一種檢測小麥赤霉病病原鐮刀菌的特異性引物、pcr檢測方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測小麥赤霉病病原鐮刀菌的特異性引物、PCR檢測方法及其應(yīng)用。本發(fā)明利用設(shè)計(jì)的小麥赤霉病致病鐮刀菌特異性引物對病原菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可從小麥赤霉病病原鐮刀菌中得到條帶單一的特異片段。本發(fā)明的檢測方法操作簡單，耗時(shí)少，通量大，可應(yīng)用于疑似患病的麥穗、種子中快速、準(zhǔn)確地檢測小麥赤霉病病原菌。
【專利說明】
一種檢測小麥赤霉病病原鐮刀菌的特異性引物、PCR檢測方法 及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于作物病害預(yù)警檢測及防治技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種分子快速檢測的方法與 應(yīng)用，具體涉及一種檢測小麥赤霉病病原鐮刀菌的特異性引物、PCR檢測方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥作為一種重要的糧食作物，全球種植廣泛。在我國，小麥?zhǔn)堑诙蠹Z食作物， 其種植面積與產(chǎn)量僅次于水稻，也是我國重要的商品糧和戰(zhàn)略性的主要糧食品種。小麥病 害的發(fā)生導(dǎo)致產(chǎn)量與品質(zhì)下降，給小麥的生產(chǎn)帶來很大的困難。小麥赤霉病（Fusarium head blight，F(xiàn)HB)是小麥生產(chǎn)中的三大病害之一，對小麥生產(chǎn)的影響巨大且分布廣泛，很 多國家的小麥產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，是一種世界性病害，尤其是溫暖潮濕的地區(qū)。赤霉病主要發(fā)生 在我國的中部及長江中下游地區(qū)，在長江中下游地區(qū)發(fā)病較重，由于耕作制度與氣候的變 化，小麥赤霉病的流行區(qū)域已開始向山東等北部地區(qū)轉(zhuǎn)移。小麥赤霉病的發(fā)生與流行帶來 了巨大的安全隱患，病原菌產(chǎn)生的毒素威脅著人畜的健康。
[0003]小麥赤霉病是由鐮刀菌屬(Fusarium. spp)引起的一種真菌性病害，病原菌包括禾 谷鐮刀菌（F. graminearum)、燕麥鐮刀菌（F. avenaceum)、黃色鐮刀菌（F. culmorum)、梨 孢鐮刀菌(F.poae)、雪腐鐮刀菌(F. nivale)，其中禾谷鐮刀菌是全世界范圍內(nèi)主要的致病 菌，也是我國小麥赤霉病的主要病原菌，禾谷鐮孢菌為致病優(yōu)勢種，約占94.5%。在生產(chǎn)上能 快速準(zhǔn)確地鑒定出小麥赤霉病致病菌對防治該病至關(guān)重要。對于小麥赤霉病的鑒定，傳統(tǒng) 的方法主要依據(jù)病原菌的形態(tài)特征，采集發(fā)病樣品，進(jìn)行組織分離，觀察致病菌的形態(tài)及產(chǎn) 孢方式等。由于形態(tài)鑒定的周期較長，步驟繁瑣，對于鐮刀菌的預(yù)警檢測以及生產(chǎn)上對于小 麥赤霉病的防治存在著一定的局限性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，分子鑒定被逐步 應(yīng)用在真菌的分類上。與傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法比較，分子鑒定簡單，快速，具有較高特異性 和靈敏性。用于鐮刀菌屬系統(tǒng)學(xué)研究的主要基因位點(diǎn)有0_加13111111，抑嫩，￡?-1€ [，這些靶標(biāo) 基因具有較高的物種特異性。但實(shí)際運(yùn)用中，以上方法對于鐮刀菌種間的鑒定也存在著一 定的局限性，不能將鐮刀菌鑒定到種。因而對于田間小麥赤霉病致病鐮刀菌的快速、準(zhǔn)確地 鑒定，需要針對鐮刀菌屬的特異性靶標(biāo)位點(diǎn)來開展。針對田間赤霉病的快速檢測，生產(chǎn)上存 在著不同的檢測方法與體系，但主要針對禾谷鐮刀菌單一致病菌，由于田間小麥赤霉病的 致病菌種類較多，因此需要一種能夠快速檢測出小麥赤霉病致病鐮刀菌的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的主要解決的問題是提供了一種檢測小麥赤霉病病原鐮刀菌的特異性引 物、PCR檢測方法及其應(yīng)用，本發(fā)明可以直接從發(fā)病的麥穗或帶菌的種子中檢測出小麥赤霉 病的致病鐮刀菌。所述小麥赤霉病致病菌分子快速檢測的方法應(yīng)用于田間小麥赤霉病的早 期診斷以及病菌的監(jiān)測和鑒定。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明提供了一種檢測小麥赤霉病病原鐮刀菌的特異性引物，所述引物的序列為： F1:5，-ATGGAATCGCTCTACGAGACTCTG-3，； R1:5 '-TCATTCTACTGTCTCGCGTCGACG-3 '。
