專(zhuān)利名稱(chēng)：靶向性白細(xì)胞介素融合蛋白及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體涉及白細(xì)胞介素融合蛋白及其制備和其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)治療癌癥的方法有手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療和激素治療等。近年來(lái)，開(kāi)發(fā)選擇性作用于特定靶點(diǎn)的高效、低毒、特異性強(qiáng)的抗腫瘤分子靶向藥物已成為重要研究開(kāi)發(fā)方向。腫瘤免疫治療已成為最活躍的抗腫瘤靶向研究領(lǐng)域之一，單克隆抗體、細(xì)胞過(guò)繼免疫治療、腫瘤疫苗、細(xì)胞因子治療已顯示出與傳統(tǒng)療法的互補(bǔ)性。白細(xì)胞介素2(IL_2)是本領(lǐng)域熟知的一種白細(xì)胞介素，發(fā)現(xiàn)于1976年，Morgan等人用植物的血球凝集素刺激正常的人淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可以產(chǎn)生一種能選擇性促進(jìn)T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子，它必須和IL-2受體結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。IL-2是多種生物功能細(xì)胞因子，可刺激細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞分化、激活細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、肥大細(xì)胞的非特異性殺傷功能，也能增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞的抗體分泌和增殖。因此臨床上也主要用于免疫佐劑調(diào)動(dòng)機(jī)體的系統(tǒng)免疫，達(dá)到輔助治療控制腫瘤的目的。作為第一個(gè)被分離純化的白細(xì)胞介素分子，80年代美國(guó)Cetus公司開(kāi)發(fā)人源重組 IL-2用于治療癌癥，直至1993年，IL-2被FDA批準(zhǔn)用于治療腎癌和黑色素瘤；目前IL-2也被批準(zhǔn)大劑量用于治療HIV。臨床試驗(yàn)表明IL-2單藥治療癌癥的有效率低，副作用大。高劑量治療黑色素瘤的客觀有效率為5-27%，其中只有0-4%的病人病情完全緩解。IL-2的副作用大，病人產(chǎn)生體液儲(chǔ)留、腹瀉、血壓過(guò)低等一系列反應(yīng)，小部分患者死亡，這些毒副作用多與IL-2引發(fā)非治療病灶的全身其他組織免疫過(guò)度反應(yīng)有關(guān)。針對(duì)于IL-2臨床使用的局限，目前IL-2蛋白質(zhì)藥物研究主要方向是減小藥物副作用、提高藥效、延長(zhǎng)藥物半衰期。策略主要包括IL-2的聚乙二醇(PEG)修飾、與人血清白蛋白(HSA)融合延長(zhǎng)半衰期，糖基化修飾提高IL-2穩(wěn)定性，與單克隆抗體融合將藥物靶向到特定靶點(diǎn)(如腫瘤細(xì)胞)，與其他蛋白(如免疫調(diào)節(jié)因子)融合產(chǎn)生藥物聯(lián)用效果等。在臨床實(shí)驗(yàn)中，PEG修飾的IL-2與IL-2相比，并沒(méi)有顯著改善半衰期和有效率，至今未被FDA批準(zhǔn)用于癌癥治療。Human Genomekiences公司開(kāi)發(fā)了 HSA-IL-2融合蛋白 Albuleukin，靜脈注射Albuleukin的血漿半衰期從IL-2的19分鐘提高到6小時(shí)，目前已進(jìn)入二期臨床實(shí)驗(yàn)。天然IL-2的第三位Thr是被糖基修飾的，目前IL-2的糖基化地手段分為真核細(xì)胞表達(dá)、以及合成的糖基化短肽和IL-2蛋白連接兩種策略，Symansis公司用人 293細(xì)胞表達(dá)hcxIL-2已經(jīng)在市面上出售，國(guó)內(nèi)有若干個(gè)實(shí)驗(yàn)室都開(kāi)發(fā)酵母表達(dá)糖基化的 IL-2，目前還處于開(kāi)發(fā)階段。目前默克公司將抗神經(jīng)節(jié)苷脂⑶2的C端融合IL-2的抗體藥物EMD273066(hul4. 18-IL-2)用于治療黑色素瘤已經(jīng)完成I期臨床，結(jié)果表明33例病人中，8例病情穩(wěn)定。無(wú)4級(jí)毒性反應(yīng)(死亡)發(fā)生，但仍發(fā)現(xiàn)有低血壓、組織缺氧等3級(jí)毒性反應(yīng)。此外也有將IL-2融于其他抗體(如anti-her2 antibody, anti_her3，IgG3等) 的研究，以增強(qiáng)IL-2誘導(dǎo)的T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷特異性。其他IL-2融合蛋白藥物，如Aerolysin-IL-2, IL-6-IL-2，GCSF-IL-2、重組人α胸腺素原-白介素2等，產(chǎn)生藥物聯(lián)用的效果。對(duì)于與生物大分子耦聯(lián)/融合的白介素-2可能存在的問(wèn)題是，雖然半衰期延長(zhǎng)但藥物分子量的成倍增加使其更難于穿過(guò)生理屏障到達(dá)靶組織，尤其對(duì)大型實(shí)體瘤的浸潤(rùn)性差，使其難于穿過(guò)生理屏障到達(dá)腫瘤部位。靶向藥物的特異性和親和性不高會(huì)造成靶向藥物在到達(dá)靶組織以前損傷正常細(xì)胞，消耗了藥效。