一種基于核酸外切酶和核酸探針的電化學(xué)檢測(cè)特定單鏈dna濃度的方法
【專利摘要】一種基于核酸外切酶和核酸探針的電化學(xué)檢測(cè)特定單鏈DNA濃度的方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了兩種發(fā)夾型探針P1和P2。首先，用1,6?己二硫醇HDT將金納米顆粒修飾金電極，制備AuNPs?HDT?Au電極，然后將P1探針修飾到電極上。以特定單鏈目標(biāo)DNA作待檢測(cè)物，在沒(méi)有目標(biāo)DNA存在時(shí)，P1和P2探針能夠共存；在目標(biāo)DNA、P2探針和核酸外切酶ExoⅢ存在時(shí)，目標(biāo)DNA能觸發(fā)兩個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)循環(huán)。最后在血紅素存在時(shí)，保留在電極表面的P1探針的G?四鏈體序列和血紅素相互作用，產(chǎn)生強(qiáng)烈的電信號(hào)，用差分脈沖伏安法對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行檢測(cè)，峰電流信號(hào)與目標(biāo)DNA濃度之間在一定濃度范圍內(nèi)呈相關(guān)性，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA濃度的檢測(cè)。本發(fā)明方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】
一種基于核酸外切酶和核酸探針的電化學(xué)檢測(cè)特定單鏈DNA 濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于核酸外切酶和核酸探針輔助目標(biāo)循環(huán)放大的電化學(xué)檢測(cè)特 定單鏈DNA濃度的方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 對(duì)特定DNA或RNA序列（如腫瘤、糖尿病等疾病相關(guān)的易感基因或癌標(biāo)記物基因序 列）的檢測(cè)，在臨床診斷、疾病預(yù)防和治療等方面有十分重要的意義。比較傳統(tǒng)的DNA檢測(cè)方 法有酶法、化學(xué)降解法、隨機(jī)克隆法，現(xiàn)代的DNA檢測(cè)有熒光定量PCR、DNA自動(dòng)化測(cè)序、比色 法等，但這些方法存在一定的缺點(diǎn)，如酶法和化學(xué)降解法操作繁瑣、可能導(dǎo)致放射性污染、 效率低速度慢，后幾種方法需要昂貴的檢測(cè)儀器，耗時(shí)長(zhǎng)，樣品需要復(fù)雜的預(yù)處理、靈敏度 不高等。電化學(xué)DNA傳感器作為近幾十年發(fā)展起來(lái)的DNA分析檢測(cè)技術(shù)，由電化學(xué)輸出設(shè)備、 信號(hào)轉(zhuǎn)換元件和靈敏性的分子識(shí)別層三部分組成，因方法的高靈敏性、高選擇性、高效率等 優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用到眾多研究領(lǐng)域中來(lái)，成為DNA檢測(cè)的重要手段。
[0003] 因此完善和提高電化學(xué)DNA傳感器的靈敏度，開(kāi)發(fā)出高特異性、低檢測(cè)限的特定基 因序列的檢測(cè)方法在醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、食品、環(huán)境等諸多領(lǐng)域具有重要意義和廣泛的應(yīng)用 前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是將生物傳感技術(shù)、納米技術(shù)及信號(hào)放大技術(shù)相結(jié)合，以G-四鏈體-hemin作為信號(hào)放大策略，建立一種簡(jiǎn)單快捷而又具有高靈敏和高特異性的DNA檢測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案，一種基于核酸外切酶和專門(mén)設(shè)計(jì)的核酸探針的檢測(cè)特定單鏈 DNA序列的電化學(xué)方法，其設(shè)計(jì)合成了兩種特殊的核酸探針P1和P2，P1探針由三部分組成:1 區(qū)含有形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)的核酸序列，H區(qū)是目標(biāo)DNA的互補(bǔ)序列，HI:區(qū)和I區(qū)為互補(bǔ)序 列。