一種四甲基吡嗪的提取純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種四甲基吡嗪的提取純化方法，包括步驟如下：(1)將發(fā)酵液升溫，離心分離菌體，得上清液；將上清液進行活性碳脫色；(2)將脫色后的上清液過濾，得到四甲基吡嗪透析液；(3)將四甲基吡嗪透析液過濾后再經(jīng)反滲透濾膜濃縮，得滲透液；(4)將滲透液進行冷卻結(jié)晶，降溫，離心分離四甲基吡嗪晶體，然后再溶解后進行冷卻重結(jié)晶，離心分離，得到高純度四甲基吡嗪。本發(fā)明的分離提純方法四甲基吡嗪的純度高，高達99％以上，提純效率高，高達88％以上。
【專利說明】
一種四甲基吡嗪的提取純化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種四甲基吡嗪的提取純化方法，尤其涉及一種從發(fā)酵液中分離純化四甲基吡嗪的生產(chǎn)工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]四甲基吡嗪，分子式為C8H12N2,分子量136.20，熔點84-86°(:，沸點190°(:，是一種常見的雜環(huán)含氮化合物，廣泛存在于食品原料、加工食品和酒精飲料中，被認為是一類重要的香味化合物，具有烘烤、花生、榛子和可可的香氣，常用于烘烤食品、冷飲、肉類、乳制品、卷煙等香精的調(diào)配。除了作為食品風味添加劑的用途，四甲基吡嗪作為中藥材川芎根莖的主要活性生物堿成分，已被證明具有治療心腦血管疾病的藥理作用，并對順鉑誘導的氧化應激、細胞凋亡和腎毒性有預防作用。隨著藥理研究的深入，現(xiàn)在已經(jīng)作為一種新型的鈣離子拮抗劑廣泛應用于臨床，是循環(huán)、中樞神經(jīng)、呼吸及其它系統(tǒng)相關(guān)疾病的大宗用藥，廣泛應用于心腦血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、腎小球疾病等的治療。
[0003]四甲基吡嗪的生產(chǎn)方法可分為生物合成法、直接從植物中提取法和化學合成法三種。截止目前，已有相當量的文獻及專利文件報道利用美拉德反應和Strecker降解化學法合成吡嗪類化合物，然而，化學合成法普遍存在較嚴峻的環(huán)保問題，反應條件一般較劇烈，對設(shè)備要求較高；雖然化學合成得到的吡嗪的價格遠低于前者，但是消費者更傾向于使用“天然”或“生物合成”吡嗪。直接從中藥材川；根莖中提取四甲基吡嗪的方法經(jīng)常面臨川芎植物原材料供應有限的問題，而且，四甲基吡嗪在川芎根莖中的含量較低(約0.075%)導致提取工藝成本較高而很難實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。隨著人們對綠色產(chǎn)品需求的日益提高，利用生物工程的手段生產(chǎn)四甲基吡嗪具有產(chǎn)品綠色天然、成本低、反應條件溫和、環(huán)境污染小等優(yōu)點而廣受消費者關(guān)注。
[0004]中國專利文件CN101445786A(申請?zhí)?200810235366.1)公開了一株高產(chǎn)四甲基吡嗪的枯草芽孢桿菌及其發(fā)酵生產(chǎn)四甲基吡嗪的方法，該菌株能以葡萄糖、蔗糖、糖蜜以及豆餅粉為底物，以大量積累內(nèi)源前體來提高四甲基吡嗪的產(chǎn)量。解決了微生物發(fā)酵生產(chǎn)四甲基吡嗪中產(chǎn)物濃度低、需外源添加前體和前體利用率低的問題。以蔗糖豆餅粉為底物時370C條件下?lián)u瓶培養(yǎng)120h可獲得4.08g/L的四甲基吡嗪。