針對(duì)上述問(wèn)題，首先要選擇特異性高的腫瘤抗原為靶點(diǎn)，另外還要通過(guò)蛋白質(zhì)工程對(duì)靶向藥物進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，減小分子質(zhì)量，提高親和力和特異性，增加藥物在腫瘤組織的濃度和減少在正常組織的分布，減少對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用?？梢赃x擇主要靶向于腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的靶向短肽及非抗體蛋白，其中有針對(duì)腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面分子氨基肽酶N的NGR和整聯(lián)蛋白(integrins α ν β 3)的R⑶。如某些利用上述的相關(guān)靶向肽的開(kāi)發(fā)藥物，已經(jīng)成功進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)。Modmed公司開(kāi)發(fā)ARENEGYR就為NGR融合腫瘤壞死因子(NGR-hTNFa)，用于治療直腸癌、肝癌、間皮瘤已經(jīng)進(jìn)入II期臨床。GE公司開(kāi)發(fā)用于腫瘤診斷的藥物18F-AH111585(放射性標(biāo)記的RGD)也進(jìn)入一期臨床。尿激酶如奧曲肽(Octreotide)作為單藥已經(jīng)分別成功用于心血管疾病(腦血栓等)和類(lèi)癌、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤等的臨床治療，充分支持了尿激酶作為靶向肽選擇的合理性和可行性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靶向性白介素融合蛋白，該融合蛋白能夠特異性結(jié)合某些細(xì)胞特別是腫瘤組織細(xì)胞或其新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，顯著的增加白細(xì)胞介素在靶向組織的濃度，降低其在其他組織的濃度，從而提高治療效果，降低毒副作用。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種融合蛋白，從N端至C端包括(1)特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞或者腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶向結(jié)合區(qū)；(2)白細(xì)胞介素。根據(jù)情況，本發(fā)明所述融合蛋白可有不多于10個(gè)氨基酸組成的連接區(qū)，用于連接所述靶向結(jié)合區(qū)和白細(xì)胞介素。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，連接區(qū)有三個(gè)氨基酸甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-(GGQ，在另一個(gè)實(shí)施例中有6個(gè)氨基酸甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸(GGSGGS)。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述融合蛋白中白細(xì)胞介素為人源白細(xì)胞介素2，具有如SEQ ID NO 1的氨基酸序列。白細(xì)胞介素2 (IL-2)核苷酸序列GenBank登錄號(hào)NM_000586. 3。IL-2也是最早在分子水平被分離、純化、鑒定的細(xì)胞因子。它是具有多功能的分泌單體糖蛋白。切去N端20 個(gè)疏水氨基酸的信號(hào)肽后，成熟IL-2為133個(gè)氨基酸組成，分子量為15.5kD。IL-2含有三個(gè)半胱氨酸(CyS58、CyS105和Cysl25)，前兩個(gè)Cys形成鏈內(nèi)二硫鍵，對(duì)其穩(wěn)定性和功能發(fā)揮具有重要作用。因此工業(yè)上常制備IL-2突變體IL-2C125S，以促進(jìn)其二硫鍵的正確配對(duì)。 在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白中的人源白細(xì)胞介素2含有如SEQ IDD N0:1所述的氨基酸序列，其中第125位半胱氨酸(C)突變?yōu)榻z氨酸(S)。
作為優(yōu)選，本發(fā)明所述融合蛋白中靶向結(jié)合區(qū)為人源氨基酸序列。更優(yōu)選地，所述靶向結(jié)合區(qū)與尿激酶同源，所述靶向結(jié)合區(qū)的氨基酸序列與尿激酶同源性不低于60%。在具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明具體提供一種融合蛋白，其靶向結(jié)合區(qū)的氨基酸序列為如SEQ ID NO :2所示，或?yàn)镾EQ ID NO. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失、或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的與SEQ IDN0. 