅作用:向B-GQDs(15yg/mL)中加入20yL的Ce(NO3)3(20mmol/L)，記錄B-GQDs的熒光信號F(圖3中曲線b)，結果表明該信號發(fā)生大幅淬滅。.
[0044]HeLa細胞對B-GQDs熒光信號的恢復:取試劑A l.0mL、試劑B 20.0yL，混合均勻后加入試劑C 10.0yL制成混合試劑，將混合試劑與宮頸癌細胞HeLa(16CelVmL)在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h;，用TBS緩沖液沖洗3次洗去剩余的試劑后用胰酶消解HeLa細胞，記錄該體系的熒光信號(圖3中曲線C)，結果表明B-GQDS的熒光信號大幅的增強，可根據(jù)該增強的信號對HeLa細進行檢測。
[0045]實施例3建立檢測HeLa細胞濃度的工作曲線
[0046]取試劑A l.0mL、試劑B 20.0yL，混合均勻后加入試劑C 10.0yL制成混合試劑，將混合試劑與不同濃度的宮頸癌細胞HeLa(1-1O6ceIVmL)在37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)分別孵育2h;通過熒光光譜儀記錄B-GQDs的熒光信號Fi(圖4)，圖4中a-g分別表示細胞濃度為0、10、102、103、104、105、1060611/111匕計算出響應信號的差值六？(六？ = ?廣?())；將所述的六？與HeLa細胞的濃度繪制成AF-C工作曲線(圖5);從而建立了基于B-GQDs的熒光響應的HeLa細胞濃度檢測工作曲線;其線性范圍為10-106cell/mL。
[0047]實施例4待測樣品中HeLa細胞的檢測
[0048]取待測的HeLa細胞，按照與實施例3中相同的方法與試劑盒中的試劑作用并檢測其熒光信號，實驗結果表明當HeLa細胞存在時，量子點的熒光信號明顯恢復;根據(jù)HeLa細胞熒光變化程度，由實施例3中得到的標準曲線，可進一步得到待測HeLa細胞的濃度。取人胚腎上皮HEK 293T細胞為檢測對象，當其與試劑盒作用時，量子點的熒光信號無明顯變化。說明該試劑盒可用于堿性磷酸酶正表達的細胞(如HeLa細胞)的特異性檢測。
【主權項】
1.一種宮頸癌細胞檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括試劑A、B和C，試劑A為硼摻雜石墨烯量子點溶液，試劑B為硝酸鈰溶液，試劑C為腺苷三磷酸溶液。2.根據(jù)權利要求1所述的宮頸癌細胞檢測試劑盒，其特征在于:試劑A中硼摻雜石墨烯量子點的粒徑大小為3?8nm ο3.根據(jù)權利要求1或2所述的宮頸癌細胞檢測試劑盒，其特征在于:試劑A中還包括三羥基氨基甲烷-鹽酸緩沖液。4.根據(jù)權利要求3所述的宮頸癌細胞檢測試劑盒，其特征在于:三羥基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的濃度為0.lmol/L，pH為7.4。5.根據(jù)權利要求1或2所述的宮頸癌細胞檢測試劑盒，其特征在于:所述的試劑A為硼摻雜石墨烯量子分散在三羥基氨基甲烷-鹽酸緩沖液中得到量子點溶液，濃度為15yg/mL，緩沖液濃度為0.lmol/L,pH 7.4;試劑B中硝酸鈰溶液的濃度為20mmol/L;試劑C中腺苷三磷酸溶液的濃度為20mmol/L。
【文檔編號】C12Q1/04GK105886596SQ201610266982
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】吳萍, 陳力, 蔡稱心
【申請人】南京師范大學