專利名稱：：牛capn1基因作為背最長肌嫩度分子標記的鑒定方法及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于動物基因工程
技術領域：
，具體涉及牛背最長肌嫩度相關基因CAPN1基因片段的克隆以及其在牛標記輔助選擇中的應用。
背景技術：
：有實驗證明(WickM等，JBiolChem，1999,279:1567—1582)，肌原纖維中主要蛋白的降解是肉品嫩度提高的根本原因，特別是Z盤的降解弱化，肌原纖維間聯(lián)結蛋白(結蛋白和聯(lián)結蛋白)、肌原纖維內(nèi)聯(lián)結蛋白(肌聯(lián)蛋白、伴肌動蛋白和肌f5蛋白-T)的降解造成肌原纖維片斷化，構成肌原纖維結構完整性的這些蛋白質(zhì)的降解是嫩化成熟的主要原因。也有實驗證實(KoomaraieM，#eat&/，1993，32:93-104)，鈣蛋白酶體系是導致蛋白質(zhì)降解、嫩度提高的關鍵酶。廖洪波等(廖洪波等，鈣蛋白酶和肉的成熟嫩化.肉類工業(yè).2003.8:27-29)認為，在宰后成熟的過程中鈣蛋白酶("/W7)的活性顯著下降。"/W/活性下降，則是其發(fā)揮水解作用的體現(xiàn)。PringleT.D等(PringleTD等，Calciumactivatedtenderizationofstriploin，topsirtoin，andtopsirloin,andtoproundsteaksindiversegenotypesofcattle.JTAnimSci，1999，77:3230-3237)用Angus和Brahman及其雜交牛為對象進行試驗，發(fā)現(xiàn)^/W7的活性與嫩度具有相關性。Page等(PageBT等,Evaluationofsingle-nucleotidepolymorphismsinCAPNlforassociationwithmeat,tendernessincattle.JAnimSci，2002，80(12):3077-3085)利用皮埃蒙特和安格斯牛的雜交后代種群作為研究對象，對^/W7基因進行SNP分析時發(fā)現(xiàn)，此基因中存在38個SNP位點，其中2個位點與肉的嫩度相關性極大，說明CAPN1基因序列的差異可能是產(chǎn)生同一物種相同肌肉間嫩度差異的主要原因。蔡欣等(蔡欣等，應用Nested和Touchdownper技術分離牦牛CAPN1大亞基基因EST.西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版)2005.33(2)14-18)應用Nested和TouchdownPCR技術分離牦牛6M月V2大亞基基因EST。分離到的牦牛C^W/基因EST序列與其他哺乳類對應序列具有較高的同源性，與奶牛、綿羊和豬的同源性分別為98%，96%和93%,與人和食蟹猴的同源性均為89%，該序列與偶蹄目動物對應序列的同源性較靈長類動物的高，可能在進化過程中更為保守。牦牛"/WJ部分編碼序列的分離與分析為牦牛a/Wi基因的進一步研究奠定了基礎。在今后的工作中，利用已獲得的EST序列，可以克隆牦牛C4/W/基因全長序列，進而進行此基因與牛肉嫩度相關性方面的分子遺傳標記研究。朱燕等(朱燕等，中國黃牛背最長肌中C4月WmRNA表達與嫩度的關系.南京農(nóng)業(yè)大學學報.2006.29(2):89-93)采用實時熒光定量PCR方法研究了中國黃牛背最長肌中CAPN1mRNA表達與嫩度的關系。結果表明，^尸7V7raRNA表達量與宰后第3天的牛肉嫩度高度相關(^=0.1855)。酪蛋白底物酶原分析表明，不同肌肉的CAPN1潛在酶活性存在很大差異。^/W7mRNA的表達可能是影響牛肉嫩度的主要因素。實驗還發(fā)現(xiàn)C^7W產(chǎn)生的降解條帶有一定的差別。表明C4/W/在不同黃牛個體中蛋白水平的表達也存在差異，從另一方面也證實了肉的嫩化主要酶可能是
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克隆牛背最長肌嫩度相關基因^PT^基因片段，尋找C4/^7基因的突變位點以及作為牛背最長肌嫩度相關基因的多態(tài)性檢測方法，為牛標記輔助育種提供一種有用的分子標記。本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)一種牛背最長肌嫩度相關基因"/W7的一部分DNA序列如表SEQIDN0:1所示。PCR擴增G4尸A7基因的目的片段全長為520bp，其序列如SEQIDNO:1所示。所獲得C4/W/基因片段的DNA下列中有如表SEQIDNO:1所述的A166-G166的堿基突變，導致尸wi"-RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)多態(tài)性的產(chǎn)生。