2所示的氨基酸序列至少有80%的一致性，且具有特異結(jié)合腫瘤細(xì)胞或者腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白中靶向結(jié)合區(qū)可以是包括不少于3個(gè)但不多于50個(gè)氨基酸的氨基酸序列，優(yōu)選的序列含有尿激酶同源的不多于25個(gè)氨基酸序列， 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白的靶向結(jié)合區(qū)含有如SEQ ID N0:2所述的氨基酸序列，其N(xiāo)末端可帶有大腸桿菌表達(dá)的起始密碼子翻譯的甲硫氨酸，在翻譯過(guò)程中可能被不均一切除。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種具體的融合蛋白，含有如SEQ IDD NO 3 所述的氨基酸序列，記作UIL。為了使融合蛋白質(zhì)便于純化，可在氨基(N)末端或羧基(C) 末端連接上氨基酸標(biāo)簽，包括但不限于多聚組氨酸(Poly-His通常為6個(gè)組氨酸)、多聚精氨酸(Poly-Arg通常為5-6個(gè)精氨酸)等。本發(fā)明的另一方面也提供了編碼本發(fā)明所述融合蛋白的DNA分子。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，可以存在很多種能夠編碼本發(fā)明所述的特定蛋白的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可以編碼含有如SEQ IDD NO :3所述氨基酸序列的融合蛋白的DNA分子， 其核苷酸序列如SEQ IDD NO 4所示。為了生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白，編碼融合蛋白的DNA分子被整合至表達(dá)盒中，隨后表達(dá)盒被插入合適的表達(dá)載體。然后，這一表達(dá)載體被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞或者動(dòng)物用于重組蛋白表達(dá)。表達(dá)盒至少包括以下幾個(gè)內(nèi)容⑴轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，(2)可以編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分子，該轉(zhuǎn)錄是在在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的調(diào)控下進(jìn)行的，以及(3)轉(zhuǎn)錄中止區(qū)。根據(jù)用于蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞的不同，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和轉(zhuǎn)錄中止區(qū)可以是天然存在或者人工構(gòu)建的序列，該序列適合于真核或者原核細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄。此類(lèi)序列在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已為人所熟知。適當(dāng)?shù)暮修D(zhuǎn)錄起始序列的DNA片與適當(dāng)?shù)暮修D(zhuǎn)錄中止區(qū)的DNA 片段與編碼融合蛋白的DNA片段相連接。這種連接方法在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已為人所熟知，比如，選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶酶切以及連接。本發(fā)明進(jìn)一步提供重組了編碼本發(fā)明所述融合蛋白的DNA分子的表達(dá)載體以及表達(dá)所述融合蛋白的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。所述表達(dá)載體優(yōu)選質(zhì)?；虿《?。所述細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，酵母或者細(xì)菌。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以是轉(zhuǎn)基因羊，牛，等等。在本發(fā)明的實(shí)施例中，具體提供一種重組了編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分子的大腸桿菌，所述大腸桿菌于2010年5月M日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3868。另外，本發(fā)明也提供了所述融合蛋白的生產(chǎn)方法，包括以下步驟提供含有編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分子的細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，使該細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)所述融合蛋白以及分離所述融合蛋白。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述融合蛋白可通過(guò)在腫瘤組織/部位激活NK細(xì)胞、CTL細(xì)胞、LAK細(xì)胞，提高免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，本發(fā)明所述融合蛋白體內(nèi)抗腫瘤活性研究證明UIL低劑量組藥效要優(yōu)于白細(xì)胞介素2低劑量組，因此本發(fā)明還提供了所述融合蛋白的應(yīng)用，即用于治療細(xì)胞過(guò)度增生導(dǎo)致的疾病或制備治療細(xì)胞過(guò)度增生導(dǎo)致的疾病如癌癥的藥物中的用途。生物保藏說(shuō)明分類(lèi)命名大腸埃希氏菌，Escherichia coli.于2010年5月M日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3868。


