一種用于檢測甲狀腺癌易感性相關的snp位點的引物及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于檢測甲狀腺癌易感性相關的SNP位點的引物，包括BRAF基因rs113488022位點引物、MSH2基因rs2303428位點引物、MLHI基因rs63750447位點引物、MBIP基因rs116909374位點引物和XRCC1基因rs1799782位點引物。采用該引物檢測甲狀腺癌易感性相關SNP位點的方法，包括以下步驟：(1)采集樣品并提取DNA；(2)采用引物分別對目的片段序列進行PCR擴增；(3)對PCR產(chǎn)物進行純化，測定其濃度和純度；(4)純化產(chǎn)物測序，并對SNP分型結果進行分析。該引物特異性好、靈敏度高、準確性好，檢測方法簡單，可預測受檢者患甲狀腺癌易感風險大小。
【專利說明】
一種用于檢測甲狀腺癌易感性相關的SNP位點的引物及檢測 方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于檢測甲狀腺癌易感性相關的SNP位 點的引物及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 甲狀腺癌大約占所有惡性腫瘤的1 %，是內(nèi)分泌器官癌癥中發(fā)病率最高的一種，占 頭頸部惡性腫瘤發(fā)病率的首位。據(jù)國際癌癥學會資料統(tǒng)計，近年甲狀腺癌在全球發(fā)病率逐 年上升，每年增長約4%。我國的甲狀腺癌發(fā)病率在近30年來，也由約10/100萬上升到約30/ 100萬~40/100萬。甲狀腺癌成為備受關注的腫瘤之一，也是內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤領域的研究熱 點。甲狀腺癌和其它腫瘤一樣，其發(fā)生、惡性程度的改變可能與眾多癌基因、抑癌基因的突 變、激活、失活、缺失等相關。在多基因遺傳病中，遺傳基礎是由多基因構成的，它部分決定 了個體發(fā)病的風險，同時環(huán)境對多基因遺傳病產(chǎn)生較大影響，因此將遺傳因素和環(huán)境因素 共同作用決定個體患某種遺傳病的風險稱為遺傳易感性，疾病的遺傳易感性檢測已經(jīng)成為 全世界科學研究的熱點?；蜃鳛檫z傳物質是影響遺傳易感性的主要因素，因此對疾病相 關基因進行易感風險檢測可提前預知疾病的遺傳易感性，其中采用單核苷酸多態(tài)性(SNP) 作為基因組標志的關聯(lián)分析方法較常見，是理想的遺傳標志，它有遺傳穩(wěn)定性強，易于檢測 的特點。但可用于檢測甲狀腺癌易感風險的BRAF基因rsl 13488022位點、MSH2基因 rs2303428 位點、MLHI基因rs63750447 位點 MBIP基因rs 116909374 位點和 XRCC1基因 rsl799782位點及其各位點的引物并未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對于現(xiàn)有技術中存在的上述問題，本發(fā)明提供一種用于檢測甲狀腺癌易感性相 關的SNP位點的引物及檢測方法，可為甲狀腺癌相關基因多態(tài)性檢測提供可靠的結果，根據(jù) 檢測結果評估個體患甲狀腺癌的風險幾率，從而進行有效預防。
[0004] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：
[0005] -種用于檢測甲狀腺癌易感性相關的SNP位點的引物，包括BRAF基因rsll3488022 位點的引物、MSH2基因rs2303428位點的引物、MLHI基因rs63750447位點的引物、MBIP基因 rsll6909374位點的引物和XRCC1基因rsl799782位點的引物；
[0006] 其中，B R A F基因r s 1 1 3 4 8 8 0 2 2位點的上下游引物序列分別為5~ ATCTCACCTCATCCTAACAdlSEQ ID No:l)和S'-TGTGAATACTGGGAACTATG-SlSEQ ID No: 2)；
[0007] MSH2基因rs2303428位點的上下游引物序列分別為5Z-GGTATATTTGTCATGGCTTC-3' (SEQ ID No:3)和S'-TCTCACAGGACAGAGACATA-SlSEQ ID No:4);
[0008] MLHI基因rs63750447位點的上下游引物序列分別為5'-
