基因cidec檢測豬肌肉中甘油三酯含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基因CIDEC檢測豬肌肉中甘油三酯含量的方法，利用基因CIDEC在脂肪組織中的表達(dá)水平來檢測豬肌肉中甘油三酯含量。該法具有快速準(zhǔn)確、操作方便且不影響豬正常生長的特點(diǎn)，適用于在豬養(yǎng)殖過程中動態(tài)監(jiān)控豬肌肉中甘油三酯含量情況以便于隨時掌握豬生長狀況，對豬肌肉中脂肪的含量有一個相對精確的了解，進(jìn)而對豬的日糧進(jìn)行調(diào)整。
【專利說明】
基因CI DEC檢測豬肌肉中甘油三酯含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于豬肌肉中甘油三酯含量檢測領(lǐng)域，尤其是涉及一種基因 CIDEC檢測豬 肌肉中甘油三酯含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬是我國主要的肉用動物，豬肉產(chǎn)量已占肉類總產(chǎn)量的60%以上。多年來的育種 工作使豬瘦肉率水平有很大提高、脂肪性狀得以顯著改良。然而，在瘦肉率上升的同時，豬 肉品質(zhì)卻在急劇下降。
[0003] 豬肌肉中脂肪通常稱為肌內(nèi)脂肪（DIF)，豬的肌內(nèi)脂肪含量是其重要經(jīng)濟(jì)性狀，也 是影響肉質(zhì)的一個極其重要的指標(biāo)，對肌肉的風(fēng)味、嫩度和多汁性等食用品質(zhì)有重要影響。 脂肪組織能大量儲存甘油三酯，豬的肌內(nèi)脂肪主要成分為甘油三酯，通過對甘油三酯的測 定可以了解豬肌肉中脂肪的積累情況。因此，可以通過動態(tài)監(jiān)控肌肉中甘油三酯的含量來 動態(tài)調(diào)節(jié)豬肉品質(zhì)，進(jìn)而對日糧進(jìn)行調(diào)整，得到品質(zhì)更好的豬肉。多年來，國內(nèi)外學(xué)者對豬 肌內(nèi)脂肪含量做了相當(dāng)多的研究，其研究結(jié)果對豬品種的選育、肉品的加工利用等均有重 要的參考價值。
[0004] Cide家族是上世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)的一組新蛋白。人類中，Cide家族蛋白有三個成員，分別 是Cidea、Cideb和Cidec，對Cide家族蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，其N端結(jié)構(gòu)與DFF45N端結(jié)構(gòu)高度同 源，由此得名。此外，Cide家族蛋白N端結(jié)構(gòu)也是分子間相互作用的結(jié)構(gòu)，而其C端均含有獨(dú) 特的同源序列，是該家族蛋白特有的功能結(jié)構(gòu)域，發(fā)揮重要作用。Cidec是調(diào)控脂肪滴發(fā)育 和脂肪沉積的關(guān)鍵因子，其可能與脂質(zhì)代謝有密切關(guān)系。Cidec在脂肪組織中高表達(dá)，可以 通過調(diào)節(jié)能量消耗來參與肥胖的發(fā)生。Cidec基因的定位于脂滴表面，在誘導(dǎo)大脂滴形成的 同時也增加體內(nèi)甘油三酯的存儲。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速準(zhǔn)確、操作方便且不影響豬正常生長的 基因CIDEC檢測豬肌肉中甘油三酯含量的方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:基因CIDEC檢測豬肌肉中甘油三 酯含量的方法，利用基因CIDEC在脂肪組織中的表達(dá)水平來檢測豬肌肉中甘油三酯含量。
[0007] 上述基因CIDEC檢測豬肌肉中甘油三酯含量的方法，通過定量PCR來檢測基因 CIDEC在脂肪組織里mRNA的表達(dá)量，用于定量PCR基因CIDEC特異片段的引物對分別具有以 下堿基序列：
[0008] Forward primer：AGAAACATGGAGCCCAACGC,
[0009] Reverse primer：GTCTGCCAGCATCAGACTGT〇
[0010]上述基因CIDEC檢測豬肌肉中甘油三酯含量的方法，包括以下步驟：
[0011] (1)從被檢測的豬組織中抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的CDNA樣品；
[0012] (2)用引物對Forward primer和Reverse primer對步驟（1)中的cDNA樣品進(jìn)行定 量 PCR〇