圖1示本發(fā)明所述融合蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。A 靶向結(jié)合區(qū)；B 連接區(qū)；C 人源白細(xì)胞介素2。圖2示本發(fā)明所述融合蛋白UIL表達(dá)與純化后的SDS-PAGE鑒定結(jié)果。泳道1 分子量 Marker ；從上至下依次為 97. OkDa,66. OkDa,45. OkDa,30. OkDa, 20.lkDa、14. 4kDa。泳道2 表達(dá)融合蛋白的宿主菌裂解物；泳道3 最終洗滌的包涵體；泳道4:經(jīng)Ni Sepharose High Performance親合純化的目的蛋白。圖3示本發(fā)明所述融合蛋白UIL復(fù)性的SDS-PAGE結(jié)果。0:UIL非還原電泳；M 分子量 Marker，從上至下依次為 97. OkDa,66. OkDa,43. OkDa,30. OkDa, 20.lkDa、14. 4kDa ；R:UIL還原電泳；圖4示本發(fā)明所述融合蛋白UIL碳18反相高效液相分析圖(C18RP-HPLC)，層析柱Z0RBA 300SB-C185um,4. 6*250mm ；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm ；純度96. 7%。圖5本發(fā)明所述融合蛋白UIL體外靶向結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖6本發(fā)明所述融合蛋白UIL體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)，從左至右為腫瘤無(wú)進(jìn)展、腫瘤無(wú)明顯進(jìn)展、腫瘤重大進(jìn)展。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開(kāi)了一種白細(xì)胞介素融合蛋白及其制備和其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品、方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。依照本發(fā)明，一種靶向性的白細(xì)胞介素的融合蛋白，從N端至C端包括(1)特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞或者腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶向結(jié)合區(qū)；( 根據(jù)情況可有一不多于10個(gè)氨基酸的連接區(qū)；C3)白細(xì)胞介素氨基酸序列
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白中靶向結(jié)合區(qū)可以是包括不少于3個(gè)但不多于50個(gè)氨基酸的氨基酸序列，優(yōu)選的序列含有尿激酶同源的不多于15個(gè)氨基酸序列， 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白的靶向結(jié)合區(qū)含有如SEQ ID N0:2所述的氨基酸序列，其中N端可帶有大腸桿菌表達(dá)的起始密碼子翻譯的甲硫氨酸，在翻譯過(guò)程中可能被不均一切除。本發(fā)明所述融合蛋白的靶向結(jié)合區(qū)和白細(xì)胞介素可以直接由肽鍵或由連接區(qū)連接到一起。視需要而定，連接區(qū)可以有2至10個(gè)氨基酸連接靶向結(jié)合區(qū)與白細(xì)胞介素2。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接區(qū)有三個(gè)氨基酸甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-(GGS)，在另一個(gè)實(shí)施例中有6個(gè)氨基酸甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸(GGSGGS)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白含有如SEQ IDDNO 4所述的氨基酸序列，記作UIL。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白含有如SEQ IDDNO 3所述的氨基酸序列。本發(fā)明的另一方面也提供了編碼本發(fā)明上述的融合蛋白的DNA分子。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，可以存在很多種能夠編碼本發(fā)明所述的特定蛋白的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可以編碼含有如SEQ IDD NO :3所述氨基酸序列的融合蛋白的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ IDD N0:4所示。為了生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白，編碼融合蛋白的DNA分子被整合至表達(dá)盒中，隨后表達(dá)盒被插入合適的表達(dá)載體。然后，這一表達(dá)載體被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞或者動(dòng)物用于重組蛋白表達(dá)。