[0009] TCTTATTCTGAGTCTCTCCAC-SlSEQIDNodWP
[0010] 3'-AGAGAGAAGATGCAAGTGAT-5' (SEQ ID No:6);
[0011] MBIP基因rsll6909374位點的上下游引物序列分別為5'-
[0012] GATAAACTCAAGGACCAAAC-SlSEQIDNoJWP
[0013] S'-CCTCTTGAGAAGGAAGTAAA-S7(SEQ ID No：8)；
[0014] XRCC1基因rsl799782位點的上下游引物序列分別為5'-
[0015] CTATCTATGGGACACAGAAT-SlSEQIDNoJWP
[0016] 37-CCTAATTCGACAATACTGAC-57(SEQ ID No：10)〇
[0017] 采用上述引物檢測甲狀腺癌易感性相關的SNP位點多態(tài)性的方法，包括以下步驟：
[0018] (1)采集樣品并提取其基因組DNA;
[0019] (2)采用所述的五種引物分別對目的片段進行PCR擴增，并對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊 脂糖凝膠電泳，電泳結果經(jīng)過凝膠成像儀觀察可見片段大小符合要求，無非特異條帶；
[0020] (3)對步驟(2)PCR產(chǎn)物采用磁珠法進行純化，將純化產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電 泳結果經(jīng)凝膠成像儀觀察可見單一、明亮的條帶，然后進行定量檢測；
[0021] (4)將步驟(3)中的純化產(chǎn)物采用ABI公司3730型測序儀測序，并對SNP分型結果進 行分析。
[0022]本發(fā)明提供的一種用于檢測甲狀腺癌易感性相關的SNP位點的引物及檢測方法， 具有以下幾種有益效果：
[0023] (1)本發(fā)明提供的引物可以實現(xiàn)特異性檢測，具有穩(wěn)定、特異性好的特點。
[0024] (2)本發(fā)明還提供了一種檢測甲狀腺癌易感性相關SNP位點的方法，該檢測方法簡 單，通過使用特異性的引物，對目的片段序列進行PCR擴增，然后通過測序可準確的測定人 甲狀腺癌易感基因中的多態(tài)性位點基因型，其檢測結果具有特異性好，靈敏度高，準確性好 等優(yōu)點，根據(jù)基因型結果預測受檢者患甲狀腺癌的風險幾率，并針對性地采取有效預防措 施進行預防，盡可能規(guī)避或者延遲疾病的發(fā)生，這對甲狀腺癌的預測和預防具有重大意義。
【附圖說明】
[0025] 圖1為不同受檢者血液DNA樣品在5種不同引物下的PCR擴增電泳圖；其中，1、2、3孔 為BRAF基因rsll3488022位點的引物擴增出的條帶;4、5、6孔為MSH2基因rs2303428位點的 弓丨物擴增出的條帶;7、8、9孔為MLHI基因rs63750447位點的引物擴增出的條帶；10、11、12孔 為MBIP基因rsl 16909374位點的引物擴增出的條帶；13、14、15孔為XRCC1基因rsl799782位 點的引物擴增出的條帶。
[0026] 圖2為BRAF基因rsll3488022位點的測序峰圖；
[0027] 圖3為MSH2基因rs2303428位點的測序峰圖；
[0028] 圖4為MLHI基因rs63750447位點的測序峰圖；
[0029] 圖5為MBIP基因rsll6909374位點的測序峰圖；
[0030] 圖6為XRCC1基因rsl799782位點的測序峰圖；
【具體實施方式】 [0031] 實施例1
[0032] 1、樣品的采集及其全基因組DNA的提取
[0033]用EDTA-K2抗凝管隨機采集健康人的外周血3.0mL(隨機選擇3個受檢者），根據(jù) TIANamp Blood DNA Kit試劑盒要求提取受檢者全基因組DNA，獲得的全基因組DNA使用超 微量蛋白核酸分析儀(柏精BioDropyLite)檢測其濃度以及純度，記錄原始數(shù)據(jù)，將濃度和 純度都達到要求的DNA置于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0034] 2、目的基因的PCR擴增、純化和測序
