料裝載紫杉醇前藥
[0048]
[0049]在裝有磁轉(zhuǎn)子的單頸梨形瓶中加入30mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺，氮氣流下依次 加入羧基化的N，N' -(乙烷-1，2-二基)-二葡糖糖酸酰胺（2.0g，1.14mmol)，紫杉醇（1.2g， 1.41mmol)，4_二甲氨基吡啶0.17g(l .41mmol)，待溶清后用冰水浴將反應(yīng)體系降溫至0°C以 下，分四批加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（1.1 8,5.74111111〇1)，時間間隔 為5min。將反應(yīng)體系升至室溫后開始計時，用TLC監(jiān)測反應(yīng)[硅膠板;流動相為三氯甲烷：甲 醇=10:1，Rf (紫杉醇）=0.55，Rf (前藥）=0.0]，反應(yīng)時間約16小時烈攪拌下，將反應(yīng)體系緩 慢加入到50mL碳酸氫鈉溶液(0.3mol/L)，注意此過程要注意加入速度和加入量，否則會有 大量氣泡放出，帶出大量產(chǎn)物而造成產(chǎn)率顯著下降。待溫度冷卻到室溫后加入到截留分子 量為10000的透析膜中中，透析36h(剛開始每3小時換一次水，12小時后12小時換一次水）。 在此過程中亦需注意透析膜內(nèi)的液面高度，必要時分流。透析結(jié)束后，用〇.45μπι過濾頭過 濾，冷凍干燥得咖啡色絮狀小分子材料裝載紫杉醇前藥(3.17g，99.06% )。
[0050] 得到的小分子載紫杉醇前藥用紫外分光光度法測得平均載藥量為35%，水中最大 溶解度為200mg/mL。
[0051] 將得到的小分子載紫杉醇前藥用氘代水溶解，在布魯克400兆核磁共振儀下進行 氫譜掃描，核磁圖譜如圖3所示。
[0052] 實施例4
[0053]配置小分子載紫杉醇前藥lmg/mL，超聲5分鐘后靜置2分鐘，用馬爾文激光粒度儀 測定其粒徑大小、粒徑分布及表面電位，圖4顯示納米顆粒徑分布窄，粒徑大小約114nm。圖5 顯示平均表面電位為-23.3。
[0054] 實施例5
[0055] 小分子裝載紫杉醇前藥自組裝形成的納米膠束透射電鏡圖參閱圖6,圖6顯示納米 粒子的形狀為類球形和尺寸為90nm左右。
[0056] 實施例6
[0057] 小分子材料載紫杉醇前藥的溶血性評價
[0058] 取新鮮大鼠的紅細胞懸浮液，用生理鹽水配制體積比為2% (v/v)紅細胞懸浮液， 將配制好的2%懸浮液與一系列濃度的的小分子材料載紫杉醇前藥溶液、聚氧乙烯基蓖麻 油和吐溫80的紅細胞溶液混合。另外設(shè)置兩組陰性對照和陽性對照，混均后置于37°C恒溫 箱中溫育。開始每隔15分鐘觀察一次，4次后每隔1小時觀察一次。3小時后，將樣品溶液在離 心機中以2000r/min條件離心5分鐘，輕輕吸取上清液在416nm波長下測定吸光度A值。按照 如下公式計算溶血率:溶血率=(樣品A值-陰性對照A值)/(陽性對照A值-陰性對照A值）X 100 %，其中9 %生理鹽水為陰性對照，蒸餾水為陽性對照。
[0059]分子材料載紫杉醇前藥的溶血性如圖7所示，即使在10mg/mL的濃度下，小分子材 料載紫杉醇前藥依然不具有溶血性，對紅細胞具有很強的適應(yīng)性。
[0060] 實施例7
[0061 ]小分子載紫杉醇前藥的細胞毒性評價
[0062]采用CCK-8法，將生長狀態(tài)良好的非小細胞肺癌H460細胞以一定密度種于96孔板 中，置于37°C，5%C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后加入一系列濃度的小分子材料，紫杉醇 及小分子材料載紫杉醇前藥樣品，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后每孔加入10微升CCK-8溶液，37°C恒溫 震蕩箱中放置4h，用酶標儀測定96孔板上各孔細胞液的吸光度(0D)，細胞成活率按照以下 公式算得：
[0063] 細胞成活率=(0D樣品/0D對照）X 100 %