[0006] 本發(fā)明還提供了利用所述的特異性引物檢測小麥赤霉病病原鐮刀菌的PCR檢測方 法，它包括以下步驟： (1) 分離小麥中的病原菌； (2) 提取病原菌的基因組DNA; (3) PCR反應(yīng)程序； (4) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過電泳分析，當(dāng)PCR產(chǎn)物呈現(xiàn)1655 bp條帶時(shí)，即檢測到赤霉病病 原鏡刀囷。
[0007] 進(jìn)一步的:所述步驟(1)中的病原菌取自小麥麥?；蛐←溔静〗M織。
[0008] 進(jìn)一步的：所述步驟（1)中分離病原菌的步驟為;切取小麥染病組織，置于乙醇中 浸泡，然后移入升汞溶液中浸泡，再轉(zhuǎn)移到無菌水中漂洗;最后將漂洗后的染病組織移至培 養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)3-5d。
[0009] 進(jìn)一步的：所述PCR反應(yīng)的體系為25yL，反應(yīng)液為：10Xbuffer 2.5yL，dNTP 1此， 引物F1 和R1 各 lyL，Taq酶 0 ? 5yL，DNA 模板 3yL，ddH20 16yL。
[0010] 進(jìn)一步的：所述PCR反應(yīng)的程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性45s，53°C退火 45s，72°C延伸lmin，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72°C總延伸lOmin。
[0011] 進(jìn)一步的：所述1655bp的序列如SEQ ID No:l所示。
[0012] 本發(fā)明還提供了所述的特異性引物在制備用于檢測小麥赤霉病病原鐮刀菌的試 劑中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及技術(shù)效果:本發(fā)明利用了鐮刀菌屬特異 性CYP51C基因（如SEQ ID No: 1所示)作為檢測靶標(biāo)，通過比對分析小麥赤霉病致病鐮刀菌 與其他鐮刀菌的CYP51C序列，設(shè)計(jì)一對特異性引物F1和R1，通過基本PCR操作，利用擴(kuò)增的 有無以及特異性條帶的大小來鑒定出小麥赤霉病病原的存在。通過本發(fā)明技術(shù)方案可以對 發(fā)病小麥進(jìn)行定性檢測，明確小麥赤霉病的存在及分布，為及時(shí)有效防治小麥赤霉病提供 理論依據(jù)。
[0014] 與已有的赤霉病鑒定方法比較，本發(fā)明的獨(dú)特之處在于： 1. 采用1對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，操作方法和體系較簡便； 2. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一條帶，結(jié)果特異，不需要多條帶鑒定病原菌； 3. 病原菌鑒定范圍較廣，并非針對一種致病菌，鑒定方法適用于田間小麥赤霉病多種 病原菌的鑒定； 4. 本發(fā)明檢測方法靈敏度較高，所需DNA較少，20ng DNA便可檢測到結(jié)果，確保從麥穗 中檢測出致病菌。
【附圖說明】
[0015]圖1是利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中M: DL2000 DNA Marker 1:禾谷鐮刀菌;2:燕麥鐮刀菌;3:腐皮鐮刀菌;4:尖孢鐮刀菌株;5:鏈格孢菌株； 圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中不同地區(qū)田間采集菌株的PCR擴(kuò)增結(jié)果，M: DL2000 DNA Marker，1-9菌株信息詳見表1; 圖3是本發(fā)明實(shí)施例3中麥粒0嫩的?0財(cái)廣增結(jié)果1:012000 0嫩1&^1?^，1-9菌株信息 詳見表1。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
[0017] -、已知菌株的PCR鑒定 1、囷株DNA提取 取禾谷鐮刀菌株、燕麥鐮刀菌株、腐皮鐮刀菌株、尖孢鐮刀菌株和鏈格孢菌株，上述菌 株為本實(shí)驗(yàn)室保存，也可以采用商品化的菌株。
