一種用于檢測(cè)HLA-DQ基因rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的引物及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)HLA?DQ基因rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的引物，包括正向引物5’?CTTCCATGAACCTTACAG?3’和反向引物5’?AAATGGCTACTTCCCTA?3’。采用該引物檢測(cè)HLA?DQ基因rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的方法，包括以下步驟：(1)采集樣品并提取其基因組DNA；(2)采用上述引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收；(3)對(duì)膠回收產(chǎn)物進(jìn)行濃度測(cè)定，然后PCR擴(kuò)增并純化；(4)將步驟(3)中的純化產(chǎn)物在3730型全自動(dòng)序列分析儀上樣，用Chromas軟件對(duì)SNP分型進(jìn)行分析。該引物和檢測(cè)方法特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性好。
【專利說明】
一種用于檢測(cè)HLA-DQ基因r S9275319位點(diǎn)多態(tài)性的引物及檢 測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)HLA-DQ基因rs9275319位點(diǎn)多 態(tài)性的引物及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌是一種常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，是我國常見的惡性腫瘤，自上世紀(jì)末以 來已迅速上升至我國惡性腫瘤第二位，僅次于肺癌。肝癌平均年生存率僅有9%，我國每年 死于肝癌的人數(shù)占全球肝癌死亡人口總數(shù)的45%，給患者的家庭和社會(huì)均帶來了嚴(yán)重的負(fù) 擔(dān)。我國是乙肝高發(fā)區(qū)，僅HBs Ag攜帶者人數(shù)已占全球攜帶者人數(shù)的34.3% (3.5億）。據(jù)調(diào) 查，在我國乙型肝炎病毒(HBV)攜帶者肝癌發(fā)病率較高，HBV持續(xù)的慢性感染是導(dǎo)致肝癌發(fā) 生的主要原因，除了病毒自身以及環(huán)境因素外，遺傳因素在肝癌的發(fā)生也起到了重要作用。 目前國內(nèi)早期肝癌臨床篩查主要包括超聲檢查、甲胎蛋白檢查、CT檢查、PET-CT檢查、核磁 共振檢查等，這些方法都是建立在肝癌已經(jīng)發(fā)生的基礎(chǔ)上，如果能在肝癌還沒發(fā)生之前進(jìn) 行易感基因篩查，找出肝癌高危人群并采取積極有效的預(yù)防措施，可以極大程度的減少肝 癌的發(fā)生和死亡。
[0003] 人類白細(xì)胞抗原(HLA)是決定人類免疫遺傳功能的主要基因群，定位于第6染色體 短臂上(6p21.3)，全長(zhǎng)3600kb，可分為I、II、III類基因，其中HLA-QA屬于HLA-II類抗原。有 GWAS研究報(bào)道，HLA-DQ的rs9275319位點(diǎn)SNP和乙肝后肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。因此，通過對(duì) HLA-DQ基因rs9275319位點(diǎn)SNP的檢測(cè)，有助于肝癌的早期預(yù)測(cè)預(yù)防。
[0004] 檢測(cè)易感基因常見方法有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)、多重PCR、飛行質(zhì) 譜檢測(cè)、基因芯片、熒光定量PCR等方法。目前最簡(jiǎn)單的方法是限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合 酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)，該方法所需儀器簡(jiǎn)單，但操作復(fù)雜，樣本量大時(shí)容易造成PCR產(chǎn)物的 交叉污染并且容易出現(xiàn)酶切不充分或者酶切過度而出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果，可靠性低。 多重PCR方法雖然特異性有所提高，但是該方法的原理仍然是基于普通PCR原理，低引物特 異性以及低保真Taq酶等因素均可造成對(duì)結(jié)果的影響。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì) 譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)靈敏度高，準(zhǔn)確性有保障，適合大樣本量操作，但對(duì)SNP位點(diǎn)兩側(cè)序 列以及樣本質(zhì)量要求高，儀器也非常昂貴?；蛐酒m合高通量基因檢測(cè)，不合適幾個(gè)基 因的檢測(cè)。熒光定量PCR中高分辨率溶解曲線法是一種快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的分型方法， 但SNP分型以來于儀器溫度控制的精密性，假陽性高。熒光定量PCR中的Taqman探針的方法 采用特異性的熒光標(biāo)記的探針，特異性強(qiáng)，靈敏度高且操作方便，快速，但該方法探針、試劑 價(jià)格偏高，機(jī)器靈敏度高，對(duì)樣本質(zhì)量以及人員操作要求高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)HLA-DQ基因 rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的引物及檢測(cè)方法，可有效解決特異性和靈敏度不高，對(duì)樣品質(zhì)量要 求高的問題。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0007] 一種用于檢測(cè)HLA-DQ基因rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的引物，包括正向引物5'-CTTCCATGAACCTTACAG-3 ' 和反向引物5 ' -AAATGGCTACTTCCCTA-3 '。