一種篩選適用與牛背最長肌嫩度的分子標記的方法，按照以下步驟制備利用NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,美國國家生物技術信息中心)中牛a/^/基因DNA序列為參照，設計特異性引物一對，正向弓|物CAPN1E14F:5、-MGGTGACTTTGTGCTGCGTTTCT-3'和反向引物CAPN1E14R:5、-CTGCTGCGTGACCTTGGGTAAAT-3、。從牛血液中提取基因組DNA，進行PCR擴增、PCR產(chǎn)物的純化和克隆測序。由于PCR產(chǎn)物片段的DNA序列第166位存在A-G的堿基突變，導致RFLP多態(tài)性的產(chǎn)生，利用限制性內(nèi)切酶可進行此突變位點的檢測。將檢測結果所示的不同基因型與牛背最長肌嫩度關聯(lián)分析，從而為牛的標記輔助選擇提供分子標記及其應用。以下對本發(fā)明作詳細的描述5一、牛背最長肌嫩度相關基因a/W7基因片段的克隆1.引物設計及PCR反應利用NCBI中的牛C4/W7基因DNA序列(登錄號AF252504S2)為模板，利用生物學軟件01igo6.0設計一對特異性引物。建立PCR反應條件，具體情況如下CAPN1E14F:5'-MGGTGACTTTGTGCTGCGTTTCT-3'(正向引物)CAPN1E14R:5、-CTGCTGCGTGACCTTGGGTAMT-3、(反向引物)PCR反應體系為10XPCRBuffer(購自天根生化科技有限公司)3.0ul，dNTPs(購自北京鼎國生物技術公司，濃度為2.5mM)0.8ul，正向引物與反向引物(濃度為均為10pmol/u1)各0.4ul，Taq酶(購自天根生化科技有限公司，濃度為2.5U/u1)0.4yl，基因組DNA0.5ul(含10-30ngDNA)，四餾水24.5u1。PCR反應條件為94'C預變性5分鐘，94'C變性40秒，6CTC退火40秒，72'C延伸40秒，共35'個循環(huán)，72'C最后延伸5分鐘。2.PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測序(1)PCR產(chǎn)物的純化在本發(fā)明中，為達到高速、高校的回收效果，使用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒(購自AXYGEN公司，操作過程中所需的所有液體均由試劑盒內(nèi)提供)進行凝膠的純化和回收，按照該試劑盒說明書操作，步驟如下在紫外光下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的膠塊，放入1.5mlEpendorff管中，并按100mg膠塊400ul計算出膠塊體積；加入已切下的膠塊體積的3倍量的BufferDE-A，混合均勻后于75。C加熱至膠塊完全熔化成液體；加入己切下的膠塊體積的0.5倍量的BufferDE-B，混合均勻；將所有液體轉(zhuǎn)移至已經(jīng)嵌入2ml離心管的DNA制備管中(2ml離心管和DNA制備管中均由試劑盒內(nèi)提供)，12000g離心l分鐘；棄去濾液，將制備管重新放回2ml離心管中，加入500ulBufferWl，12000g離心30秒；棄去濾液，將制備管重新放回2ml離心管中，加入70。ulBufferW2，12000g離心30秒；棄去濾液，將制備管重新放回2ml離心管中，加入700ii1BufferW2，12000g離心l分鐘；棄去濾液，將制備管重新放回2ml離心管中，12000g離心1分鐘；將制備管放入一個新的1.5mlEpendorff管中，在制備膜中央加入25u1Eluent溶液，靜置1分鐘，12000g離心1分鐘洗脫回收PCR產(chǎn)物。(2)連接為保證良好的連接效果，本發(fā)明將回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體(購自Takara公司)進行連接，反應總體系為10u1，其中包括1ulpMD18-T載體，3ulPCR產(chǎn)物，lul四餾水，5ulSolutionI，16。C連接12小時。(3)轉(zhuǎn)化并測序在無菌條件下，取150ul感受態(tài)細胞于1.5mlEpendorff管中，加入連接產(chǎn)物并混合均勻，在冰水混合物中放置30分鐘后放入42。C水浴中90秒，取出后再放入冰水混合物中5分鐘，加入400y1無AMP(氨芐青霉素)的LB液體培養(yǎng)基，37。C震蕩l小時，取100ul均勻涂布于含AMP的LB固體培養(yǎng)基上，37X:平放1小時帶菌液全部被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)12-16小時。挑取單克隆，經(jīng)鑒定為陽性的送交測序公司進行測序。