[0035] 用BRAF基因rsll3488022位點的引物、MSH2基因rs2303428位點的引物、MLHI基因 rs63750447位點的引物、MBIP基因rsl 16909374位點的引物和XRCC1基因rsl799782位點的 引物分別對所提取的DNA進行目的片段PCR擴增，反應體系為50yL，引物情況見表1，PCR反應 體系見表2所示；
[0036]表1引物名稱、序列及產(chǎn)物長度
[0038] 表2PCR反應體系
[0040] PCR 擴增程序為:95°C 預變性 10min，94°C 變性 158,54°(：退火158,72°(：延伸3〇8，進 行30個循環(huán)，最后72°C延伸30min，于4°C保存，過夜需放置_20°C冷凍；
[0041 ] PCR擴增結束后，取5yL擴增產(chǎn)物，1 %瓊脂糖凝膠電泳，電泳30min，染色20min，然 后將凝膠塊置于凝膠成像儀中觀察，電泳圖如圖1所示;PCR擴增程序結束后對產(chǎn)物進行純 化：采用Mag-Bind Oligonucleotide Purification Kit試劑盒，并按試劑盒要求進行操 作；
[0042] 上樣測序:采用ABI公司BigDye 3. lSequencing Kit試劑盒，并按試劑盒要求進行 操作；用ABI公司3730型測序儀進行測序；
[0043] 通過Chromas序列分析軟件，將測序結果與標準序列進行比對，尋找SNP位點，通過 分析SNP位點處堿基的類型，就可以得到SNP位點的基因型，SNP分型結果如圖2、圖3、圖4、圖 5和圖6所示。
[0044]結果分析：
[0045]由圖1可知，每個基因的引物擴增的條件相同，即它們的TM值(DNA的解鏈溫度）是 固定的，不會隨目的基因的序列不同而導致TM值不同，且擴增后的條帶單一且明顯，說明本 發(fā)明提供的引物特異性好。
[0046] BRAF基因rsll3488022位點的非易感基因型為TT，易感基因型為TC和CC，由圖2可 知，BRAF基因rsll3488022位點的基因型為TT，說明該樣品的該位點基因型為非易感基因 型。
[0047] MSH2基因rs2303428位點的非易感基因型為TT，易感基因型為TC和CC，由圖3可知， MSH2基因rs 2303428位點的基因型為CC，說明該樣品的該位點基因型為易感基因型。
[0048] MLHI基因rs63750447位點的非易感基因型為TT，易感基因型為TA和AA;由圖4可 知，MLHI基因r S63750447位點的基因型為AA，說明該樣品的該位點基因型為易感基因型。
[0049] MBIP基因rsll6909374位點的非易感基因型為CC，易感基因型為CT和TT;由圖5可 知，MBIP基因rsll6909374位點的基因型為CC，說明該樣品的該位點基因型為非易感基因 型。
[0050] XRCC1基因rsl799782位點的非易感基因型為CC，易感基因型為CT和TT;由圖6可 知，XRCC1基因rs 1799782位點的基因型為CT，說明該樣品的該位點基因型為易感基因型。
[0051] 本發(fā)明定義的測序穩(wěn)定性體現(xiàn)在測序結果上，測序結果直接與引物特異性、測序 模板純度、反應體系等有關，引物特異性好才會保證模板進行特異性的擴增，保證有可供測 序的模板，同時模板純度是測序準確性的保證，純度不高導致測序峰位很低甚至不能判讀 的情況，純度太高則會出現(xiàn)一段很高的峰位后突然降低的譜形，使測序長度變短;本發(fā)明提 供的引物及方法保證了測序穩(wěn)定，結果如圖2-6,峰位一致，無干擾峰，無重疊峰，充分體現(xiàn) 了測序穩(wěn)定，因此，通過本發(fā)明提供的基因相關位點SNP的檢測，判斷其確切基因型，能夠評 估個體患甲狀腺癌的風險幾率，從而對加強甲狀腺癌的預防具有重要的意義。
[0052] SEQUENCE LISTING <】10>成都中創(chuàng)清科醫(yī)學檢驗所有限公司 <120> ?種用于檢測甲狀腺癌易感性相關的SNP位點的引物及檢測力法 <130 2016 ，1K)、- 10 < 17(卜 PaLentln version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 -400 > 1 atctcaccte atcetaacac 2(1 <210> 2 <211> 20 <212> DMA <213>人工序列 <400> 2 igigaaiaci gggaacLalg 20 <210> 3 <211〉 20