[0008] 采用上述引物檢測(cè)HLA-DQ基因rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的方法，包括以下步驟：
[0009] (1)采集樣品并提取其基因組DNA;
[0010] (2)采用上述引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收；
[0011] (3)對(duì)膠回收產(chǎn)物進(jìn)行濃度測(cè)定，然后PCR擴(kuò)增并純化；
[0012] (4)將步驟（3)中的純化產(chǎn)物在3730型全自動(dòng)序列分析儀（美國Applied Biosystems公司）上樣，用Chromas軟件對(duì)SNP分型進(jìn)行分析。
[0013] 進(jìn)一步地，步驟(2)中PCR擴(kuò)增體系為:DNA模板含量為100-150ng，濃度為5pmol/yL 的正向引物3.0yL，濃度為5pmol/yL的反向引物3.0yL，Prime STAR MAX 25.0yL，用ddH20補(bǔ) 足體積至50uL。
[0014] 進(jìn)一步地，步驟(2)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95 °C預(yù)變性5min，95 °C變性30s，55 °C退 火15s，72°C延伸15s，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min后于4°C保存。
[0015] 進(jìn)一步地，步驟（3)中PCR擴(kuò)增體系為：DTCS Master Mix 2.5此，濃度為5pmol/yL 的反向引物1. OyL，DNA模板20ng，用ddH20補(bǔ)足體積至10yL。
[0016] 進(jìn)一步地，步驟(3)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性30s，94°C變性25s，55°C退 火25s，60°C延伸3min，30個(gè)循環(huán)，最后60°C延伸20min。
[0017]本發(fā)明提供的一種用于檢測(cè)HLA-DQ基因rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的引物及檢測(cè)方 法，具有以下有益效果：
[0018] (1)本發(fā)明提供了一種檢測(cè)HLA-DQ基因rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的引物，該引物特異 性好，準(zhǔn)確性好，實(shí)現(xiàn)了HLA-DQ基因rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率。
[0019] (2)本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)HLA-DQ基因rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的方法，通過使用 特異性的PCR擴(kuò)增引物，其檢測(cè)結(jié)果也具有特異性好，靈敏度高，準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，可以為肝 癌的疾病預(yù)防提供指導(dǎo)。
【附圖說明】
[0020]圖1為使用本發(fā)明引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳圖；
[0021]圖2為樣品的HLA-DQ基因rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果圖；
[0022]圖3為采用熒光探針法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】 [0023] 實(shí)施例1
[0024]針對(duì)HLA-DQ基因rs9275319位點(diǎn)設(shè)計(jì)了大量的引物，通過引物反應(yīng)條件的優(yōu)化和 比較，篩選出特異性好的一對(duì)引物，分別為HLA-DQ-F: 5'-CTTCCATGAACCTTACAG-3'（SEQ ID No: 1);HLA-DQ-R: 5 ' -AAATGGCTACTTCCCTA-3 '（SEQ ID No: 2)，該引物擴(kuò)增片段位于chr 1: 32698036-32698748,長(zhǎng)度為713,序列中R為突變堿基，具體序列見（SEQ ID No:3)。