[0005]中國專利文件CN 101955980A(申請?zhí)?201010238685.5)公開了一種生產(chǎn)四甲基吡嗪的方法及其生產(chǎn)菌株，具體地說是一種微生物利用還原糖發(fā)酵積累前體乙偶姻、以及乙偶姻和氨經(jīng)非酶促反應合成四甲基吡嗪的兩步法生產(chǎn)工藝，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。所述微生物為枯草芽孢桿菌(CCTCCNO:M208157)、地衣芽孢桿菌(CGMCCNO:3961)地衣芽孢桿菌(CGMCCN0: 3962)以及地衣芽孢桿菌(CGMCCNO: 3963)中任——株，上述菌株利用還原糖發(fā)酵獲得生物量并積累內(nèi)源前體乙偶姻，然后，發(fā)酵體系中的乙偶姻和氨經(jīng)非酶促催化反應合成四甲基吡嗪。優(yōu)點如下:1.獲得較高的菌體量，且乙偶姻積累量得以有效提高(38-44g/L);2.高濃度的內(nèi)源前體乙偶姻和氨在適宜的條件下可快速反應生成四甲基吡嗪(16-20g/L);3.內(nèi)源乙偶姻的積累以及原位發(fā)酵環(huán)境，顯著提高了前體的利用率(40.3%)。
[0006]中國專利文件CN 102618587A(申請?zhí)?201210089617.6)公開了以酒糟為原料，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物香料乙偶姻和四甲基吡嗪的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。在經(jīng)酸度調(diào)節(jié)的新鮮酒糟中補充適量葡萄糖O?100g/kg，加入枯草芽孢桿菌(CCTCCN0:M208157)或地衣芽孢桿菌(06110:3961，3962，3963)中任一株培養(yǎng)的種子培養(yǎng)物后37°(:發(fā)酵1?3天，能夠大量產(chǎn)生生物香料乙偶姻。在此基礎(chǔ)上，還可通過向上述發(fā)酵產(chǎn)物中添加銨鹽來轉(zhuǎn)化生產(chǎn)另一種生物香料四甲基吡嗪。突出的優(yōu)點是利用酒糟為原料，通過是否添加銨鹽來有選擇的控制生產(chǎn)生物香料乙偶姻或四甲基吡嗪的方法，既可有選擇的獲得不同高附加值的生物香料，又防止了酒糟污染環(huán)境，提升了酒糟的利用價值。
[0007]中國專利文件CN 105002115A(申請?zhí)?201510450768.3)公開了一種地衣芽孢桿菌及用其制備的大曲和該大曲的制備方法，該菌株的分類命名為地衣芽孢桿菌(Bacilluslincheniformis)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCN0.M2015224，并將其制備發(fā)酵菌液后，作為功能性菌液，再將功能性菌液接種在制曲原料上進行發(fā)酵處理，獲得大曲產(chǎn)品，該工藝流程短，容易操作，并且獲得的大曲與傳統(tǒng)大曲相比，其四甲基吡嗪的含量提高至了9倍多。
[0008]盡管，上述專利文件公開的方法對于提高發(fā)酵液中四甲基吡嗪的濃度有所幫助，但是從發(fā)酵液中提純分離得到高純度四甲基吡嗪沒有詳細報道。而且在中國專利文件CN102618587A中，描述的四甲基吡嗪從固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物中提取，提出采用水或乙醇浸泡，超聲lh，然后采離心或過濾后，進行上清液減壓蒸餾，收集餾分進行冷卻結(jié)晶得到濕晶體，然后進行冷凍干燥得到粉末狀晶體，整個提取過程采用的超聲、冷凍干燥及減壓蒸餾能耗大，不適宜規(guī)?；瘧?，而且連續(xù)性受到限制，過程中四甲基吡嗪揮發(fā)易受損失，從而造成較低的四甲基吡嗪回收率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]針對現(xiàn)有發(fā)酵生產(chǎn)四甲基吡嗪的提純難點和缺陷，本發(fā)明提供一種四甲基吡嗪的提取純化方法。
