列。同時 在每一個引物末端加上RNA聚合酶結(jié)合序列，使多個的理想長度的DNA片段可同時在同一標(biāo) 記反應(yīng)中作為模板可以制備RNA探針。
[0030] 下表1比較了常規(guī)制備探針的方法與本發(fā)明所述的方法的異同。
[0031]
[0033]本發(fā)明所述的方法有利于篩選和制備高特異性探針，并可消除非編碼序列及其它 非特異性序列的影響。多重DNA片段的設(shè)計(jì)對檢測序列更有針對性，不僅排除了一些非編碼 序列及其它非特異性序列，也能使探針的特異性大大提高。
[0034] 本發(fā)明所述的方法有利于區(qū)分同源性序列及RNA的不同剪切形式。本發(fā)明多重DNA 片段的設(shè)計(jì)可根據(jù)檢測對象來確定加入或刪除一些同源性序列，也可以只包含或不包含不 同剪切形式而達(dá)檢測特異性目標(biāo)序列的目的。
[0035] 此外，本發(fā)明中設(shè)計(jì)引物時，在反向引物5'端加上啟動子序列或RNA聚合酶結(jié)合序 列，可確保每個片段都能轉(zhuǎn)錄成探針，針對目標(biāo)序列設(shè)計(jì)多對引物，能夠保證探針覆蓋靶基 因所有特異的區(qū)域。
【附圖說明】
[0036]圖1是以CA19_9cRNA為模板設(shè)計(jì)、制備及標(biāo)記RNA探針的原理不意圖。首先根據(jù)目 的序列CA19-9cRNA序列設(shè)計(jì)引物，引物的5 '端加上T7啟動子序列;再用PCR方法分別擴(kuò)增出 目的DNA片段并純化；以混合的PCR產(chǎn)物作為標(biāo)記模板，進(jìn)行RNA聚合酶反應(yīng)，將帶有生物素 標(biāo)記的UTP摻入產(chǎn)物中，純化后即得到RNA探針。
[0037] 圖2是采用本發(fā)明所述方法制備的RNA探針在FISH中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。用生物素標(biāo)記的 CA19-9cRNA探針檢測人胰腺癌細(xì)胞SW1990的CA19-9mRNA表達(dá)水平。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 實(shí)施例一：以CA19_9cDNA為模板制備RNA探針
[0039] 以CA19-9cDNA為模板制備RNA探針的過程參見圖1。
[0040] -、PCR引物的設(shè)計(jì)：
[0041 ] (1)在GenBank(http: //www.ncbi · nlm.nih · gov/genbank/)中查找CA19_9mRNA序 列，用NCBI BLAST(http: //blast .ncbi .nlm.nih. gov/Blast · cgi)排除其它非特異性RNA序 列。
[0042] (2)篩選2個無內(nèi)含子和重復(fù)序列特定序列區(qū)域，排除同源區(qū)域序列。
[0043] (3)所選的每個區(qū)域各設(shè)計(jì)至少一對引物，使擴(kuò)增產(chǎn)物長度為200_500bp，并覆蓋 CA19-9 全長。
[0044] 引物的設(shè)計(jì)：
[0045]
[0046] 上表所涉及的引物僅僅是舉例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明的原理設(shè)計(jì)出更 多的合適的引物。
[0047] (4)將T7啟動子序列加在反向引物的5'端，以確保PCR產(chǎn)物與目的片段互補(bǔ)并包含 全部靶序列。
[0048] T7 啟動子序列：5 ' -TAATACGACTCACTATAG-3'
[0049] T7啟動子序列可以用同類型的SP6啟動子序列、T3啟動子序列或Trc啟動子序列替 代。
[0050] 二、標(biāo)記模板的制備:通過PCR從cDNA質(zhì)粒模板(GeneCopoeia cDNA質(zhì)粒庫），擴(kuò)增 帶有T7啟動子的目的片段。
[0051 ] 三、RNA探針的制備：
[0052] 配置lOXNTPs，其中，ATP、CTP和GTP的濃度均為10mM，UTP的濃度為3.5mM。在一個 RNase-free(無 RNA酶）的EP中，在RNase-free的環(huán)境中操作，加入以下成分：
[0053]
[0055] (1)混勻反應(yīng)液，于37 °C下反應(yīng)2_3h。
[0056] (2)加入lyL DNase I(DNA聚合酶I)和5yL DNase I buffer(DNA聚合酶I緩沖液）， 混勻后于37°C下15min，以除去模板DNA。
[0057] (3)加入2yL 0.5M EDTA(PH 8.0)(乙二胺四乙酸），65°C下反應(yīng)lOmin以終止反應(yīng)。
[0058] (4)取2-3yL的產(chǎn)物電泳檢測，緩沖液用1 XM0PS(3-嗎啉丙磺酸）。
[0059] (5)加入100yL DEPC(焦碳酸二乙酯）水，150yL苯酚和200yL氯仿至EP管中，震蕩混 勾，lOOOOrpm 離心 10min。
[0060] (6)上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入等體積的異丙醇，混勻靜置10min后，12000rpm 離心10min，去上清。