[0025]使用該引物對(duì)待測(cè)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為:DNA模板ayL使其含量 為100-150ng，去離子水19-ayL，濃度為5pmol/iiL的正向引物3.0iiL，濃度為5pmol/iiL的反向 引物3.0yL，Primer STAR MAX 25.0yL;擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，55 °C退火15s，72°C延伸15s，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min后于4°C保存;將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂 糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，PCR產(chǎn)物大小與設(shè)計(jì)長(zhǎng)度吻合，且特異性好。
[0026] 實(shí)施例2 HLA-DQ基因rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的檢測(cè)
[0027] (1)提取EDTA抗凝外周血(肘靜脈血）的DNA樣品，提取方法參照血液基因組DNA提 取試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司）的說明書；
[0028] (2)對(duì)上述DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增采用Primer STAR MAX Premix(2X)(購 自北京天根生化科技有限公司），反應(yīng)體系如表1所示，引物濃度為5pm〇lAxL，模板DNA的量 為100-150ng，加入ayL(根據(jù)提取的DNA濃度計(jì)算），PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件見表2;PCR產(chǎn)物用2% 瓊脂糖凝膠電泳分離切膠、DNA膠回收試劑盒回收DNA;電泳參數(shù)為：電壓120V，400mA，時(shí)間 30min;膠回收方法參照膠回收試劑盒(購自TaKaRa)說明書；
[0029] 表1 PCR反應(yīng)體系
[0031] 表2 PCR反應(yīng)條件
[0033] (3)將回收后的產(chǎn)物測(cè)定其DNA濃度后，采用所述引物的正向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(熒 光標(biāo)記反應(yīng)），PCR反應(yīng)體系見表3,模板的量為20ng，根據(jù)純化后DNA的濃度計(jì)算后加入byL (根據(jù)提取的DNA濃度計(jì)算），PCR擴(kuò)增條件見表4;然后將濃度為3mol/L，pH值為5.2的醋酸鈉 緩沖液、〇 ? lmol/L，pH值為8 ? 0的Na2EDTA緩沖液和Glycogen以體積比為2:2:1配制終止液， 取5yL終止液加入到PCR產(chǎn)物中，然后用乙醇對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，具體純化步驟為:取5yL終止 液加入到PCR產(chǎn)物中充分混勻，離心，將液體轉(zhuǎn)移至一只新的1.5mL EP管中，然后加入50yL 預(yù)冷無水乙醇，充分混勾，放入冰箱-20°C冷凍lOmin后于12000r/min離心5min，棄去上清， 再向￡?管中加入150此預(yù)冷70%乙醇，放入高速離心機(jī)離心，1200〇1'/111；[11離心21]1；[11，棄去上 清，稍離心，用移液器吸干EP管內(nèi)剩余的液體，打開EP管蓋，室溫晾干至白色沉淀變透明，再 向EP管中加入25yL SLS(Sample Loading Solution)溶解DNA;
[0034] 表3 PCR反應(yīng)體系
[0038] (4)將純化產(chǎn)物點(diǎn)樣后裝入ABI3730全自動(dòng)序列分析儀，通過Chromas軟件，將所測(cè) 序列與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，尋找該SNP位點(diǎn)，通過該SNP位點(diǎn)處堿基的類型，就可以得到該 SNP位點(diǎn)的基因型，SNP分型結(jié)果如圖2 (具體見圖2-1，2-2，2-3)。
[0039] HLA-DQ rs9275319位點(diǎn)SNP易感基因型為AA和AG，非易感基因型為GG。由圖2-1可 知，該樣品的HLA-DQ rs9275319位點(diǎn)基因型為AA，說明該樣品的該位點(diǎn)基因型為易感基因 型。
[0040] 實(shí)施例3檢測(cè)肝癌易感基因SNP位點(diǎn)的特異性
[0041] 本檢測(cè)方法將特異性定義為測(cè)序結(jié)果峰圖無套峰、背景峰、雜峰、飄峰等現(xiàn)象。
[0042] 按照本發(fā)明提供的檢測(cè)方法對(duì)50個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)序峰圖單一，無雙峰、背景峰 等現(xiàn)象，50個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果均相同，峰圖結(jié)果見圖2,說明本發(fā)明提供的檢測(cè)方法特異性為 100%〇
[0043] 實(shí)施例4檢測(cè)肝癌易感基因SNP位點(diǎn)的靈敏度和準(zhǔn)確度
[0044] 本檢測(cè)方法將靈敏度定義為雜合子符合率。
[0045] 按照本發(fā)明提供的檢測(cè)方法對(duì)50個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用熒光探針法進(jìn)行驗(yàn) 證，兩種方法對(duì)50個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果一致，結(jié)果見圖3,說明本發(fā)明提供的檢測(cè)方法靈敏度 和準(zhǔn)確度高。