[0010]術(shù)語說明:
[0011]本發(fā)明所提取的發(fā)酵液為枯草芽孢個桿菌或地衣芽孢桿菌發(fā)酵所得含有四甲基吡嗪的發(fā)酵液;其中，枯草芽孢個桿菌或地衣芽孢桿菌為現(xiàn)有菌株，發(fā)酵過程均按現(xiàn)有技術(shù)。
[0012]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0013]一種四甲基吡嗪的提取純化方法，包括步驟如下:
[0014](I)將發(fā)酵液升溫至70-800C，離心分離菌體，得上清液;將上清液維持溫度70-80°C進行活性碳脫色；
[0015](2)將脫色后的上清液過濾，得到四甲基吡嗪透析液；
[0016](3)將四甲基吡嗪透析液過濾后再經(jīng)反滲透濾膜濃縮，得滲透液；
[0017](4)將滲透液進行冷卻結(jié)晶，降溫至10-15°C時，離心分離四甲基吡嗪晶體，然后再將四甲基吡嗪晶體于70-90°C溶解后進行冷卻重結(jié)晶，離心分離，得到高純度四甲基吡嗪。
[0018]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(I)中將發(fā)酵液升溫所用設(shè)備為管式換熱器，進一步優(yōu)選為內(nèi)外夾套換熱器，為長彎管外加套管的蛇形彎曲組合，材質(zhì)為316L不銹鋼，換熱面積以使發(fā)酵液溫度從30 0C升溫至80 0C計算。夾套中加熱用料為90-95 °C的熱水；
[0019]優(yōu)選的，離心分離菌體所用設(shè)備為離心機，材質(zhì)為316L不銹鋼，進一步優(yōu)選碟片式離心機，離心轉(zhuǎn)速為7000-10000轉(zhuǎn)/分鐘，進一步優(yōu)選轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分鐘；
[0020]優(yōu)選的，脫色過程是采用活性炭密封脫色，進一步優(yōu)選的，所述活性碳為醫(yī)藥級活性炭粉末，活性碳用量為上清液體積的1-1.5%;脫色過程的壓力為0.1-0.2MPa，脫色時間為20-40min，脫色后調(diào)整pH為7.0-8.0。
[0021]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(2)中過濾過程為:先用板框過濾器過濾，然后進行超濾去除雜質(zhì)蛋白，最后進行納濾進一步去除雜質(zhì)；
[0022]進一步優(yōu)選的，板框過濾器過濾時，在板框過濾器中鋪設(shè)硅藻土，所述的硅藻土為粒徑在28-68μηι的粗娃藻土與粒徑在0.02-2μηι的細娃藻土按3:1質(zhì)量比的混合;鋪設(shè)粗細搭配硅藻土，能夠延長過濾時間，增加過濾澄清度，防止因過濾物質(zhì)的粘度過高而阻塞濾布空隙;板框過濾器過濾板的材質(zhì)為聚四氟乙烯；
[0023]進一步優(yōu)選的，超濾過程的超濾膜截留分子量為100Dalton;
[0024]進一步優(yōu)選的，納濾過程的納濾膜截留分子量為200Dalton。
[0025]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(3)中濃縮的溫度為60_70°C，濃縮前溶液為濃縮后溶液體積的2.5-3倍，反滲透濃縮后取濃縮相進行降溫結(jié)晶，反滲透膜最大操作壓力不超過
0.SMPa ο反滲透濾膜的主要作用為濃縮滲透液。
[0026]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(4)中降溫速度以5-10°C/h降溫，直至結(jié)晶析出。冷卻結(jié)晶在結(jié)晶罐中進行，結(jié)晶罐為立式攪拌結(jié)晶罐，結(jié)晶罐帶夾層，離心用離心機進行，所述離心機為布袋式三足離心機。