[0061] (7) 75 %的酒精洗滌沉淀后，加 DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶解，測產(chǎn)物濃度并電泳檢 測，保存于-20 °C。
[0062] 由此，得到以CA19_9cDNA片段為模板制備的RNA探針。
[0063]將上述方法得到的生物素標(biāo)記的RNA探針用于檢測人胰腺癌細(xì)胞SW1990(購自 ATCC)的 CA19-9mRNA 表達(dá)水平。
[0064]在熒光顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。左圖：用DAPI即4 '，6-二脒基-2-苯基 口引噪(4'，6-diamidino_2-phenylindole)染色，藍(lán)色焚光顯示細(xì)胞核。中圖：用所述探針與 目的mRNA雜交，紅色熒光顯示人胰腺癌細(xì)胞SW1990的CA19-9mRNA分布及表達(dá)水平。右圖為 左圖與中圖的合成圖像，直觀地顯示細(xì)胞核與CA19-9mRNA的相對位置。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種以CA19-9 cDNA為模板制備RNA探針的方法，其特征在于，包括以下步驟： A. 針對CA19-9 mRNA序列篩選多個靶序列，對于每個靶序列設(shè)計(jì)至少一對引物，所述引 物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列； B. 從CA19-9 cDNA質(zhì)粒中，采用步驟A的所述引物，通過PCR擴(kuò)增得到所述多重DNA片段， 純化后混合，作為模板； C. 加入RNA聚合酶和帶有生物素標(biāo)記的UTP進(jìn)行反應(yīng)，將UTP摻入產(chǎn)物，純化后得到RNA 探針。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以CA19-9 cDNA為模板制備RNA探針的方法，其特征在于，所述 RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶，引物的5 '端加上T7啟動子序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以CA19-9 cDNA為模板制備RNA探針的方法，其特征在于，所述 RNA聚合酶是SP6 RNA聚合酶，引物的5 '端分別加上SP6啟動子序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以CA19-9 cDNA為模板制備RNA探針的方法，其特征在于，所述 RNA聚合酶是T3 RNA聚合酶，引物的5 '端分別加上T3啟動子序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以CA19-9 cDNA為模板制備RNA探針的方法，其特征在于，所述 RNA聚合酶是Trc RNA聚合酶，引物的5 '端分別加上Trc啟動子序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以CA19-9 cDNA為模板制備RNA探針的方法，其特征在于:所述 步驟A中，所述篩選包括:篩選2-50個無內(nèi)含子和重復(fù)序列的特定目標(biāo)序列區(qū)域，根據(jù)需要 可選擇同源區(qū)域序列，作為靶序列。7. -種快速檢測胰腺癌相關(guān)的CA19-9表達(dá)的試劑盒，其特征在于:包括根據(jù)權(quán)利要求1 所述的方法所制備的RNA探針。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種以CA19-9？cDNA為模板制備RNA探針的方法。該方法包括以下步驟：針對CA19-9？mRNA序列篩選多個靶序列，對于每個靶序列設(shè)計(jì)至少一對引物，所述引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；從CA19-9？cDNA質(zhì)粒中，采用上述引物，通過PCR擴(kuò)增得到所述多重DNA片段，純化后混合，作為模板；加入RNA聚合酶和帶有生物素標(biāo)記的UTP進(jìn)行反應(yīng)，將UTP摻入產(chǎn)物，純化后得到RNA探針。本發(fā)明得到的cRNA探針能夠全部覆蓋所有靶序列，簡化了探針制備步驟，大幅度縮短整個實(shí)驗(yàn)時間，探針特異性更高，穩(wěn)定性更強(qiáng)，背景信號更低且靈敏度更高。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了一種快速檢測胰腺癌相關(guān)的CA19-9表達(dá)的試劑盒。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/10, C12N15/11
【公開號】CN105567845
【申請?zhí)枴緾N201610083165
【發(fā)明人】徐學(xué)明, 魯隼, 馮俊清
【申請人】廣州復(fù)能基因有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年2月5日