[0046] 實(shí)驗(yàn)例5檢測(cè)肝癌易感基因SNP位點(diǎn)的精密度
[0047] 本檢測(cè)方法將精密度定義為對(duì)多個(gè)樣品分別進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)后，結(jié)果一致。
[0048] 按照本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，重復(fù)檢測(cè)不同人員、不同時(shí)間和同一樣品不同孔間 的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果均一致，說明該檢測(cè)方法精密度為100%。
[0049] SEQUENCE LISTING <110>成都中創(chuàng)清科醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司 <120> -種用于檢測(cè)HLA-DQ棊因 rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的引物及檢測(cè)方法 'no、. 2016 <160> 3 < 17 0> Paten tin vers ion 3.3 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <400> 1 cttccatgaa ccttacag 18 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213>人工序列 <400> 2 aaalggciac Ucccla 17 <210> 3 <211> 713
[0050] <212：> DNA <213>人工序列 <400> 3
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)HLA-DQ基因 rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的引物，其特征在于，包括正向引物 5 ' -CTTCCATGAACCTTACAG-3 ' 和反向引物5 ' -AAATGGCTACTTCCCTA-3 '。2. 采用權(quán)利要求1中所述引物檢測(cè)HLA-DQ基因 rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 米集樣品并提取其基因組DNA; (2) 采用上述引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收； (3) 對(duì)膠回收產(chǎn)物進(jìn)行濃度測(cè)定，然后PCR擴(kuò)增并純化； (4) 將步驟(3)中的純化產(chǎn)物在序列分析儀上樣，然后對(duì)SNP分型進(jìn)行分析。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)HLA-DQ基因 rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的方法，其特征在于， 步驟(2)中PCR擴(kuò)增體系為:DNA模板含量為100-150ng，濃度為5pmolAiL的正向引物3.0yL， 濃度為5pmol/yL的反向引物3.0yL，Prime STAR MAX 25.0yL，用ddH20補(bǔ)足體積至50yL。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)HLA-DQ基因 rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的方法，其特征在于， 步驟（2)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，55°C退火15s，72°C延伸 15s，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min后于4°C保存。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)HLA-DQ基因 rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的方法，其特征在于， 步驟(3)中PCR擴(kuò)增體系為:DTCS Master Mix 2.5yL，濃度為5pmolAxL的反向引物l.OyL， DNA模板20ng，用ddH2〇補(bǔ)足體積至10yL。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)HLA-DQ基因 rs9275319位點(diǎn)多態(tài)性的方法，其特征在于， 步驟（3)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性30s，94°C變性258,55°(：退火258,60°(：延伸 3min，30個(gè)循環(huán)，最后60°C延伸20min。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105821145SQ201610363807
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年5月26日
【發(fā)明人】鄧銀, 張蓉, 陳思翔, 李江林
【申請(qǐng)人】成都中創(chuàng)清科醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司