表達(dá)盒至少包括以下幾個(gè)內(nèi)容⑴轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，(2)可以編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分子，該轉(zhuǎn)錄是在在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的調(diào)控下進(jìn)行的，以及(3)轉(zhuǎn)錄中止區(qū)。根據(jù)用于蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞的不同，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和轉(zhuǎn)錄中止區(qū)可以是天然存在或者人工構(gòu)建的序列，該序列適合于真核或者原核細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄。此類(lèi)序列在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已為人所熟知。適當(dāng)?shù)暮修D(zhuǎn)錄起始序列的DNA片與適當(dāng)?shù)暮修D(zhuǎn)錄中止區(qū)的DNA 片段與編碼融合蛋白的DNA片段相連接。這種連接方法在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已為人所熟知，比如，選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶酶切以及連接。表達(dá)盒可以被整合插入表達(dá)載體，隨后這一表達(dá)載體被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞或者動(dòng)物。 一般情況下，表達(dá)載體還要包括復(fù)制起始序列，以及篩選標(biāo)記，例如，對(duì)于細(xì)菌的蛋白表達(dá)， 質(zhì)粒是一種很有用途的載體。本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)有很多種為人所熟知的可以用于此目的的質(zhì)粒載體，包括，但是不僅限于，pET15b, pET22b, pET25b, pET28b等等。如果通過(guò)酵母細(xì)胞來(lái)重組表達(dá)融合蛋白，酵母表達(dá)載體，比如pPIC9，pA0815，pPICZ等等，可以作為表達(dá)載體。如果通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)進(jìn)行蛋白表達(dá)，也有很多合適的重組蛋白表達(dá)載體。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)蛋白的表達(dá)載體包含的DNA序列，需要適合以同源重組方式整合插入宿主細(xì)胞染色體。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，比如pcDNA3. 1，pSI等等。對(duì)于通過(guò)動(dòng)物來(lái)表達(dá)融合蛋白，用于生產(chǎn)含有表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(轉(zhuǎn)基因羊，牛，等等)的技術(shù)手段，在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已為人所熟知。比如PBLG等等，可以作為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)的載體。獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后，可在適合表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的條件下表達(dá)出融合蛋白。通過(guò)其理化性質(zhì)和其它特性的差別運(yùn)用各種分離方法分離純化融合蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如常規(guī)的變性復(fù)性處理、離心、超聲破碎、超濾膜過(guò)濾、金屬親和層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、透析、高效液相層析等常規(guī)純化方法及這些方法的結(jié)合。本發(fā)明所述融合蛋白通過(guò)在腫瘤組織/部位激活NK細(xì)胞、CTL細(xì)胞、LAK細(xì)胞等提高局部組織和/或器官免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。本發(fā)明的另一個(gè)方面還提供所述融合蛋白的醫(yī)藥用途，或可以生產(chǎn)用于治療一種疾病的藥物，優(yōu)選用于治療細(xì)胞過(guò)度增生導(dǎo)致的疾病或制備治療細(xì)胞過(guò)度增生導(dǎo)致的疾病如癌癥的藥物中的用途。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1.用于表達(dá)帶有尿激酶同源靶向肽的白介素2融合蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建基于融合蛋白的N末端和N末端氨基酸序列以及待加入之N末端附加的靶向結(jié)合區(qū)氨基酸，通過(guò)分別擴(kuò)增IL-2序列和含有尿激酶及結(jié)合區(qū)的序列，然后通過(guò)重疊PCR鏈接靶向序列和IL-2序列。