[0064] 0D樣品：為加入各濃度樣品的細胞液的吸光度 [0065] 0D對照:為空白培養(yǎng)液的吸光度
[0066] 每個樣品設(shè)置6個平行樣，細胞存活率如圖8所示，說明小分子材料對細胞基本無 殺傷作用，而小分子材料載紫杉醇前藥相比于原藥，在細胞毒性上有明顯降低。
[0067] 實施例8
[0068] 小分子載紫杉醇前藥的體內(nèi)試驗結(jié)果
[0069] 為了更深入地評價CAG-PTX納米膠束前藥的體內(nèi)抗腫瘤活性，將不同劑量的納米 膠束前藥通過尾靜脈注射進人非小細胞肺癌模型的裸鼠體內(nèi)。一般地，將36只6-8周大、體 重為20-25g的裸鼠隨機分為6組，每組6只。通過裸鼠的左肩部位注射O.lmL含有4X10 6個人 非小細胞肺癌細胞。將注射完癌細胞的裸鼠放置在動物房中按照相關(guān)國際標準飼養(yǎng)，用游 標卡尺定期測量腫瘤的體積，直到體積達到100立方毫米(mm 3)時開始通過裸鼠尾靜脈注射 相應(yīng)量的藥物或?qū)φ掌贰Ｆ渲心[瘤組織的體積計算公式是:V = W2L/2,其中W是腫瘤的最寬 數(shù)值，L為腫瘤的最長數(shù)值，單位均為毫米(mm)。每天測量裸鼠的體重和腫瘤的體積，直到生 理鹽水對照組的腫瘤體積達到3000mm 3。
[0070] 非小細胞肺癌的裸鼠腫瘤模型的體內(nèi)抗腫瘤實驗結(jié)果直接反映藥物在復(fù)雜的生 理條件下殺死腫瘤細胞的作用。從實驗結(jié)果可以看出，CAG-PTX納米膠束前藥在體內(nèi)的抗腫 瘤效果非常明顯，相同的實驗條件下生理鹽水組的裸鼠在11天內(nèi)腫瘤的體積已經(jīng)由100mm 3 迅速增加到1500mm3，非小細胞肺癌體積在本次試驗中增長十分迅速，有生理鹽水組的腫瘤 體積在一天內(nèi)增加100mm 3,這可能是由于不同的裸鼠體質(zhì)不一樣或接種非小細胞肺癌細胞 時數(shù)量較大造成的，但是實驗組的腫瘤體積明顯受到抑制，而且即使在劑量為300mg/kg時 裸鼠的體重并未受到影響，但是腫瘤的生長明顯收到抑制，生長十分緩慢，在第九天以后 300mg/kg的實驗組有腫瘤體積出現(xiàn)下降，250mg/kg組的腫瘤體積增加更為緩慢，實驗用鼠 的體重沒有受到影響，表明在CAG-PTX納米膠束前藥在達到治療效果的同時并沒有產(chǎn)生嚴 重的毒副作用，該前藥的耐受性很好。而且在做裸鼠的最大耐受劑量實驗時，用藥高達 500mg/kg的劑量時裸鼠的體重仍然沒有下降，裸鼠的生理狀態(tài)仍然十分良好。圖9為小鼠腫 瘤體積變化圖。
【主權(quán)項】
1. 一種用于抗腫瘤藥物遞送的小分子材料，其特征在于該小分子材料具有如下所示結(jié) 構(gòu)：其中:m=2、3、4、5或6 ;n = 2、3或4;小分子材料與藥物連接形成的納米膠束粒徑能夠控 制在100~200nm之間，粒徑分布PDI為0.1~0.3。2. -種權(quán)利要求1所述小分子材料的制備方法，其特征在于該方法包括W下具體步驟：1) 制備二葡糖糖酸酷胺GTG 在裝有磁轉(zhuǎn)子的單頸圓底燒瓶中加入干燥的N，N-二甲基甲酯胺，氮氣流保護下加入D- 葡萄糖酸-S-內(nèi)醋GAL和無水二胺；Ig的D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)醋對應(yīng)N，N-二甲基甲酯胺30mL，D- 葡萄糖酸-S-內(nèi)醋與無水二胺的摩爾比為2:1，在氮氣保護條件下將上述反應(yīng)體系在80°C條 件下反應(yīng)12h;反應(yīng)結(jié)束后，體系中有大量白色固體物質(zhì)出現(xiàn)，降至室溫后，加入化學(xué)純丙 酬，1 g的D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)醋對應(yīng)丙酬30mL，更多的白色固體物質(zhì)析出；用垂烙玻璃漏斗過 濾，濾餅上所得白色固體用化學(xué)純丙酬洗3次后置于45°C真空干燥箱中化得白色固體二葡 糖糖酸酷胺GTG; 2) 制備簇基化二葡糖糖酸酷胺CAG 