P2探針也由三部分組成:IV區(qū)能和P1探針的3'端序列互補(bǔ)，并能被區(qū)雜交封閉，免區(qū) 含有和目標(biāo)DNA相同的堿基序列。將P1探針固定到金納米顆粒修飾的金電極表面；當(dāng)體系中 加入目標(biāo)DNA時(shí)，目標(biāo)DNA(TD)和P1探針發(fā)生雜交反應(yīng)形成P1-TD雜交雙鏈;此時(shí)游離的P1探 針的HI區(qū)和P2探針開(kāi)始雜交結(jié)合，使得P2逐漸取代目標(biāo)DNA，形成P1-P2雜交雙鏈而使目標(biāo) DNA釋放;ExoIII識(shí)別雜交的P1-P2鏈，并從P1的3 '端開(kāi)始識(shí)別切割，導(dǎo)致P2探針釋放;ExoHI 完成水解切割后僅剩P1探針的I區(qū)保留在電極表面形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，在血紅素hemin存在 時(shí)形成G-四鏈體-hemin復(fù)合物，G-四鏈體結(jié)構(gòu)與血紅素hemin共同作用產(chǎn)生電信號(hào)。目標(biāo) DNA濃度和產(chǎn)生的信號(hào)響應(yīng)之間存在線性相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的定量靈敏分析，具體 原理如圖1。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案:一種基于核酸外切酶和核酸探針的電化學(xué)檢測(cè)特定單鏈DNA 濃度的方法，包括如下步驟:金納米顆粒的制備;金納米顆粒修飾金電極的制備;將P1探針 固定到金納米顆粒修飾的金電極上;將不同濃度的特定單鏈目標(biāo)DNA、P2探針、核酸外切酶 ExoIII和固定在電極表面的P1探針混合雜交作用，包括:單鏈目標(biāo)DNA-簡(jiǎn)稱TD和P1探針的 M區(qū)發(fā)生雜交反應(yīng)形成P1-TD雜交雙鏈，P2探針取代TD序列和P1探針發(fā)生雜交反應(yīng)形成P1-P2雜交雙鏈，TD釋放并再次進(jìn)入雜交循環(huán)，E X〇HI識(shí)別P1-P2雜交雙鏈并水解切割雙鏈區(qū)的 P1探針使得線性的P2探針釋放出來(lái)再次進(jìn)入循環(huán);P1探針的I區(qū)保留在電極表面，在血紅素 hemin存在時(shí)形成G-四鏈體-hemin復(fù)合物，電化學(xué)法檢測(cè)響應(yīng)電流值； P1探針由三部分組成:1:區(qū)含有形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)的核酸序列，II區(qū)是目標(biāo)DNA的互補(bǔ) 序列，HI區(qū)和I區(qū)為互補(bǔ)序列； P2探針也由三部分組成區(qū)能和P1探針的3'端序列互補(bǔ)，并能被￥1區(qū)雜交封閉，￥ 區(qū)含有和目標(biāo)DNA相同的喊基序列。