[0013]步驟（1)中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和條件為:在20yl反轉(zhuǎn)錄體系中，加入4yl總RNA，2yl 01ig(dT)，4yl DEPC水，先置于70°C溫育lOmin，再置于冰上急速冷卻2min;然后加入：lyl dNTP Mix，0.5yl M-MLV，4yl Buffer，0.5yl RRI，4yl DEPC水，依次置于42°Clh，9(TC 1〇1^11，2〇1€2111111;最后-20°(：保存。
[0014] 步驟(2)中定量PCR擴(kuò)增步驟的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為：
[0015] 反應(yīng)體系：在20yl定量PCR反應(yīng)體系中，含有l(wèi)yl cDNA模板，10y SYBR Premix Ex Ta定量II 2X，0.4iil ROX Reference Dyell 50X，l]iM的lyl引物Forward primer，liiM的 1 yl引物Reverse primer，6 ? 6yl無菌去離子水；
[0016] 反應(yīng)條件：951€308;951€58,601€308,40個循環(huán) ；95°(：158,60°(：1111111，951€308,60 °C15s〇
[0017] 針對目前豬養(yǎng)殖和生產(chǎn)中缺乏有效監(jiān)測其肌內(nèi)脂肪含量狀況的措施，發(fā)明人研究 發(fā)現(xiàn)，CIDEC基因的表達(dá)量與豬肌肉中甘油三酯含量成正相關(guān)，而肌內(nèi)脂肪含量的高低可由 豬肌肉中甘油三酯含量的情況體現(xiàn)出來，豬肌肉中甘油三酯含量又可以通過CIDEC基因的 表達(dá)量確定，因此，CIDEC在脂肪組織中的相對表達(dá)量可以用來反應(yīng)豬肌內(nèi)脂肪含量狀況。 據(jù)此，發(fā)明人建立了一種基因CIDEC檢測豬肌肉中甘油三酯含量的方法，利用基因CIDEC在 脂肪組織中的表達(dá)水平來檢測豬肌肉中甘油三酯含量。該法具有快速準(zhǔn)確、操作方便且不 影響豬正常生長的特點(diǎn)，適用于在豬養(yǎng)殖過程中動態(tài)監(jiān)控豬肌肉中甘油三酯含量情況以便 于隨時掌握豬生長狀況，對豬肌肉中脂肪的含量有一個相對精確的了解，進(jìn)而調(diào)整豬的日 糧。
【附圖說明】
[0018] 圖1是5月齡、8月齡、11月齡豬肌肉甘油三酯的相對含量圖。
[0019] 圖2是5月齡、8月齡、11月齡豬脂肪組織中的Cidec相對表達(dá)量及肌肉甘油三酯的 相對含量對照圖，圖中：左為Cidec相對表達(dá)量圖，右為Cidec相對表達(dá)量與肌肉甘油三酯相 對含量的相關(guān)性圖。
[0020] 圖3是5月齡、8月齡、11月齡豬脂肪組織中的LPL相對表達(dá)量及肌肉甘油三酯的相 對含量對照圖，圖中：左為LPL相對表達(dá)量圖，右為LPL相對表達(dá)量與肌肉甘油三酯相對含量 的相關(guān)性圖。
[0021]圖4是5月齡、8月齡、11月齡豬脂肪組織中的plinl相對表達(dá)量及肌肉甘油三酯的 相對含量對照圖，圖中：左為pl ini相對表達(dá)量圖，右為pi ini相對表達(dá)量與肌肉甘油三酯相 對含量的相關(guān)性圖。
【具體實(shí)施方式】 [0022] 一、研究設(shè)計(jì)
[0023] 以巴馬香豬為研究對象，正常喂食處理，在5月齡、8月齡、11月齡檢測Cidec、LPL和 Plinl的表達(dá)水平，考察相關(guān)基因的表達(dá)量與豬肌肉甘油三酯含量的關(guān)系。
[0024] 利用NCBI數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的豬（sus scrofa)的Cidec序列（序列登錄號：GI: 162951808;參見網(wǎng)址:NCBI數(shù)據(jù)http ://www.ncbi .nlm.nih. gov/)，LPL序列（序列登錄號： 55741568)，Plinl序列（序列登錄號:84490422)，設(shè)計(jì)特異性定量引物，以便檢測豬的基因 組中該基因的相對表達(dá)量。其中，豬（sus scrofa)的Cidec特異片段，序列全長為803bp，豬 (sus scrofa)的LPL特異片段，序列全長為2946bp，豬(sus scrofa)的PI ini特異片段，序列 全長為1579bp。豬的看家基因甘油醛-3-脫氫酶基因GAPDH特異片段，序列全長為1341bp。 [0025]用于定量PCR上述Cidec特異片段的引物對，其堿基序列為：
[0026] Forward primer(Pl)：AGAAACATGGAGCCCAACGC；
[0027] Reverse primer(P2)：GTCTGCCAGCATCAGACTGT〇