在裝有磁轉(zhuǎn)子的干燥單頸梨形瓶中加入干燥二甲基亞諷，氮氣流下加入二葡糖糖酸酷 胺GTG、二酸酢和催化劑4-二甲氨基化晚，lg二葡糖糖酸酷胺對應(yīng)二甲基亞諷lOmL，二葡糖 糖酸酷胺與二酸酢和4-二甲氨基化晚的摩爾比為1:13:1.1;該反應(yīng)在65°C條件下反應(yīng)24h; 將反應(yīng)后的溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一半溶劑;冷卻至室溫，在快速攬拌下緩慢加入溶劑等量 的去離子水，然后將此稀釋液裝于截留分子量為1000的透析袋中透析，冷凍干燥得絮狀咖 啡色固體簇基化二葡糖糖酸酷胺CAG。3. -種權(quán)利要求1所述小分子材料的載藥應(yīng)用，其特征在于該載藥應(yīng)用包括W下具體 步驟：在裝有磁轉(zhuǎn)子的單頸梨形瓶中加入干燥的N，N-二甲基甲酯胺，氮氣流下依次加入簇基 化二葡糖糖酸酷胺、抗腫瘤藥物、4-二甲氨基化晚，待溶液溶清后用冰水浴將反應(yīng)體系降溫 至〇°C，緩慢分次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；Ig簇基化二葡糖糖酸 酷胺對應(yīng)N，N-二甲基甲酯胺10~15mL，簇基化二葡糖糖酸酷胺與抗腫瘤藥物、4-二甲氨基 化晚、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾比為1:1:1.1:4,升至室溫反應(yīng) 16h，激烈攬拌下，將反應(yīng)體系緩慢的倒入濃度為0.3mol/L的碳酸氨鋼溶液中，Ig簇基化二 葡糖糖酸酷胺對應(yīng)碳酸氨鋼溶液20~30mL，將得到的溶液裝于截留分子量為10000的透析 袋中透析，冷凍干燥得咖啡色絮狀固體CAG-化ug; CAG-化ug在水溶液中通過自組裝形成納 米膠束;通過動態(tài)光散射儀測定其粒徑、粒徑分布及表面電荷，并用透射電鏡觀測納米膠束 形貌，用紫外吸收法測定其載藥量和溶血性，用CCK騎去測定納米膠束的細胞毒性。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述透析是指:選擇截留分子量為1000 或10000的透析袋將過濾后的反應(yīng)液置于去離子水中透析48~60小時，每3小時換一次水， 12小時后每12小時換一次水，然后冷凍干燥。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的載藥應(yīng)用，其特征在于該載藥應(yīng)用適用于含徑基、氨基的抗腫 瘤藥物的遞送。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的載藥應(yīng)用，其特征在于所述含徑基、氨基的抗腫瘤藥物為紫杉 醇、多西紫杉醇、阿霉素、喜樹堿或吉西他濱。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于抗腫瘤藥物遞送的小分子材料及其制備方法和載藥應(yīng)用，其小分子材料是由兩分子羧基化的D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯通過肽鍵與二胺連接組成。本發(fā)明的小分子材料用于紫杉醇，多柔比星，喜樹堿等抗腫瘤藥物的遞送，它與這些藥物通過鍵合形成的前藥在水中能夠通過自組裝形成納米膠束，提高了藥物的水溶性和生物相容性，并在腫瘤EPR效應(yīng)下被動靶向，提高藥物的療效和生物利用度。
【IPC分類】A61P35/00, C07C231/12, C07C235/10, A61K47/48, A61K9/107
【公開號】CN105693544
【申請?zhí)枴緾N201610124031
【發(fā)明人】俞磊, 王 華, 張磊濤, 南麗娟, 肖曄, 閆志強, 王鏡, 王依婷, 朱建中
【申請人】華東師范大學(xué)
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2016年3月4日