[0007] 具體步驟如下： (1)金納米顆粒的制備:金納米顆粒的制備采用檸檬酸鈉還原法;將100 mL質(zhì)量濃度為 0.01%的HAuCl4溶液倒入三角燒瓶中，在500 rpm均勻攪拌下加熱煮沸;快速加入3.5 mL 1% 檸檬酸三鈉溶液;持續(xù)煮沸15 min，溶液顏色由灰色、轉(zhuǎn)藍(lán)色、轉(zhuǎn)紫色、轉(zhuǎn)紫紅色、轉(zhuǎn)酒紅色； 關(guān)閉熱源，繼續(xù)攪拌15-30 min冷卻至室溫，4°C避光保存； (2 )金納米顆粒修飾金電極： a、 金電極的預(yù)處理:將金電極在氧化鋁粉末上打磨；后依次在超純水、乙醇、超純水中 超聲清洗2-3 min;清洗結(jié)束后將金電極插入到0.5 M H2S〇4溶液中循環(huán)伏安法掃描活化，掃 描范圍從-0.4 V至+1.5 V，掃描速度100 mV/s，直到獲得穩(wěn)定的CV圖為止;將電極用超純水 沖洗并用氮?dú)獯蹈桑?b、 l ,6-己二硫醇HDT的自組裝:將上述預(yù)處理后的裸金電極浸沒(méi)于10 mM的1,6-己二硫 醇HDT溶液中，同時(shí)向溶液中通入氮?dú)?HDT分子在金電極表面自組裝3 h;得到的HDT-Au修 飾電極用乙醇和超純水充分清洗，每次4-6 min，氮?dú)獯蹈桑?c、 金納米顆粒的修飾:將HDT-Au電極插入到制備好的金納米顆粒溶液中溫育12h，結(jié)束 后用10 mM PBS、1 M NaCl和1 M MgCl2組成的pH7.2的清洗緩沖液清洗電極，并用氮?dú)獯?干，制得AuNPs-HDT-Au修飾電極； (3) P1探針的固定:將合成好的PI、P2探針用20 mM核酸儲(chǔ)存液溶解，-20°C冰箱中保藏； 將P1探針用核酸稀釋液稀釋;將100此、0.35 yM的發(fā)夾型P1探針溶液倒扣到AuNPs-HDT-Au 電極上，P1探針在電極表面的AuNPs上形成自組裝單分子層；用2 mM巰基己醇封閉電極2 h;用清洗緩沖液淋洗電極1 min，氮?dú)獯蹈纱茫?核酸儲(chǔ)存液為20 mM Tris-HCl，其中含有2 mM MgCl2、0.2 M NaCl和20 mM KC1，其pH 為 7.4; 核酸稀釋液為10 mM Tris-HCl，其中含有0.1 M NaCl、l mM EDTA和10 mM三(2-羧乙 基)膦11^?，其口11為7.4; (4) P1探針、目標(biāo)DNA以及P2探針之間的雜交和酶切反應(yīng);將修飾有P1探針的電極浸沒(méi) 到100 yL的反應(yīng)體系中，37°C溫育2 h; 所述反應(yīng)體系為:0.5 yM P2探針、不同濃度的特定單鏈目標(biāo)DNA、50 U的ExoIII和Exo KI酶緩沖液及20 mM Tris-HCr混合溶液； (5) G_四鏈體-hemin復(fù)合物的形成：向上述反應(yīng)體系中加入5 yL 20mM血紅素hemin和 95 yL 25 mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES緩沖液，該HEPES緩沖液含200 mM NaCl、20 mM KC1和1%二甲基亞砜DMSO，pH7.4，混勻;將反應(yīng)液繼續(xù)倒扣到電極上，室溫下1 h;用清洗緩 沖液沖洗電極30 s，用于電化學(xué)檢測(cè)； (6)電化學(xué)檢測(cè):采用三電極系統(tǒng)，上述金電極作為工作電極，Ag/AgCl作為參比電極， 鉑絲作為對(duì)電極;檢測(cè)前，電解液20 mM HEPES緩沖液，其中含20 mM KCl，pH7.4;先通入氮 氣30min; 檢測(cè)方法為差分脈沖伏安法DPV，掃描范圍-0.1~-0.6 V，振幅50 mV;取不同濃度的目 標(biāo)DNA，以步驟(1)-(5)同樣操作后對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，繪制峰電流和目標(biāo)DNA濃度的關(guān)系曲線。
[0008] 以K-ras原癌基因片段作為目標(biāo)DNA，簡(jiǎn)稱TD，其序列為:5 ' -TGGAGCTGGTGGCGTAGGCA-3，； 設(shè)計(jì)P1 探針序列為：5'-HS-(CH2)6-GGGTGGGCGGGATGGGT TACGCCACCA GCTCCA ACCCATCCTT-3,；