[0027]本發(fā)明從枯草芽孢個桿菌或地衣芽孢桿菌發(fā)酵所得含有四甲基吡嗪的發(fā)酵液中分離提純四甲基吡嗪，凡是經(jīng)枯草芽孢個桿菌或地衣芽孢桿菌發(fā)酵含有四甲基吡嗪的發(fā)酵液均可作為本發(fā)明方法的原料。
[0028]本發(fā)明的有益效果如下:
[0029]1、本發(fā)明的分離提純方法四甲基吡嗪的純度高，高達99%以上，提純效率高，高達88%以上。
[0030]2、本發(fā)明方法適應于微生物發(fā)酵制備四甲基吡嗪的產(chǎn)業(yè)化提取制備，本發(fā)明方法自動化程度高，設(shè)備利用率高，過程簡單，損失少，雜質(zhì)去除率高，制備的產(chǎn)品純度和回收率都較傳統(tǒng)的方法有很大的提高。
【具體實施方式】
[0031]下面通過具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但不限于此。
[0032]實施例中所用原料均為常規(guī)原料，所用設(shè)備均為常規(guī)設(shè)備。
[0033]其中:發(fā)酵液為參照中國專利文件CN102618587A公開的方法得到的發(fā)酵液。
[0034]活性碳為醫(yī)藥級活性炭粉末。
[0035]管式換熱器為內(nèi)外加套換熱器，為長管套管彎曲組合，材質(zhì)為316L不銹鋼，換熱面積以使發(fā)酵液溫度從30 0C升溫至80°C計算；
[0036]離心分離菌體所用設(shè)備為碟片式離心機，材質(zhì)為316L不銹鋼，離心轉(zhuǎn)速為7000-10000轉(zhuǎn)/分鐘；
[0037]脫色罐為密封耐壓發(fā)酵罐，耐受壓力為0.2MPa，發(fā)酵罐帶有泄壓口，泄壓口帶有循環(huán)水冷卻回流裝置；
[0038]板框過濾器為鋪設(shè)有硅藻土的板框過濾器，硅藻土為粒徑在30_40μπι的粗硅藻土與粒徑在1-2μπι的細硅藻土按3:1質(zhì)量比的混合;板框過濾器過濾板的材質(zhì)為聚四氟乙烯；
[0039]超濾系統(tǒng)所用超濾膜截留分子量為lOOODalton，納濾所用納濾膜截留分子量為200Dalton；
[0040]結(jié)晶罐為立式攪拌結(jié)晶罐，結(jié)晶罐帶夾層，結(jié)晶后所用的離心機為布袋式三足離心機。
[0041 ] 實施例1
[0042]—種四甲基吡嗪的提取純化方法，包括步驟如下:
[0043](I)將發(fā)酵液經(jīng)過管式換熱器換熱后，升溫至70°C，經(jīng)衛(wèi)生級離心栗栗入離心機，離心分離菌體后，得上清液;將上清液進入帶有回流管的活性炭脫色罐，密封脫色30min，維持溫度70-80°C;活性碳用量為上清液體積的1%;脫色過程的壓力為0.1-0.12MPa，脫色脫色后調(diào)整pH為7.0-8.0;
[0044](2)將步驟(I)脫色后的上清液經(jīng)板框過濾器過濾后，進入緩沖罐，然后進入超濾系統(tǒng)，過濾除去雜蛋白后，進一步通過納濾去除雜質(zhì)后，獲得四甲基吡嗪透析液；
[0045](3)將步驟(2)中四甲基吡嗪透析液于60-65°C濃縮后再經(jīng)反滲透濾膜濃縮后，得滲透液，取滲透后濃相，濃縮倍數(shù)為2.5倍
[0046](4)將步驟(3)中滲透液進入冷卻結(jié)晶罐中進行冷卻結(jié)晶，以10°C/h的速率降溫至15°C時，離心分離四甲基吡嗪晶體，然后再將四甲基吡嗪晶體于80°C溶解后進行冷卻重結(jié)晶，離心分離，得到高純度四甲基吡嗪。
[0047]本實施例得到的四甲基吡嗪純度為99.1%，提純效率為89.4%，達到醫(yī)藥級純度要求。