主要通過(guò)以下3個(gè)步驟完成(1)IL2序列的擴(kuò)增設(shè)計(jì)引物序列如下5 上游引物序列GCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAAC (如 SEQ ID NO 5 所示)；其中含有白細(xì)胞介素2退火序列；3(下游)引物序列CCCAAGCTTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGAGAAAAG(如 SEQ IDNO 6 所示)；其中含有退火序列、終止密碼子及其后的HindIII位點(diǎn)，從人肝臟cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增得到編碼人白細(xì)胞介素 2(IL-2)的DNA序列，也可以直接合成編碼人白細(xì)胞介素2(C125S)的DNA序列作為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出IL-2，回收PCR產(chǎn)物。(2)合成含有尿激酶靶向肽以及連接區(qū)DNA序列首先化學(xué)合成如下序列包括NdeI位點(diǎn)、起始密碼子以及尿激酶序列和鏈接區(qū)氨基酸序列；CGCCATGGGTCATATGGATTGTCTAAATGGAGGCACGGCAGTATCAAACAAGTACTTCTCCAACATCCA CTGGTGTAACGGTGGCAGCGGCGGTAGC(如 SEQ ID NO 7 所示)以尿激酶的 5 上游引物序列CGCCATGGGTCATATGGATTGTCTAAATGGAGG(如 SEQ ID NO 8所示)；其中含有NdeI位點(diǎn)和起始密碼子以及尿激酶的退火序列，3 (下游)引物序列AGAACTTGAAGTAGGTGCGCTACCGCCGCTGCCACCGTTACACCAGTG (如 SEQ ID NO :9 所示) (其中含有部分與IL-2配對(duì)的區(qū)域TTGAA)，以上述化學(xué)合成的DNA序列為模板PCR擴(kuò)增尿激酶及鏈接區(qū)序列，回收PCR產(chǎn)物。(3)通過(guò)重疊PCR連接靶向肽和IL-2用尿激酶5 (上游)端引物和IL-2的3(下游)端引物以⑴、(2)操作得到的回收PCR產(chǎn)物為模板擴(kuò)增出全長(zhǎng)片段。以NdeI和HindIII酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以及pET25b空質(zhì)粒((工具酶皆購(gòu)自 Takara公司，質(zhì)粒購(gòu)自Novage公司)，上述酶切片段均以瓊脂糖凝膠回收相應(yīng)大小的片段， 用T4DNA連接酶連接各片段，所得的重組質(zhì)粒即為白細(xì)胞介素融合蛋白的表達(dá)載體，命名為pET-U-IL。融合蛋白結(jié)構(gòu)如圖1所示。首先將連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-lBlue， 在含有青霉素的培養(yǎng)基中保溫過(guò)夜后，挑選陽(yáng)性菌落并從中大量制備DNA。經(jīng)DNA序列分析氣核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示，進(jìn)一步證實(shí)序列正確性后，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到攜帶 T7啟動(dòng)子基因的感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)菌株(Novagen)中，即為表達(dá)相應(yīng)蛋白的工程菌(UIL-BL21)，該工程菌分類(lèi)命名大腸埃希氏菌，Escherichia coll.于2010年5月24 日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路 1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3868。實(shí)施例2 本發(fā)明所述融合蛋白的表達(dá)與純化將重組質(zhì)粒pET-S-IL轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21克隆加在LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)(37 °C )，待細(xì)菌密度達(dá)到0D600 ^ 4-6，按接種量5_10 %進(jìn)行5L發(fā)酵罐培養(yǎng)，待 0D600 10-20，向培養(yǎng)基中加入0. 5-11111異丙基-0-0-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，至誘導(dǎo)后0D600不再增加下罐，以10，OOOgX (15分鐘)離心收獲菌體。將收獲的菌體重懸于3M尿素IOOmM磷酸20mM Tris pH8. 0緩沖液(buffer)中， 室溫放置1小時(shí)，并將細(xì)胞超聲處理3次，20，OOOg離心收集包涵體。然后將包涵體溶解于 8M尿素IOOmM磷酸鈉50mM巰基乙醇iTris (pH 8. 0)緩沖中放置4小時(shí)，以20000g離心20 分鐘收集上清。將上清液上樣于用上述緩沖液預(yù)平衡過(guò)的Ni Sepharose HighPerformance (GE公司)親合柱，用8M尿素IOOmM磷酸鈉20mM咪唑緩沖液以pH 8. 0-4. 0進(jìn)行pH遞減洗脫， pH4. 0時(shí)得到純度大于90%的重組蛋白，如圖2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。將按上述方法從Ni+親合柱洗脫下來(lái)的含目的融合蛋白的洗脫物，按1 10的體積比迅速稀釋于含有3M尿素、IOOmM NaCl、20mMTris_HCl (pH 8. 0)、5mM還原態(tài)谷胱甘肽和 0. 05mM氧化態(tài)谷胱甘肽的溶液中以使蛋白質(zhì)重折疊(復(fù)性)。經(jīng)4°C放置48小時(shí)后透析于 PBS中，并用截留分子量為5000道爾頓的超濾膜濃縮，進(jìn)行蛋白純度分析，如圖3和圖4所