[0009] 本發(fā)明的有益效果:①構(gòu)建了一種具有極高靈敏度、高特異性的電化學(xué)DNA傳感 器，對(duì)特定目標(biāo)DNA序列的高靈敏檢測(cè)具有重要意義;②以G-四鏈體-hemin為信號(hào)放大標(biāo)記 實(shí)現(xiàn)了信號(hào)轉(zhuǎn)換和放大，通過(guò)合理的設(shè)計(jì)，將納米生物技術(shù)、電化學(xué)檢測(cè)等多領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)聯(lián) 合起來(lái)，大大提高了檢測(cè)的靈敏度。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1:基于ExoMI輔助目標(biāo)循環(huán)信號(hào)雙重放大的電化學(xué)檢測(cè)特定單鏈DNA原理圖。 [0011]圖2:不同濃度的目標(biāo)DNA存在下的DPV曲線圖。
[0012 ]圖3: DPV峰電流值與目標(biāo)DNA濃度關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0013] 圖4:目標(biāo)DNA和不同堿基錯(cuò)配DNA存在時(shí)峰電流變化直方圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下實(shí)施例中的P1、P2探針由上海生工生物工程有限公司合成，ExoIII和ExoIII酶 緩沖液購(gòu)自寶生物工程有限公司。
[0015] 實(shí)施例1. K-ras原癌基因片段作為待檢測(cè)的目標(biāo)DNA序列。
[0016] K-ras基因是位于12號(hào)染色體上長(zhǎng)約35 kb的原癌基因，該基因的表達(dá)能調(diào)控細(xì)胞 正常生長(zhǎng)。該基因發(fā)生突變將導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)異常，細(xì)胞過(guò)度增殖擴(kuò)散引發(fā)癌變。據(jù)統(tǒng)計(jì)胰腺 癌患者體內(nèi)K-ras基因發(fā)生突變的幾率高達(dá)90%-100%1-ras基因突變常發(fā)生在癌變?cè)缙冢?野生型的K-ras基因的第12號(hào)密碼子堿基是GGT，易突變?yōu)镚TT、GAT、GCT等突變型，GAT突變 型是其中最常見(jiàn)的突變類型可以作為表征胰腺癌的標(biāo)志，以該突變位點(diǎn)所在的基因片段為 檢測(cè)目標(biāo)序列開(kāi)發(fā)出靈敏的檢測(cè)方法對(duì)于胰腺癌的早期篩查具有十分重要的意義。
[0017]以K-ras原癌基因片段作為目標(biāo)DNA，檢測(cè)步驟同上所述。
[0018] 目標(biāo)DNA(TD)序列為：5'-TGGAGCTGGT GGCGTAGGCA-3'。
[0019] 設(shè)計(jì)P1 探針序列為：5'-HS-(CH2)6-GGGTGGGCGGGATGGGT TACGCCACCA GCTCCA ACCCATCCTT-3 '，P1探針的5 ' -端修飾巰基用以自組裝至金電極表面的金納米顆粒上。
[0020]設(shè)計(jì)P2探針序列為：5'-AAGGATGGG TGGAGCTGGTGGCGTAGGCA CTCCACCCATCC AGAC-3，。
[0021 ] 經(jīng)金納米顆粒的制備、金納米顆粒修飾金電極、PI探針固定至電極、PI探針與目標(biāo) DNA以及P2探針之間的雜交及ExoHI酶切反應(yīng)、G-四鏈體-hemin復(fù)合物形成后，所得電極作 為工作電極，用差分脈沖伏安法(DPV)進(jìn)行檢測(cè)；取不同濃度的目標(biāo)DNA，以步驟（1)-(5)同 樣的操作和試劑進(jìn)行反應(yīng)后，測(cè)定目標(biāo)DNA在不同濃度條件下的DPV曲線圖（圖2)。分析DPV 曲線中峰電流值與目標(biāo)DNA濃度之間的關(guān)系，繪制線性擬合曲線（圖3 )。隨著目標(biāo)DNA濃度的 增加，氧化峰電流信號(hào)也隨之增強(qiáng)，在目標(biāo)DNA濃度在50 fM到10 nM范圍內(nèi)，響應(yīng)電流與目 標(biāo)DNA濃度的對(duì)數(shù)呈線性相關(guān)，擬合曲線方程y=3.147+0.461ogx (x是目標(biāo)DNA的濃度/pM，y 是峰電流值/le_6A)，線性相關(guān)系數(shù)0.997。目標(biāo)DNA檢測(cè)限達(dá)到3.98 X 10-15 M。