[0048]實施例2
[0049]—種四甲基吡嗪的提取純化方法，包括步驟如下:
[0050](I)將發(fā)酵液經(jīng)過管式換熱器換熱后，升溫至80°C，經(jīng)衛(wèi)生級離心栗栗入離心機，離心分離菌體后，得上清液;將上清液進入帶有回流管的活性炭脫色罐，密封脫色40min，維持溫度80°C;活性碳用量為上清液體積的1.5%;脫色過程的壓力為0.12-0.15MPa，脫色脫色后調(diào)整pH為7.0-8.0;
[0051](2)將步驟(I)脫色后的上清液經(jīng)板框過濾器過濾后，進入緩沖罐，然后進入超濾系統(tǒng)，過濾除去雜蛋白后，進一步通過納濾去除雜質(zhì)后，獲得四甲基吡嗪透析液；
[0052](3)將步驟(2)中四甲基吡嗪透析液于70-75°C濃縮后再經(jīng)反滲透濾膜濃縮后，得滲透液;濃縮液濃相濃縮倍數(shù)達到3倍
[0053](4)將步驟(3)中滲透液進入冷卻結(jié)晶罐中進行冷卻結(jié)晶，以5°C/h的速率降溫至10°C時，離心分離四甲基吡嗪晶體，然后再將四甲基吡嗪晶體于70°C溶解后進行冷卻重結(jié)晶，離心分離，得到高純度四甲基吡嗪。
[0054]本實施例得到的四甲基吡嗪純度為99.2%,提純效率為88.2%,純度達到醫(yī)藥級產(chǎn)品要求。
[0055]實施例3
[0056]—種四甲基吡嗪的提取純化方法，包括步驟如下:
[0057](I)將發(fā)酵液經(jīng)過管式換熱器換熱后，升溫至75°C，經(jīng)衛(wèi)生級離心栗栗入離心機，離心分離菌體后，得上清液;將上清液進入帶有回流管的活性炭脫色罐，密封脫色20min，維持溫度75°C;活性碳用量為上清液體積的1.2%;脫色過程的壓力為0.15-0.19MPa，脫色脫色后調(diào)整pH為7.0-8.0;
[0058](2)將步驟(I)脫色后的上清液經(jīng)板框過濾器過濾后，進入緩沖罐，然后進入超濾系統(tǒng)，過濾除去雜蛋白后，進一步通過納濾去除雜質(zhì)后，獲得四甲基吡嗪透析液；
[0059](3)將步驟(2)中四甲基吡嗪透析液于55_60°C濃縮后再經(jīng)反滲透濾膜濃縮后，得滲透液;濃縮液濃相濃縮倍數(shù)達到2倍；
[0060](4)將步驟(3)中滲透液進入冷卻結(jié)晶罐中進行冷卻結(jié)晶，以8°C/h的速率降溫至12°C時，離心分離四甲基吡嗪晶體，然后再將四甲基吡嗪晶體于90°C溶解后進行冷卻重結(jié)晶，離心分離，得到高純度四甲基吡嗪。
[0061 ] 本實施例得到的四甲基吡嗪純度為99.05%,提純效率為88.67%,達到醫(yī)藥級產(chǎn)品要求。
[0062]對比例
[0063]—種四甲基吡嗪的提取純化方法，包括步驟如下:
[0064](I)將發(fā)酵液經(jīng)過管式換熱器換熱后，升溫至75°C，經(jīng)衛(wèi)生級離心栗栗入離心機，離心分離菌體后，得上清液;將上清液進入帶有回流管的活性炭脫色罐，密封脫色20min，維持溫度75°C ;活性碳用量為上清液體積的1.2% ;脫色過程的壓力為0.1MPa，脫色脫色后調(diào)整pH為5.0-6.0;
[0065](2)將步驟(I)脫色后的上清液經(jīng)板框過濾器過濾后，進入緩沖罐，然后進入超濾系統(tǒng)，過濾除去雜蛋白后，進一步通過納濾去除雜質(zhì)后，獲得四甲基吡嗪透析液；
[0066](3)將步驟(2)中四甲基吡嗪透析液于50-55°C濃縮后再經(jīng)反滲透濾膜濃縮后，得滲透液;濃縮液濃相濃縮倍數(shù)達到2.5倍；
[0067](4)將步驟(3)中滲透液進入冷卻結(jié)晶罐中進行冷卻結(jié)晶，以8°C/h的速率降溫至12°C時，離心分離四甲基吡嗪晶體，然后再將四甲基吡嗪晶體于90°C溶解后進行冷卻重結(jié)晶，離心分離，得到高純度四甲基吡嗪。