[0018] 1)挑取上述5種菌株的菌絲于PDA培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)4d，利用CTAB法提取DNA; 2) 用滅菌牙簽刮取PDA平板上的少量病原菌菌絲，置于研缽中用液氮磨至粉狀，裝入 2.0 ml的離心管中； 3) 加入700 yl 2%的CTAB抽提液，將離心管置于65°C的水浴槽中，每隔lOmin振蕩混勻 一次，60min后取出，冷卻至室溫； 4) 加入等體積的酸與氯仿（1:1)，劇烈震蕩，充分混勾，室溫靜置2min，12000rpm，離心 15min； 5) 小心吸取上清，加入到新的1.5ml離心管中，再次加入等體積的酚與氯仿（1:1)，劇 烈震蕩，充分混勾，室溫靜置2min，12000rpm，離心15min; 6) 吸取上清與一新1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，將離心管慢慢上下?lián)u動(dòng)幾 次，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物，-20°C放置20min; 7) 常溫下12000rpm，離心15min，使DNA沉淀，棄上清，用70%的乙醇洗滌沉淀，輕輕轉(zhuǎn) 動(dòng)，用手指輕彈管底，7500rpm，室溫離心5min，棄去上清，室溫下晾干DNA; 8) 加入50 yl ddH20溶解，上清即為提取的DNA溶液，可用于PCR模板。
[0019] 2、設(shè)計(jì)致病鐮刀菌引物 根據(jù)鐮刀菌屬CYP51C基因序列，設(shè)計(jì)一對檢測赤霉病的特異性引物： 上游引物 Fl:5'_ ATGGAATCGCTCTACGAGACTCTG _3'（SEQ ID No:2); 下游引物 Rl:5'_ TCAITCTACTGTCTCGCGTCGACG-3'（SEQ ID No:3)。由北京擎科生物公 司合成。
[0020] 3、PCR 擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為25yL，反應(yīng)液為：10 X buf f er2 ? 5yL，dNTPlyL，引物(F1和R1)各lyL，Taq 酶0 ? 5yL，DNA 模板 lyL( 20ng)，ddH2018yL。
[0021] PCR擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性45s，57°C退火45s，72°C延伸lmin，進(jìn) 行35個(gè)循環(huán);72°C總延伸lOmin。
[0022] 4.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂凝膠中用1 XTAE buffer電泳分析，凝膠成像系統(tǒng)觀察 條帶大小。
[0023]結(jié)果鑒定:利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物，以已知菌株為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1 所示，1-2泳道擴(kuò)增出特異性條帶，3-5泳道擴(kuò)增不出特異性條帶，與已知結(jié)果符合(禾谷鐮 刀菌，燕麥鐮刀菌是小麥赤霉病的致病菌）。
[0024]二.不同地區(qū)田間采集菌株的PCR擴(kuò)增及鑒定結(jié)果 1.病原菌的分離 采用組織分離法對小麥赤霉病的病原菌進(jìn)行分離，田間采集菌株信息見表1。切取病健 交界處的病組織4_5mm的小塊，置于75%乙醇中浸泡5s，接著將病組織移入0.1%升汞溶液中 浸泡3-5min，再將病組織轉(zhuǎn)移到無菌水中漂洗3遍，最后將組織移到TOA培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿 放置25 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5d，菌落直徑3cm即可進(jìn)行DNA提取實(shí)驗(yàn)。
[0025] 2.病原菌基因組DNA少量提取(CTAB法）。
[0026] 3. PCR擴(kuò)增程序 選用致病鐮刀菌引物為： 上游引物 Fl:5'_ ATGGAATCGCTCTACGAGACTCTG -3'； 下游引物Rl:5'_ TCAITCTACTGTCTCGCGTCGACG-3'。由北京擎科生物公司合成。
[0027] PCR反應(yīng)體系為25yL，反應(yīng)液為：10 Xbuffer2.5yL，dNTPlyL，引物(F1和R1)各lyL， Taq酶0 ? 5yL，DNA模板lyL( 20ng)，ddH2018yL。
[0028] PCR擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性45s，57°C退火45s，72°C延伸lmin，進(jìn) 行35個(gè)循環(huán);72°C總延伸lOmin。
[0029] 4.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂凝膠中用1 XTAE buffer電泳分析，凝膠成像系統(tǒng)觀察 條帶大小。
[0030]結(jié)果鑒定:利用本發(fā)明的特異性引物，以不同地區(qū)田間采集菌株為模板，PCR擴(kuò)增 結(jié)果如圖2所示，1-9泳道擴(kuò)增出特異性條帶，擴(kuò)增的特異性條帶為CYP51C基因，其序列如 SEQ ID No: 1所示，與已知結(jié)果符合(禾谷鐮刀菌，燕麥鐮刀菌是小麥赤霉病的致病菌）。 [0031] 表1田間小麥菌株(麥粒)信息