[0022]實(shí)施例2.電化學(xué)DNA傳感器的特異性分析 仍然以上述K-ras原癌基因片段為例，用發(fā)生單堿基錯(cuò)配和三堿基錯(cuò)配的DNA取代原目 標(biāo)DNA參與雜交反應(yīng)，具體步驟同實(shí)施例1。
[0023]目標(biāo)DNA(TD)序列為：5'-TGGAGCTGGT GGCGTAGGCA-3' 單堿基錯(cuò)配序列為:5 ' -TGGAGCTG^T GGCGTAGGCA-3 ' 三堿基錯(cuò)配序列為:5 ' -TGGAGCTCCAGGCGTAGGCA-3 ' 比較目標(biāo)DNA、單堿基錯(cuò)配DNA、三堿基錯(cuò)配DNA三種不同DNA存在下的信號(hào)響應(yīng)。如圖4， 傳感器在識(shí)別目標(biāo)DNA的單堿基突變和三堿基突變序列上能產(chǎn)生很明顯的DPV信號(hào)強(qiáng)度對(duì) 比。相比較于完全配對(duì)的目標(biāo)DNA產(chǎn)生的信號(hào)增加(a)，單堿基(b)和三堿基錯(cuò)配(c)產(chǎn)生的 信號(hào)強(qiáng)度要低得多。完全配對(duì)的目標(biāo)DNA產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度是單堿基錯(cuò)配和三堿基錯(cuò)配的5倍 以上，從而驗(yàn)證了構(gòu)建的DNA傳感器能很好地辨別目標(biāo)DNA和突變序列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于核酸外切酶和核酸探針的電化學(xué)檢測(cè)特定單鏈DNA濃度的方法，其特征在 于包括如下步驟:金納米顆粒的制備;金納米顆粒修飾金電極的制備;將P1探針固定到金納 米顆粒修飾的金電極上;將不同濃度的特定單鏈目標(biāo)DNA、P2探針、核酸外切酶Ε Χ〇Π?和固 定在電極表面的Ρ1探針混合雜交作用，包括:單鏈目標(biāo)DNA-簡(jiǎn)稱TD和Ρ1探針的Η區(qū)發(fā)生雜 交反應(yīng)形成P1-TD雜交雙鏈，Ρ2探針取代TD序列和Ρ1探針發(fā)生雜交反應(yīng)形成Ρ1-Ρ2雜交雙 鏈，TD釋放并再次進(jìn)入雜交循環(huán)，Ε χ〇ΠΙ識(shí)別Ρ1-Ρ2雜交雙鏈并水解切割雙鏈區(qū)的Ρ1探針使 得線性的Ρ2探針釋放出來(lái)再次進(jìn)入循環(huán);Ρ1探針的I區(qū)保留在電極表面，在血紅素 hemin存 在時(shí)形成G-四鏈體-hemin復(fù)合物，電化學(xué)法檢測(cè)響應(yīng)電流值； P1探針由三部分組成:1區(qū)含有形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)的核酸序列，Η區(qū)是目標(biāo)DNA的互補(bǔ)序 列，UI區(qū)和I區(qū)為互補(bǔ)序列； Ρ2探針也由三部分組成：IV區(qū)能和Ρ1探針的3 '端序列互補(bǔ)，并能被ΥΙ區(qū)雜交封閉，V 區(qū)含有和目標(biāo)DNA相同的喊基序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于核酸外切酶和核酸探針的電化學(xué)檢測(cè)特定單鏈DNA濃度的 方法，其特征在于具體步驟如下： (1)金納米顆粒的制備:金納米顆粒的制備采用檸檬酸鈉還原法;將100 mL質(zhì)量濃度為 0.01%的HAuC14溶液倒入三角燒瓶中，在500 rpm均勻攪拌下加熱煮沸;快速加入3.5 mL 1% 檸檬酸三鈉溶液;持續(xù)煮沸15 min，溶液顏色由灰色、轉(zhuǎn)藍(lán)色、轉(zhuǎn)紫色、轉(zhuǎn)紫紅色、轉(zhuǎn)酒紅色； 關(guān)閉熱源，繼續(xù)攪拌15-30 min冷卻至室溫，4°C避光保存； (2 )金納米顆粒修飾金電極： a、 金電極的預(yù)處理:將金電極在氧化鋁粉末上打磨；后依次在超純水、乙醇、超純水中 超聲清洗2-3 min;清洗結(jié)束后將金電極插入到0.5 