二、RLFP診斷方法的建立用引物CAPN1E14F和CAPN1E1犯擴增?；蚪MDNA得到520bp的特異擴增片段(SEQIDN0:1)。測序結果發(fā)現(xiàn)，在該520bp片段中，由于第166bp處存在A—G的突變，從而導致/^w/酶切位點(R*GATCY)的產(chǎn)生，其中，164-165bp間為尸577/酶的多態(tài)性切點。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)尸sw/酶切產(chǎn)生三種基因型，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳可明顯判別不同帶型。其中AA型只有520bp—條帶，AG型含有520bp,165bp，355bp三條帶，GG型有165bp和355bp兩條帶(圖2)。三、標記性狀關聯(lián)分析利用申請人與吉林省長春市皓月清真肉業(yè)集團股份有限公司合作的實驗群體為實驗對象進行性狀關聯(lián)分析，利用SPSS12.0軟件，建立如下模型進行性狀關聯(lián)分析統(tǒng)計分析模型為Yi二u+Gj+ei。其中，Y,為被觀測個體的生產(chǎn)性能表型值，"為生產(chǎn)性能的最小二乘均值，Gj為基因型對生產(chǎn)性能的效應值，ei為對應于觀察值的隨機殘差。本發(fā)明的效果是如下1、牛^/^7基因部分DNA序列的克隆PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示為特異性PCR產(chǎn)物，如圖1所示。將PCR產(chǎn)物回收測序，結果顯示產(chǎn)物長度為520bp。測序結果顯示該片段166bp處存在A、G兩個等位基因，部分測序峰圖如圖3所示。2、針對牛6M/W/基因部分DNA片段PCR-RFLP診斷方法的建立用本發(fā)明設計的特異性引物擴增?；蚪MDNA得到的520bp特異擴增片段。測序的結果發(fā)現(xiàn)在該520bp片段存在Ps"/酶切位點(R*GATCY)，其中第164-165bp處為酶切位點。擴增產(chǎn)物經(jīng)過限制性內(nèi)切酶尸sw/酶切可產(chǎn)生三種基因型，即AA型、AG型和GG型，具體圖片如圖2所示。3、對標記性狀進行關聯(lián)分析本發(fā)明中牛CAPN1基因的擴增序列Psul-RFLP多態(tài)位點與牛背最長肌嫩度的關聯(lián)分析，基因型檢測結果表明，在138個體中，AA型個體有44個，AG型個體有64個，GG型個體有30個。不同基因型個體的背最長肌剪切力(通過測量剪切力，可評價肉的嫩度。剪切力值高，嫩度低；剪切力值低，嫩度高)之間顯著差異分析結果(最小二乘值和標準誤)見表l。表l不同基因型個體剪切力之間顯著差異分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注表中最小二乘均值土標準誤肩標帶有不同字母表示差異極顯著(P<0.01)分析結果表明，此酶切位點不同基因型所對應的個體的背最長肌剪切力存在極顯著的差異，AA型個體的剪切力極顯著低于AG型和GG型(P<0.01)，AG型個體極顯著低于GG型(P〈O.OD，A等位基因是有利于牛背最長肌嫩度的有利標記。圖1是CAPN1基因擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。其中M泳道為標準分子量Marker,1-9泳道為被檢測的9個PCR產(chǎn)物。圖2是2%瓊脂糖凝膠電泳檢測Q/W7基因擴增產(chǎn)物的/^z/J酶切結果。其中M泳道為標準分子量Marker。圖3是本發(fā)明擴增的C4/W7基因部分DNA序列中突變位置的克隆測序峰圖。圖4是實施例1中PCR擴增產(chǎn)物的1.5%瓊脂糖凝膠檢測結果。其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1-6為被檢測的PCR產(chǎn)物。圖5是實施例1中酶切反應產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠檢測結果。其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1-6為被檢測的酶切產(chǎn)物。圖6是實施例2中PCR擴增產(chǎn)物的1.5%瓊脂糖凝膠檢測結果。其中M泳道為標準分子量Marker,泳道卜IO為被檢測的PCR產(chǎn)物。圖7是實施例2中酶切反應產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠檢測結果。其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1-10為被檢測的酶切產(chǎn)物。