[0028] 用于定量PCR上述LPL特異片段的引物對，其堿基序列為：
[0029] Forward primer(P3)：TGCTGGGAATCCAAACTGAA；
[0030] Reverse primer(P4)：TCTGGCACCACTGGAACAAT〇
[0031 ]用于定量PCR上述PI ini特異片段的引物對，其堿基序列為：
[0032] Forward primer(P5)：GCACTACGTGCCGCTCC；
[0033] Reverse primer(P6):CCTCTGGCGGCGGGTT。
[0034]用于定量PCR豬的看家基因甘油醛-3-脫氫酶GATOH特異片段的引物，其堿基序列 為：
[0035] Forward primer(P7)：CGTGTCGGTTGTGGATCTGA；
[0036] Reverse primer(P8):TGACGAAGTGGTCGTTGAGG〇 [0037] 二、研究方法
[0038] (1)動物和樣品的獲得
[0039] 實(shí)驗(yàn)用豬在廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院巴馬香豬飼養(yǎng)基地喂養(yǎng)，不同月齡的豬分 欄飼養(yǎng)，每欄最多不超過4頭，按體重的3%進(jìn)行飼喂。在相應(yīng)的時間點(diǎn)（5月齡、8月齡、11月 齡），空腹16小時后，稱體重、手術(shù)采集豬背部皮下脂肪，將采集的豬背部皮下脂肪樣品立即 用液氮冷凍，然后放置于_80°C超低溫冰箱凍存以待分析。采集豬背最長肌，生理鹽水清洗 后用組織細(xì)胞甘油三酯酶法測定試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司）測定背最長肌甘 油三酯含量。
[0040] (2)總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄
[00411 從_80°C冰箱中取出O.lg的豬皮下脂肪組織樣放入2ml離心管中，加入lml Trizol 試劑(ambion)，用高通量研磨儀(大連愛科儀器開發(fā)有限公司）研磨2min，后靜置5min，讓組 織充分裂解；向離心管中加入0.2ml的氯仿，用力搖晃30s，靜置5min，后4°C 12000rpm離心 10min;取上清至另一 1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，后4 。(:12000rpm離心10min，棄上清;在離心管中加入70%的用DEPC水配制的乙醇，4°C12000rpm 離心3min，洗滌兩次;沉淀自然揮發(fā)干，加入20y 1 DEPC水，-80°C保存。
[0042]通過酶標(biāo)儀(TECAN infinite M200PR0)測定總RNA濃度。
[0043] 在經(jīng)過無RNA酶處理的PCR管(AXYGEN)中配制20yl反轉(zhuǎn)錄體系，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA樣品。在20yl反轉(zhuǎn)錄體系中，加入4yl總RNA，2yl 01ig(dT)，4yl DEPC水，先置于70°C溫 育lOmin，再置于冰上急速冷卻2min;然后加入：lyl dNTP Mix(Solarbio dNTP Mix)，0.5yl M-MLV(TaKaRa Reverse Transcriptase M-MLV),4lil Buffer(TaKaRa 5XReverse Transcriptase M-MLV Buffer)，0.5yl RRI(TaKaRa)，4yl DEPC水，依次置于42°Clh，9(TC 1〇1^11，2〇1€2111111;最后-20°(：保存。
[0044] (3)定量 PCR
[0045] 分別用基因Cidec、LPL和Plinl的特異性引物對(P1和P2、P3和P4、P5和P6)對步驟 (2)所述的cDNA樣品進(jìn)行定量PCR。用引物對P7和P8,對看家基因GAPDH進(jìn)行定量PCR。對定量 PCR的結(jié)果進(jìn)行分析計(jì)算，得到其相對表達(dá)量。
[0046] 在8連管(AXYGEN)中配制20yl定量PCR體系，進(jìn)行定量PCR。
[0047] 在20yl定量PCR反應(yīng)體系中，含有l(wèi)yl cDNA模板，10y SYBR Premix Ex Ta定量II 2X(TaKaRaSYBR?Premix Ex Ta定量?II(Tli RNaseH Plus)試劑盒），0.4yl ROX Reference Dyell 50 X(TaKaRa.SYBR^ Premix Ex Ta定量?"iKTli RNaseH Plus)試劑盒）， lyM的lul 引物Forward primer，luM的lul 引物Reverse primer，6 ? 6ul無菌去離子水；