7J\ ο實(shí)施例3 本發(fā)明所述融合蛋白體外靶向性研究將人肝癌細(xì)胞株SMMC-772體外培養(yǎng)，消化離心，將上述細(xì)胞分別接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)板70 %左右，加入不同濃度的白細(xì)胞介素2及實(shí)施例1-2制備的本發(fā)明所述融合蛋白U-白介素2 (UIL)樣品(終濃度分別為2000IU/ml、1000IU/ml、500IU/ ml)，設(shè)PBS陰性對(duì)照組，加藥后作用約4h后棄上清，用PBS連續(xù)清洗三遍，沖洗干凈后加入密度30 X 104/ml的IL-2依賴(lài)型小鼠T淋巴細(xì)胞(CTLL-2)細(xì)胞1ml，過(guò)夜培養(yǎng)，第二天顯微鏡下觀察，待陰性對(duì)照孔CTLL-2細(xì)胞基本凋亡時(shí)，每孔加入5mg/ml的四甲基噻唑藍(lán)(MTT) 約IOOul，作用約4h，加入SDS-HCl裂解液過(guò)夜，酶標(biāo)儀570nm下測(cè)OD值，計(jì)算CTLL-2增殖率。計(jì)算公式CTLL_2增殖率=(0D加藥組/OD空白組-1) X 100%結(jié)果表明無(wú)靶向結(jié)合區(qū)的白細(xì)胞介素2(IL_2)與人胃癌細(xì)胞(SGC-7901)不結(jié)合，UIL能與之結(jié)合且呈劑量相關(guān)性，MTT顯色結(jié)果與顯微鏡下觀察結(jié)果一致(如圖5)，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)尿激酶受體，雖有差異但融合蛋白的靶向結(jié)合區(qū)可與之結(jié)合。實(shí)施例4 本發(fā)明所述融合蛋白體內(nèi)抗腫瘤活性研究將昆明小鼠腹腔接種小鼠肝癌細(xì)胞H22，接種密度1 X 106/ml,體積0. 2ml/只，接種后第二天開(kāi)始分組給藥，共分為5組，分別為生理鹽水組、白細(xì)胞介素2高劑量組 (8000IU/只)、白細(xì)胞介素2低劑量組(4000IU/只)、實(shí)施例1-2制備的本發(fā)明所述融合蛋白UIL高劑量組(8000IU/只)、實(shí)施例1-2制備的本發(fā)明所述融合蛋白UIL低劑量組 (4000IU/只)；每組10只小鼠，每天腹腔給藥一次，連續(xù)給藥12天后停止給藥，觀察至20 天，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，小鼠腹部平坦的視為腫瘤無(wú)進(jìn)展，小鼠腹部給藥部位由于瘤液滲出致使局部皮下鼓起的視為無(wú)明顯進(jìn)展，小鼠整個(gè)腹部明顯腫大的視為腫瘤重大進(jìn)展(參見(jiàn)圖 6)，分別統(tǒng)計(jì)各組腫瘤進(jìn)展情況；最終結(jié)果為生理鹽水組10只小鼠腹部均明顯腫大，腫瘤均出現(xiàn)重大進(jìn)展；白細(xì)胞介素2高劑量組有5只出現(xiàn)重大進(jìn)展，5只無(wú)進(jìn)展或明顯進(jìn)展；白細(xì)胞介素2低劑量組有7只出現(xiàn)重大進(jìn)展，3只無(wú)進(jìn)展或明顯進(jìn)展；UIL高劑量組有6只出現(xiàn)重大進(jìn)展，4只無(wú)進(jìn)展或明顯進(jìn)展；UIL低劑量組有5只出現(xiàn)重大進(jìn)展，5只無(wú)進(jìn)展或明顯進(jìn)展；最終的結(jié)果證明UIL低劑量組藥效要優(yōu)于白細(xì)胞介素2低劑量組(如表1所示)。表1、本發(fā)明所述融合蛋白體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，包括(1)特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞或者腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶向結(jié)合區(qū)；(2)白細(xì)胞介素。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白還包含由不多于10個(gè)氨基酸組成的連接區(qū)，用于連接所述靶向結(jié)合區(qū)和白細(xì)胞介素。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述白細(xì)胞介素為人源白細(xì)胞介素2， 具有如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1或2或3所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向結(jié)合區(qū)為不少于3個(gè)但不多于50個(gè)氨基酸的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向結(jié)合區(qū)為人源氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向結(jié)合區(qū)與尿激酶同源。