圖8是實施例3中PCR擴增產(chǎn)物的1.5%瓊脂糖凝膠檢測結果。其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1-9為被檢測的PCR產(chǎn)物。圖9是實施例3中酶切反應產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠檢測結果。其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1-9為被檢測的酶切產(chǎn)物。具體實施例方式為了更清楚地理解本發(fā)明，用具體實施方式詳細描述具體內(nèi)容。本發(fā)明利用已公布的C^W7基因序列和提取的?；蚪MDNA，設計特異性引物一對，克隆包括全部第14外顯子的部分DNA序列，利用PCR-RFLP方法，使用限制性內(nèi)切酶尸si/J對PCR擴增反應產(chǎn)物進行酶切。將酶切結果分型并將不同基因型與背最長肌剪切力關聯(lián)，為牛的標記輔助選擇提供分子標記。一、牛C4/W2基因部分DNA片段的克隆1引物設計以牛CJ/WJ基因DNA序列為參照，NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation，美國國家生物技術信息中心)收錄號為AF252504S2，利用01igo6.0軟件設計特異性引物1對，為保證良好的引物質(zhì)量，在本發(fā)明中，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，擴增產(chǎn)物長度為520bp，引物序列如下所示CAPN1E14F:5、-AAGGTGACTTTGTGCTGCGTTTCT-3、(正向引物)CAPN1E14R:5、-CTGCTGCGTGACCTTGGGTAMT-3、(反向引物)PCR反應體系為10XPCRBuffer(購自天根生化科技有限公司)3.0ul,dNTPs(購自北京鼎國生物技術公司，濃度為2.5mM)0.8ul，正向引物與反向引物(濃度為均為lOpraol/lil)各0.4ul，Taq酶(購自天根生化科技有限公司，濃度為2.5U/u1)0.4ixl，基因組DNA0.5ul(含10-30ngDNA)，四餾水24.5u1。PCR反應條件為94。C預變性5分鐘，94'C變性40秒，6(TC退火40秒，72"C延伸40秒，共35個循環(huán)，72"C最后延伸5分鐘。2.PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測序(l)PCR產(chǎn)物的純化在本發(fā)明中，為達到高速、高校的回收效果，使用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒(購自AXYGEN公司，操作過程中所需的所有液體均由試劑盒內(nèi)提供)進行凝膠的純化和回收，按照該試劑盒說明書操作，具體步驟如下在紫外光下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的膠塊，并稱取膠塊質(zhì)量，然后放入1.5mlEpendorff管中，按100mg膠塊=100u1計算出膠塊體積；加入已切下的膠塊體積的3倍量的BufferDE-A，混合均勻后于75。C加熱至膠塊完全熔化成液體；加入已切下的膠塊體積的O.5倍量的BufferDE-B，混合均勻；將所有液體轉(zhuǎn)移至已經(jīng)嵌入2ml離心管的DNA制備管中(2ml離心管和DNA制備管由試劑盒內(nèi)提供)，12000g離心l分鐘；棄去濾液，將制備管重新放回2ml離心管中，加入500ix1BufferWl，12000g離心30秒；棄去濾液，將制備管重新放回2ml離心管中，加入700p1BufferW2，12000g離心30秒；棄去濾液，將制備管重新放回2ml離心管中，加入700u1BufferW2，12000g離心1分鐘；棄去濾液，將制備管重新放回2ml離心管中，12000g離心l分鐘；將制備管放入一個新的1.5mlEpendorff管中，在制備膜中央加入25U1Eluent溶液，靜置1分鐘，12000g離心1分鐘洗脫回收PCR產(chǎn)物。(2)連接為保證良好的連接效果，本發(fā)明將回收的PCR產(chǎn)物用pMD18-T載體試劑盒(購自Takara公司)進行連接，反應總體系為10ul，其中包括1.0ylpMD18-T載體，3.0ulPCR產(chǎn)物，l.Oul四餾水，5.0ylSolution工，16'C連接12小時。