[0048] 在定量PCR儀(Applied Biosystems 7500Real Time PCR System)中進(jìn)行表達(dá)量 檢測，反應(yīng)條件：951€308;951€58,60 1€308,40個循環(huán)；95°(：158,60°(：1111111，951€308,60 1€ 15s〇
[0049] (4)統(tǒng)計(jì)分析
[0050] 結(jié)果用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差產(chǎn)方式表示。通過SPSS19.0軟件(德國）用One-WayANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<〇.05可確定為具有統(tǒng)計(jì)差異。
[0051]表1 5月齡、8月齡、11月齡豬的體重表格和背膘厚度
[0053] 三、研究結(jié)論
[0054] 表1和圖1-4結(jié)果表明，基因Cidec的表達(dá)量與肌肉甘油三酯正相關(guān)，而LPL和Plinl 的表達(dá)量與肌肉甘油三酯相關(guān)性較差。因此，以基因Cidec在豬脂肪組織中的mRNA相對表達(dá) 量可以用來反應(yīng)豬的肌肉甘油三酯含量狀況。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基因 CIDEC檢測豬肌肉中甘油三酯含量的方法，其特征在于利用基因 CIDEC在脂 肪組織中的表達(dá)水平來檢測豬肌肉中甘油三酯含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因 CIDEC檢測豬肌肉中甘油三酯含量的方法，其特征在于通 過定量PCR來檢測基因 CIDEC在脂肪組織里mRNA的表達(dá)量，用于定量PCR基因 CIDEC特異片段 的引物對分別具有以下喊基序列： Forward primer：AGAAACATGGAGCCCAACGC, Reverse primer:GTCTGGQVGQVTQVGACTGI'。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因 CIDEC檢測豬肌肉中甘油三酯含量的方法，其特征在于包 括以下步驟： (1) 從被檢測的豬組織中抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA樣品； (2) 用引物對Forward primer和Reverse primer對步驟（1)中的cDNA樣品進(jìn)行定量 PCR〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因 CIDEC檢測豬肌肉中甘油三酯含量的方法，其特征在于步 驟（1)中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和條件為:在20μ1反轉(zhuǎn)錄體系中，加入4μ1總RNA，2μ1 Olig(dT)， 4μ1 DEPC水，先置于70°C溫育lOmin，再置于冰上急速冷卻2min;然后加入：1μ1 dNTP Mix， 0·5μ1 M-MLV，4yl Buffer，0.5yl RRI，4yl DEPC水，依次置于42°Clh，9(TC10min，2(rC 2min;最后_20°C保存。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因 CIDEC檢測豬肌肉中甘油三酯含量的方法，其特征在于步 驟(2)中定量PCR擴(kuò)增步驟的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為： 反應(yīng)體系：在20μ1定量PCR反應(yīng)體系中，含有ΙμL cDNA模板，lOySYBR Premix Ex Ta定 量II 2Χ，0·4μ1 ROX Reference Dyell 50Χ，1μΜ的ΙμL引物Forward primer，lyM的ΙμL引 物Reverse primer，6·6μ1無菌去離子水； 反應(yīng)條件：951€308;951€58,60 1€308,40個循環(huán)；95°(：158,60°(：1111丨11，951€308,60 1€ 15s〇
【文檔編號】C12Q1/68GK105821150SQ201610377195
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】周磊, 褚毅, 靳藝, 楊冉冉
【申請人】廣西大學(xué)