[0068]本實施例得到的四甲基吡嗪純度為97%，提純效率為65.8%，達到化學純產(chǎn)品要求。
【主權(quán)項】
1.一種四甲基吡嗪的提取純化方法，包括步驟如下: (1)將發(fā)酵液升溫至70-800C，離心分離菌體，得上清液;將上清液維持溫度70-80V進行活性碳脫色； (2)將脫色后的上清液過濾，得到四甲基吡嗪透析液； (3)將四甲基吡嗪透析液過濾后再經(jīng)反滲透濾膜濃縮，得滲透液； (4)將滲透液進行冷卻結(jié)晶，降溫至10-15°C時，離心分離四甲基吡嗪晶體，然后再將四甲基吡嗪晶體于70-90°C溶解后進行冷卻重結(jié)晶，離心分離，得到高純度四甲基吡嗪。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四甲基吡嗪的提取純化方法，其特征在于，步驟(I)中將發(fā)酵液升溫所用設(shè)備為管式換熱器。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四甲基吡嗪的提取純化方法，其特征在于，步驟(I)中離心分離菌體所用設(shè)備為離心機，離心轉(zhuǎn)速為7000-10000轉(zhuǎn)/分鐘。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四甲基吡嗪的提取純化方法，其特征在于，步驟(I)中脫色過程是采用活性炭密封脫色； 優(yōu)選的，活性碳用量為上清液體積的1-1.5 % ; 優(yōu)選的，脫色過程的壓力為0.1-0.210^，脫色時間為20-4011^11。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四甲基吡嗪的提取純化方法，其特征在于，步驟(I)中脫色后調(diào)整 pH 為 7.0-8.0。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四甲基吡嗪的提取純化方法，其特征在于，步驟(2)中過濾過程為:先用板框過濾器過濾，然后進行超濾去除雜質(zhì)蛋白，最后進行納濾進一步去除雜質(zhì)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的四甲基吡嗪的提取純化方法，其特征在于，步驟(2)中板框過濾器過濾時，在板框過濾器中鋪設(shè)娃藻土，所述的娃藻土為粒徑在28-68μηι的粗娃藻土與粒徑在0.02_2μπι的細硅藻土按3:1質(zhì)量比的混合。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的四甲基吡嗪的提取純化方法，其特征在于，步驟(2)中超濾過程的超濾膜截留分子量為100Dalton; 優(yōu)選的，納濾過程的納濾膜截留分子量為200Dalton。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四甲基吡嗪的提取純化方法，其特征在于，步驟(3)中濃縮的溫度為60-70°C，濃縮前溶液為濃縮后溶液體積的2.5-3倍，反滲透濃縮后取濃縮相進行降溫結(jié)晶，反滲透膜最大操作壓力不超過0.8MPa。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四甲基吡嗪的提取純化方法，其特征在于，步驟(4)中降溫速度以5-1 (TC /h降溫，直至結(jié)晶析出。
【文檔編號】C07D241/12GK105859642SQ201610242785
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月19日
【發(fā)明人】王騰飛, 孟武, 王瑞明, 王建斌
【申請人】齊魯工業(yè)大學, 諸城東曉生物科技有限公司