(3)轉(zhuǎn)化在無菌條件下，取150yl感受態(tài)細胞于1.5mlEpendorff管中，加入已連接12小時的連接產(chǎn)物并混合均勻，在冰水混合物中放置30分鐘后放入42'C水浴中90秒，取出后再放入冰水混合物中5分鐘，加入400yl無AMP(氨芐青霉素)的LB液體培養(yǎng)基，37r震蕩l小時，取100ul均勻涂布于含AMP的LB固體培養(yǎng)基上，37t:平放l小時后，待菌液全部被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)12-16小時。培養(yǎng)結束后挑取單克隆，經(jīng)鑒定為陽性的送交上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。二、PCR-RFLP方法的建立1、PCR產(chǎn)物的檢測用本發(fā)明設計的引物CAPN1E14F和CAPN1R14R對?；蚪MDNA擴增得到5'20bp的特異性擴增產(chǎn)物，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示為特異性PCR產(chǎn)物，見圖1，其中M泳道為標準分子量Marker,1_9泳道為被檢測的9個PCR產(chǎn)物。2、針對牛C4尸7W基因部分DNA片段PCR-RFLP診斷方法的建立用本發(fā)明設計的特異性引物擴增?；蚪MDNA得到的520bp特異擴增片段。測序的結果發(fā)現(xiàn)在該520bp片段存在尸^/酶切位點(R*GATCY)，其中第164-165bp處為酶切位點。擴增產(chǎn)物經(jīng)過限制性內(nèi)切酶/^//酶切可產(chǎn)生三種基因型，即AA型、AG型和GG型，具體圖片如圖2所示。限制性內(nèi)切酶/^;/可自行選擇。本發(fā)明中為達到高效、高速的效果，選用BioBasicInc.(BBI公司)的尸sw/內(nèi)切酶。PCR產(chǎn)物酶切反應體系為15y1,其中10XBufferW[由內(nèi)切酶包裝盒中提供，含lOmMTris-HC1(PH8.0),10mMMgCl2，lOOmMNaCl，IraMDTT]1.5u1,PCR產(chǎn)物5u1，限制性內(nèi)切酶1.0y1(總量10U)，四餾水7.5u1，將樣品混合均勻后37'C恒溫水浴5小時。恒溫水浴結束后，取8ul酶切產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型檢測結果。由于PCR產(chǎn)物片段的DNA序列中存在A-G的堿基突變，導致尸犯J-RFLP多態(tài)性的產(chǎn)生，利用限制性內(nèi)切酶尸^/可進行此突變位點的檢測。用引物CAPN1E14F和CAPN1E14R擴增?；蚪MDNA得到520bp的特異擴增片段(圖l)。164-165bp間為戶幼/酶的多態(tài)性切點(R*GATCY)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)尸sy/酶切產(chǎn)生三種基因型，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳可明顯判別不同帶型。其中AA型只有520bp—條帶，AG型含有520bp，165bp，355bp三條帶，GG型有165bp和355bp兩條帶(圖2)。三、標記性狀關聯(lián)分析利用申請人與吉林省長春市皓月清真肉業(yè)集團股份有限公司合作的實驗群13體為實驗對象進行性狀關聯(lián)分析，利用SPSS12.0軟件，建立如下模型進行性狀關聯(lián)分析統(tǒng)計分析模型為Y^y+Gj+ei。其中，Yi為被觀測個體的生產(chǎn)性能表型值，n為生產(chǎn)性能的最小二乘均值，Gj為基因型對生產(chǎn)性能的效應值，^為對應于觀察值的隨機殘差。本發(fā)明中牛CAPN1基因的擴增序列PsuI-RFLP多態(tài)位點與牛背最長肌嫩度的關聯(lián)分析，基因型檢測結果表明，在138個體中，AA型個體有44個，AG型個體有64個，GG型個體有30個。不同基因型與剪切力之間顯著差異分析結果(最小二乘值和標準誤)見表2。分析結果表明，此酶切位點不同基因型所對應的個體，其背最長肌剪切力存在極顯著的差異，AA型個體的剪切力極顯著低于AG型和GG型(P〈0.01)，AG型個體極顯著低于GG型(P<0.01)，A等位基因是有利于牛背最長肌嫩度的有利標記。表2不同基因型個體剪切力之間顯著差異分析結果基因型個體數(shù)最小二乘均值士標準誤AA444.1764548±0.08242402AAG644.7370381±0.11381620BGG305.5096146±0.24605115e注表中最小二乘均值士標準誤肩標帶有不同字母表示差異極顯著(P〈0.01)實施例1在中國吉林省長春市皓月清真肉業(yè)集團股份有限公司的肉牛群體中隨機選定六個待屠宰個體，在屠宰時采集血液進行基因組DNA的提取并測定其背最長肌的剪切力。