[0053] <212> DNA <213> 人工序列 <400> 3 ggtatatttg tcatggettc 2.0 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <40()> 4 tctcacagga cagagacata 20 <210> 5 <2!1> 21 <212> DNA <213>人工序列 <400> 5 tcttattctg agtctctcea c 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <2B>人工序列
[0054] <400> 6 agagagaaga tgcaagtgat 20 <210> 7 、21 卜 20 <212> DNA <213>人丁序列 <400'> 7 gataaactca aggaccaaac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <400> 8 cctcttgaga aggaagtaaa 20 <21Q> 9 <21i> 20 <212> DNA <213 >人丁.序列 <400> 9 ctatctatgg gacacagaat 20
[0055] <21Q> 10 〇ll> 2(? <212> DNA <2:13>人工序列 <400> 10 cctaattcga caatactgac :2G
【主權項】
1. 一種用于檢測甲狀腺癌易感性相關的SNP位點的引物，其特征在于，所述引物包括 BRAF基因 rsl 13488022位點的引物、MSH2基因 rs2303428位點的引物、MLHI基因 rs63750447 位點的引物、MBIP基因 rsll6909374位點的引物和XRCC1基因 rsl799782位點的引物； 其中，B R A F基因 r s 1 1 3 4 8 8 0 2 2位點的上下游引物序列分別為V -ATCTCACCTCATCCTAACAC-3'和3' -TGTGAATACTGGGAACTATG-5'; MSH2基因 rs2303428位點的上下游引物序列分別為5'-GGTATATTTGTCATGGCTTC-3'和 3,-TCTCACAGGACAGAGACATA-5,； MLHI基因 rs63750447位點的上下游引物序列分別為S'-TCTTATTCTGAGTCTCTCCAC-S'和 3,-AGAGAGAAGATGCAAGTGAT-5,； MBIP基因^116909374位點的上下游引物序列分別為5/-6六了44六(：11^4664〇^44(：-3 /和 3,-CCTCTTGAGAAGGAAGTAAA-5,； XRCC1基因 rsl799782位點的上下游引物序列分別為S'-CTATCTATGGGACACAGAAT-S'和 3'-CCTAATTCGACAATACTGAC-5'。2. 采用權利要求1所述的引物檢測甲狀腺癌易感性相關的SNP位點多態(tài)性的方法，其特 征在于，包括以下步驟： (1) 米集樣品并提取其基因組DNA; (2) 采用所述的五種引物分別對五種目的片段序列進行PCR擴增，并對PCR擴增產(chǎn)物進 行瓊脂糖凝膠電泳； (3) 對步驟(2)PCR產(chǎn)物采用磁珠法進行純化，將純化產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并觀察， 然后進行定量檢測； (4) 將步驟(3)中的純化產(chǎn)物采用測序儀測序，并對SNP分型結果進行分析。3. 根據(jù)權利要求2所述的檢測甲狀腺癌易感性相關的SNP位點多態(tài)性的方法，其特征在 于，步驟（2)中PCR擴增體系為：Primer STAR Max 25yL、Primer F 3yL、Primer R 3yL、DNA 模板100_150ng，用ddH2〇補足體積至50yL。4. 根據(jù)權利要求2所述的檢測甲狀腺癌易感性相關的SNP位點多態(tài)性的方法，其特征在 于，步驟(2)中PCR擴增反應條件為:95 °C預變性1 Omin，94 °C變性15 s，54 °C退火15s，7 2 °C延 伸30s，進行30個循環(huán)，最后72°C延伸30min，于4°C保存。
【文檔編號】C12Q1/68GK105821144SQ201610357347
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】李江林, 張蓉, 劉月, 馬明
【申請人】成都中創(chuàng)清科醫(yī)學檢驗所有限公司