M H2S〇4溶液中循環(huán)伏安法掃描活化，掃 描范圍從-0.4 V至+1.5 V，掃描速度100 mV/s，直到獲得穩(wěn)定的CV圖為止;將電極用超純水 沖洗并用氮?dú)獯蹈桑? b、 l ,6-己二硫醇HDT的自組裝:將上述預(yù)處理后的裸金電極浸沒(méi)于10 mM的1,6-己二硫 醇HDT溶液中，同時(shí)向溶液中通入氮?dú)?HDT分子在金電極表面自組裝3 h;得到的HDT-Au修 飾電極用乙醇和超純水充分清洗，每次4-6 min，氮?dú)獯蹈桑? c、 金納米顆粒的修飾:將HDT-Au電極插入到制備好的金納米顆粒溶液中溫育12 h，結(jié) 束后用10 mM PBS、1 M NaCl和1 M MgCl2組成的pH7.2的清洗緩沖液清洗電極，并用氮?dú)獯?干，制得AuNPs-HDT-Au修飾電極； (3) P 1探針的固定:將合成好的P1、P2探針用20 mM核酸儲(chǔ)存液溶解，-20°C冰箱中保藏； 將P1探針用核酸稀釋液稀釋;將100 yL、0.35 μΜ的發(fā)夾型P1探針溶液倒扣到AuNPs-HDT-Au 電極上，P1探針在電極表面的AuNPs上形成自組裝單分子層；用2 mM巰基己醇封閉電極2 h;用清洗緩沖液淋洗電極1 min，氮?dú)獯蹈纱茫? 核酸儲(chǔ)存液為20 mM Tris-HCl，其中含有2 mM MgCl2、0.2 M NaCl和20 mM KC1，其pH為 7.4； 核酸稀釋液為10 mM Tris-HCl，其中含有0.1 M NaCl、l mM EDTA和10 mM三(2-羧乙 基)膦1^^?，其?!1為7.4; (4) P1探針、目標(biāo)DNA以及P2探針之間的雜交和酶切反應(yīng):將修飾有P1探針的電極浸沒(méi) 到100 yL的反應(yīng)體系中，37°C溫育2 h; 所述反應(yīng)體系為:0.5 μΜ P2探針、不同濃度的特定單鏈目標(biāo)DNA、50 U的ΕχοΠΙ和Exo Ε?酶緩沖液及20 mM Tris-HCl混合溶液； (5) G_四鏈體-hemin復(fù)合物的形成：向上述反應(yīng)體系中加入5 yL 20 mM血紅素 hemin 和95 yL 25 mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES緩沖液，該HEPES緩沖液含200 mM NaCl、20 mM KC1和1% DMSO，pH7.4，混勻;將反應(yīng)液繼續(xù)倒扣到電極上，室溫下1 h;用清洗緩沖液沖洗電 極30 s，用于電化學(xué)檢測(cè)； (6) 電化學(xué)檢測(cè)：采用三電極系統(tǒng)，上述金電極作為工作電極，Ag/AgCl作為參比電極， 鉑絲作為對(duì)電極;檢測(cè)前，電解液20 mM HEPES緩沖液，其中含20 mM KCl，pH7.4;先通入氮 氣30min; 檢測(cè)方法為差分脈沖伏安法DPV，掃描范圍-0.1~-0.6 V，振幅50 mV;取不同濃度的目 標(biāo)DNA，以步驟(1)-(5)同樣操作后對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，繪制峰電流和目標(biāo)DNA濃度的關(guān)系曲線。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述基于核酸外切酶和核酸探針的電化學(xué)檢測(cè)特定單鏈DNA濃度的 方法，其特征在于： 以K-ras原癌基因片段作為目標(biāo)DNA，簡(jiǎn)稱TD，其序列為：5 ' -TGGAGCTGGT GGCGTAGGCA- 3，；
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105821132SQ201610276057
【公開(kāi)日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年4月29日
【發(fā)明人】周楠迪, 王淑玲, 田亞平, 孫笑凡
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)