提取的基因組DNA經(jīng)分光光度儀測定，濃度為36.54ug/ml,0D260/0D280Ratio為1.824。利用本發(fā)明設計的引物、PCR反應體系和條件進14行PCR擴增。PCR反應體系為10XPCRBuffer(購自天根生化科技有限公司)3.0ul，dNTPs(購自北京鼎國生物技術公司，濃度為2.5mM)0.8nl，正向引物與反向引物(濃度為均為10pmol/ul)各O.4ul，Taq酶(購自天根生化科技有限公司，濃度為2.5U/ul)0.4ul,基因組DNA0.5ul(含18.27ngDNA)，四餾水24.5u1。PCR反應條件為94。C預變性5分鐘，94。C變性40秒，6(TC退火40秒，72'C延伸40秒，共35個循環(huán)，72'C最后延伸5分鐘。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示為特異性PCR產(chǎn)物。如圖4所示，其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1-6為被檢測的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物按本發(fā)明設計的RFLP方法進行酶切反應。PCR產(chǎn)物酶切反應體系為15u1，其中10XBuffer1.5lU，PCR產(chǎn)物5u1，限制性內(nèi)切酶A"/1.0y1(10U/"l)，四餾水7.5til。將樣品混合均勻后，37'C恒溫水浴5小時。為提高酶切反應效率，可每隔1小時將反應管取出，將部分蒸發(fā)的液體輕甩到管底部。酶切反應結束后，取5ul酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，具體基因型如圖5所示。如圖5所示，其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1_6為被檢測的酶切產(chǎn)物。經(jīng)鑒定，個體l、4屬于AG型，個體2、3屬于GG型，個體5-6屬于AA型。此六個個體的背最長肌剪切力見表3。表3實施例1中抽取的個體性狀測量值<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>以此六個屠宰個體為實驗對象進行性狀關聯(lián)分析，利用SPSS12.0軟件，建立如下模型進行性狀關聯(lián)分析統(tǒng)計分析模型為Y產(chǎn)U+Gj+^。其中，Yi為被觀測個體的生產(chǎn)性能表型值，"為生產(chǎn)性能的最小二乘均值，Gj為基因型對生產(chǎn)性能的效應值，ei為對應于觀察值的隨機殘差?；蛐蜋z測結果表明，在此六頭個體中，M型個體有2個，AG型個體有2個，GG型個體有2個。不同基因型與剪切力之間顯著差異分析結果(最小二乘值和標準誤)見表4。分析結果表明，此酶切位點不同基因型所對應的個體，其背最長肌剪切力存在極顯著的差異，AA型個體的剪切力極顯著低于AG型和GG型(P<0.01)，AG型個體極顯著低于GG型(P<0.01)。表4不同基因型個體剪切力之間顯著差異分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注表中最小二乘均值士標準誤肩標帶有不同字母表示差異極顯著(P<0.01)在中國吉林省長春市皓月清真肉業(yè)集團股份有限公司的肉牛群體中隨機選定十個待屠宰個體，在屠宰時采集血液進行基因組DNA的提取并測定其背最長肌的剪切力。提取的基因組DNA經(jīng)分光光度儀測定，濃度為34.54ug/ml，OD260/OD280Ratio為1.794。利用本發(fā)明設計的引物、PCR反應體系和條件進行PCR擴增。PCR反應體系為10XPCRBuffer(購自天根生化科技有限公司)3.0ul,dNTPs(購自北京鼎國生物技術公司，濃度為2.5mM)0.8ul，正向引物與反向引物(濃度為均為10pmol/ul)各0.4ul,Taq酶(購自天根生化科技有限公司，濃度為2.5U/nl)0.4nl，基因組DNA0.5u1(含17.27ngDNA)，四餾水24.5u1。PCR反應條件為94。C預變性5分鐘，94。C變性40秒，60。C退火40秒，72。C延伸40秒，共35個循環(huán)，72"最后延伸5分鐘。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示為特異性PCR產(chǎn)物。如圖6所示，其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1為被檢測的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物按本發(fā)明設計的RFLP方法進行酶切反應。