7.如權(quán)利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向結(jié)合區(qū)的氨基酸序列與尿激酶同源性不低于60%。
8.如權(quán)利要求6或7所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向結(jié)合區(qū)的氨基酸序列如 SEQ ID NO :2所示，或?yàn)镾EQ ID NO. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失、或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少有80%的一致性，且具有特異結(jié)合腫瘤細(xì)胞或者腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性。
9.如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述融合蛋白含有如SEQ ID NO 3的氨基酸序列。
10.編碼權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述融合蛋白的DNA分子。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的DNA分子，其特征在于，其含有如SEQIDNO :4所示的核苷酸序列。
12.—種表達(dá)盒，包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；受轉(zhuǎn)錄起始區(qū)調(diào)控的編碼權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述融合蛋白的DNA分子；以及轉(zhuǎn)錄中止區(qū)。
13.重組了編碼權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述融合蛋白DNA分子的表達(dá)載體。
14.如權(quán)利要求13所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為質(zhì)粒或病毒。
15.重組了編碼權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述融合蛋白的DNA分子的細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求15所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母菌或細(xì)菌。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞屬大腸桿菌，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3868。
18.一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其特征在于，轉(zhuǎn)染了編碼權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述融合蛋白的 DNA分子且表達(dá)所述融合蛋白。
19.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述融合蛋白的制備方法，包括提供權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)所述細(xì)胞或權(quán)利要求18所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；使細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)所述融合蛋白；以及分離所述融合蛋白。
20.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述融合蛋白在制造治療細(xì)胞過(guò)度增生導(dǎo)致的疾病的藥物中的用途。
21.如權(quán)利要求20所述的用途，其特征在于，所述疾病為癌癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種具有靶向性的白細(xì)胞介素融合蛋白、編碼該融合蛋白的DNA分子、含有該DNA序列的載體、含該載體的宿主細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、該融合蛋白的制備方法以及應(yīng)用。本發(fā)明所述融合蛋白從N端至C端包括靶向連接區(qū)、白細(xì)胞介素，根據(jù)情況可有不多于10個(gè)氨基酸組成的連接區(qū)，用于連接所述靶向結(jié)合區(qū)和白細(xì)胞介素。作為優(yōu)選，所述靶向結(jié)合區(qū)與尿激酶同源。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述融合蛋白可以提高靶向組織白細(xì)胞介素濃度，同時(shí)降低其他組織白細(xì)胞介素濃度，提高療效的同時(shí)減低IL-2副作用，可用于腫瘤治療，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P35/02GK102260353SQ20101059857
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者周兵, 周宇, 姜靜 申請(qǐng)人:山東先聲麥得津生物制藥有限公司