三.麥粒的PCR擴(kuò)增及結(jié)果 1.麥粒DNA提取 小麥麥粒采集信息見表1，取病麥粒，用液氮凍干并研磨粉碎，用CTAB法提取DNA。
[0032] 2.PCR擴(kuò)增程序 致病鐮刀菌的特異性引物為： 上游引物 Fl:5'_ ATGGAATCGCTCTACGAGACTCTG -3'； 下游引物Rl:5'_ TCAITCTACTGTCTCGCGTCGACG-3'。由北京擎科生物公司合成。
[0033] PCR反應(yīng)體系為25yL，反應(yīng)液為：10 Xbuffer2.5yL，dNTPlyL，引物(F1和R1)各lyL， Taq酶0 ? 5yL，DNA模板3yL( 20ng)，ddH2016yL。
[0034] PCR擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性45s，57°C退火45s，72°C延伸lmin，進(jìn) 行35個(gè)循環(huán);72°C總延伸lOmin。
[0035] 3.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂凝膠中用1 XTAE buffer電泳分析，凝膠成像系統(tǒng)觀察 條帶大小。
[0036]結(jié)果鑒定:利用本發(fā)明的特異性引物，以不同地區(qū)田間采集發(fā)麥粒為模板，PCR擴(kuò) 增結(jié)果如圖3，1-9泳道擴(kuò)增出特異性條帶，與已知結(jié)果符合。
[0037]以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進(jìn)行限制；盡管參照前述實(shí) 施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實(shí)施 例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換;而這些修改或替 換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測小麥赤霉病病原鐮刀菌的特異性引物，其特征在于所述引物的序列為： FI:5，-ATGGAATCGCTCTACGAGACTCTG-3，； R1:5 '-TCATTCTACTGTCTCGCGTCGACG-3 '。2. 利用權(quán)利要求1所述的特異性引物檢測小麥赤霉病病原鐮刀菌的PCR檢測方法，其特 征在于它包括以下步驟： (1)分離小麥中的病原菌； (2 )提取病原菌的基因組DNA; (3) PCR反應(yīng)程序； (4) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過電泳分析，當(dāng)PCR產(chǎn)物呈現(xiàn)1655 bp條帶時(shí)，即檢測到赤霉病病 原鏡刀囷。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測小麥赤霉病病原鐮刀菌的PCR檢測方法，其特征在于:所 述步驟(1)中的病原菌取自小麥麥?；蛐←溔静〗M織。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測小麥赤霉病病原鐮刀菌的PCR檢測方法，其特征在于:所 述步驟（1)中分離病原菌的步驟為;切取小麥染病組織，置于乙醇中浸泡，然后移入升汞溶 液中浸泡，再轉(zhuǎn)移到無菌水中漂洗;最后將漂洗后的染病組織移至培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)3-5d〇5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測小麥赤霉病病原鐮刀菌的PCR檢測方法，其特征在于:所 述PCR反應(yīng)的體系為25yL，反應(yīng)液為：10 X buf f er 2.5yL，dNTP lyL，引物F1和R1各lyL，Taq 酶0.5yL，DNA 模板3yL，ddH20 16yL。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測小麥赤霉病病原鐮刀菌的PCR檢測方法，其特征在于:所 述PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性45s，53°C退火45s，72°C延伸lmin，進(jìn)行 35個(gè)循環(huán)；72°C總延伸lOmin。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測小麥赤霉病病原鐮刀菌的PCR檢測方法，其特征在于:所 述1655bp的序列如SEQ ID No:l所示。8. 權(quán)利要求1所述的特異性引物在制備用于檢測小麥赤霉病病原鐮刀菌的試劑中的應(yīng) 用。
【文檔編號】C12N15/11GK105821141SQ201610338167
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】黃金光, 錢恒偉, 遲夢宇, 孫曉梅, 趙穎
【申請人】青島農(nóng)業(yè)大學(xué)