PCR產(chǎn)物酶切反應體系為15Pl，其中10XBufferl.5u1，PCR產(chǎn)物5ti1，限制性內(nèi)切酶尸犯/1.0u1(10U/y1)，四餾水7.5ul。將樣品混合均勻后，37r恒溫水浴5小時。為提高酶切反應效率，可每隔1小時將反應管取出，將部分蒸發(fā)的液體輕甩到管底部。酶切反應結束后，取5ul酶切產(chǎn)物用2。/。瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，具體基因型如圖7所示。如圖7所示，其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1-IO為被檢測的酶切產(chǎn)物。經(jīng)鑒定，個體l、4屬于GG型，個體2、3、6、IO屬于AA型，個體5、7、8、9屬于AG型。此十個個體的背最長肌剪切力見表5。17表5實施例2中抽取的個體性狀測量值<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>以此十個屠宰個體為實驗對象進行性狀關聯(lián)分析，利用SPSS12.0軟件，建立如下模型進行性狀關聯(lián)分析統(tǒng)計分析模型為Y^n+Gj+ei。其中，Y為被觀測個體的生產(chǎn)性能表型值，u為生產(chǎn)性能的最小二乘均值，Gj為基因型對生產(chǎn)性能的效應值，ei為對應于觀察值的隨機殘差?；蛐蜋z測結果表明，在此十頭個體中，AA型個體有4個，AG型個體有4個，GG型個體有2個。不同基因型與剪切力之間顯著差異分析結果(最小二乘值和標準誤)見表6。分析結果表明，此酶切位點不同基因型所對應的個體，其背最長肌剪切力存在極顯著的差異，AA型個體的剪切力極顯著低于AG型和GG型(P〈0.01)，AG型個體極顯著低于GG型(P〈0.01)。表6不同基因型個體剪切力之間顯著差異分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注表中最小:二乘均值土標準誤肩標帶有^F同字母表示差異極顯著(P<0.01)實施例3在中國吉林省長春市皓月清真肉業(yè)集團股份有限公司的肉牛群體中隨機選定九個待屠宰個體，在屠宰時采集血液進行基因組DNA的提取并測定其背最長肌的剪切力。提取的基因組DNA經(jīng)分光光度儀測定，濃度為37.34ug/ml，0D260/0D280Ratio為1.803。利用本發(fā)明設計的引物、PCR反應體系和條件進行PCR擴增。PCR反應體系為10XPCRBuffer(購自天根生化科技有限公司)3.0wl，dNTPs(購自北京鼎國生物技術公司，濃度為2.5raM)0.8ul，正向引物與反向引物(濃度為均為1Opmol/Pl)各0.4ul，Taq酶(購自天根生化科技有限公司，濃度為2.5U/ul)0.4ul,基因組DNA0.5ul(含18.67ngDNA),四餾水24.51。PCR反應條件為94r預變性5分鐘，94T:變性40秒，6(TC退火40秒，72'C延伸40秒，共35個循環(huán)，72"C最后延伸5分鐘。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5°/。瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示為特異性PCR產(chǎn)物。如圖8所示，其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1為被檢測的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物按本發(fā)明設計的RFLP方法進行酶切反應。PCR產(chǎn)物酶切反應體系為15ix1，其中10XBufferl.5u1，PCR產(chǎn)物5ia，限制性內(nèi)切酶尸sw/1.0tU(10U/y1)，四餾水7.5!xl。將樣品混合均勻后，37"C恒溫水浴5小時。為提高酶切反應效率，可每隔1小時將反應管取出，將部分蒸發(fā)的液體輕甩到管底部。酶切反應結束后，取5iil酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，具體基因型如圖9所示。如圖9所示，其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1-10為被檢測的酶切產(chǎn)物。經(jīng)鑒定，個體l、2、3屬于GG型，個體8、9屬于M型，個體4、5、6、7屬于AG型。此九個個體的背最長肌剪切力見表5。表7實施例2中抽取的個體性狀測量值屠宰個體編號品種基因型背最長肌剪切力1利木贊GG5.6832利木贊GG5.8123西門塔爾GG5.8344西門塔爾AG5.0385'中國草原紅牛AG4.7116夏洛萊AG5.0337夏洛萊AG4.7668中國草原紅牛AA3.8159利木贊AA4.336以此九個屠宰個體為實驗對象進行性狀關聯(lián)分析，利用SPSS12.0軟件，建立如下模型進行性狀關聯(lián)分析統(tǒng)計分析模型為Y產(chǎn)n+Gj+ei。其中，Yi為被觀測個體的生產(chǎn)性能表型值，U.為生產(chǎn)性能的最小二乘均值，Gj為基因型對生產(chǎn)性能的效應值，ei為對應于觀察值的隨機殘差?；蛐蜋z測結果表明，在此十一頭個體中，AA型個體有2個，AG型個體有4個，GG型個體有3個。不同基因型與剪切力之間顯著差異分析結果(最小二乘值和標準誤)見表6。分析結果表明，此酶切位點不同基因型所對應的個體，其背最長肌剪切力存在極顯著的差異，AA型個體的剪切力極顯著低于AG型和GG型(P〈0.01)，AG型個體極顯著低于GG型(P〈0.01)。表8不同基因型個體剪切力之間顯著差異分析結果基因型個體數(shù)最小二乘均值士標準誤AA24.0755±0.26050AAG44.8870±0.04710BGG35.7763±0.08647e主表中最小二實匿均值土標準誤肩標帶有不同字母表示差異極顯著(P<0.01)21序列表〈110〉吉林大學<120〉牛CAPN1基因作為背最長肌嫩度分子標記的鑒定方法及應用<130〉〈160〉1<170>Patentlnversion3.3〈210〉<211>〈212〉〈213〉〈220〉<221>〈222〉1520DNABostaurusmutation(166)..(166)〈400〉1aaggtgactttgtgctgcgtttcttctcagagaagagcgcagggacccagtgagtagaaa60gccctcccctgtctccccctttcctcccaccacacccttgctgccccaacccccgttgac120tggcccctctctctccccaccctctgcagagagctggatgaccaggtccaggccaatctc180cccgacgaggtacgtgccctgcccccaccctgggtgcacgacggggacccgggtgtcctg240tgtcttggtctctagccagcaaggcagagcccctcctggcaggagccatacacatccctc300acttgccaagcactttacagtttgcaaaggactttgcgatcgatagtaatggcgcagggc360ccctgggttcttgctctctgcagggtctgtgctgagctgtttacctggatcacccggttt420cctccataacaaccgtgtcagggtgctgtcaccgtctctcctctcagagggaaactcagg480ttcagagaggttaaggaatttacccaaggtcacgcagcag5202權利要求1、一種牛背最長肌嫩度相關的CAPN1基因片段，它的DNA序列如SEQIDNO1所述。2、根據(jù)權利要求1所述的DNA序列，其特征在于序列表SEQIDN0:1的第166bp處有一個A-G的堿基突變，導致/^//酶切多態(tài)性的產(chǎn)生。3、根據(jù)權利要求l所述的牛肉肉質(zhì)嫩度相關基因^/W/基因片段，所選用的特異性引物如下所示CAPN1E14F:5、-MGGTGACTTTGTGCTGCGTTTCT-3、(正向引物)CAPN1E14R:5、-CTGCTGCGTGACCTTGGGTAAAT-3、(反向引物)4、權利要求1、2所述的牛背最長肌嫩度相關基因"/W2基因片段在牛分子標記輔助選擇中的應用。5、權利要求3所述的引物在牛分子標記輔助選擇中的應用。全文摘要本發(fā)明屬于動物基因工程
技術領域：
，是一種牛背最長肌嫩度相關基因CAPN1基因片段的克隆以及其在牛標記輔助選擇中的應用。所獲得的CAPN1基因片段的核苷酸序列長度為520bp，包括全部第14外顯子。在此片段的第166bp處存在有一個A→G的堿基突變，導致PsuI-RFLP酶切多態(tài)性的產(chǎn)生。將此突變位點作為一個分子標記，使用限制性內(nèi)切酶PsuI檢測此突變位點，并可將檢測結果與牛背最長肌嫩度進行關聯(lián)分析。分析結果表明，不同基因型個體的背最長肌嫩度有極顯著的差異，從而為牛的選種選育提供理論基礎。本發(fā)明的特點在于獲得與中牛背最長肌嫩度相關的CAPN1基因部分片段，并利用PCR-RFLP方法對該片段進行多態(tài)性分析，為牛的標記輔助選擇提供分子標記及其應用。文檔編號C12N15/57GK101624598SQ20091006740公開日2010年1月13日申請日期2009年8月17日優(yōu)先權日2009年8月17日發(fā)明者穎劉,昊姜,張嘉保,張金玉,戴立勝,秦立紅,趙志輝,陳承禎,馬騰壑,妍高申請人:吉林大學