以CA19-9 cDNA片段為模板制備RNA探針的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于核酸診斷領(lǐng)域，具體涉及一種以CA19-9cDNA片段為模板制備RNA探針 的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 焚光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)是一種重要的 非放射性原位雜交技術(shù)，熒光染料標記的特異核酸探針與細胞內(nèi)相應(yīng)的靶DNA或RNA分子雜 交，如果被檢測的染色體靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性， 由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而探針可以直接與染色體進行 雜交從而將特定的基因在染色體上定位。通過在熒光顯微鏡下觀察熒光信號，以確定與特 異探針雜交后結(jié)合了熒光探針的DNA區(qū)域或RNA分子在染色體或其他細胞器中的定位，對待 測DNA進行定性、定量或相對定位分析。
[0003] 熒光原位雜交技術(shù)(FISH)具有很多優(yōu)點，無需放射性同位素標記，安全性較高； FISH的實驗周期短，探針穩(wěn)定性強;通過多次免疫化學(xué)反應(yīng)，使其雜交信號放大，提高靈敏 度，檢測的靈敏度接近同位素探針雜交;FI SH的分辨率高達3-20Mb; FI SH可以用不同修飾核 苷酸分子標記不同的探針，即可以制備成多色探針。
[0004] FISH技術(shù)已經(jīng)在基因定位、基因作圖、基因擴增和缺失的檢測、產(chǎn)前診斷、哺乳動 物染色體進化研究等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，特別是在腫瘤診斷方面，F(xiàn)ISH技術(shù)被廣泛用于 乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤等實體瘤的早期診斷、療效檢測、個體化治療和預(yù)后判斷等幾 個方面。cRNA探針比cDNA探針有更多的優(yōu)勢:避免了雙鏈cDNA探針在雜交反應(yīng)中兩條鏈之 間易復(fù)性的可能性，提高了雜交反應(yīng)的敏感性;cRNA與RNA之間形成的雜交體比cDNA-RNA雜 交體更穩(wěn)定;且cRNA-RNA之間形成的雜交體不受RNA酶的影響，因此雜交反應(yīng)后可用RNA酶 處理，以除去未結(jié)合的探針，可降低本底信號的影響。
[0005] 制備特異性強、靈敏度高和穩(wěn)定性強的腫瘤檢測探針，生產(chǎn)易保存和運輸?shù)南嚓P(guān) 試劑及試劑盒，對腫瘤早期診斷和治療至關(guān)重要。研發(fā)出用于診斷和治療多種腫瘤的高品 質(zhì)探針及相關(guān)試劑盒，不僅能提高人民的健康水平，而且具有很大的經(jīng)濟效益、社會效益及 廣闊的市場前景。
[0006] CA19_9(carbohydrate antigen 19-9)是一種粘蛋白質(zhì)的糖類蛋白腫瘤標志物， 為細胞膜上的糖脂質(zhì)，因由鼠單克隆抗體119NS199-9識別而命名。CA19-9是一種分子量為 5000KD的低聚糖類腫瘤相關(guān)抗原，由內(nèi)胚層細胞分化而來的，正常人血清中含量甚微，而在 多種上皮類惡性腫瘤血清中均可見增高。
[0007] 在血清中CA19-9以唾液粘蛋白形式存在，分布于正常胎兒胰腺、膽囊、肝、腸和正 常成年人胰腺、膽管上皮等處。正常情況下CA19-9的合成量極微，但當(dāng)上述組織出現(xiàn)異常 時，尤其是惡性腫瘤時，其合成量可以顯著增加，造成血清中的CA19-9增加。CA19-9是迄今 報道的對胰腺癌敏感性最高的標志物，胰腺癌的CA19-9最高水平是正常均值的683倍，故其 是胰腺癌較好的標志物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種以CA19-9CDNA為模板制備RNA探針的方法。
[0009] 本發(fā)明所述的以CA19-9cDNA為模板制備RNA探針的方法，包括以下步驟:A.針對 CA19-9mRNA序列篩選多個靶序列，對于每個靶序列設(shè)計至少一對引物，所述引物的PCR擴增 產(chǎn)物為多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列;B.從CA19-9cDNA質(zhì)粒中，采用步 驟A的所述引物，通過PCR擴增得到所述多重DNA片段，純化后混合，作為模板;C.加入RNA聚 合酶和帶有生物素標記的UTP進行反應(yīng)，將UTP摻入產(chǎn)物，純化后得到RNA探針。
[0010]根據(jù)本發(fā)明所述的以CA19-9cDNA為模板制備RNA探針的方法的進一步特征，所述 RNA聚合酶是Trc RNA聚合酶，引物的5 '端分別加上Trc啟動子序列。
[0011] T7 啟動子序列：5 ' -TAATACGACTCACTATAG-3'
[0012] SP6啟動子序列：5 ' -CATACGATTTAGGTGACACTATA-3'
[0013] T3啟動子序列:5 ' -AATTAACCCTCACTAAAG-3'
[0014] Trc啟動子序列：5 ' -TGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAAT-3'
[0015] 上述四種RNA聚合酶與相應(yīng)啟動子的組合為同類型的設(shè)計，可以替換使用。
[0016]根據(jù)本發(fā)明所述的以CA19-9cDNA為模板制備RNA探針的方法的進一步特征，所述 步驟A中，所述篩選包括:篩選2-50個無內(nèi)含子和重復(fù)序列的特定目標序列區(qū)域，根據(jù)需要 可選擇同源區(qū)域序列，作為靶序列。
[0017] 本發(fā)明進一步提供了一種快速檢測胰腺癌相關(guān)的CA19-9表達的試劑盒
[0018] 本發(fā)明所述的試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明所述的方法所制備的RNA探針。
[0019] 本發(fā)明所述的方法只用一步反應(yīng)即可制備200-500nt理想長度的CA19-9CRNA探 針，并且可直接用于下一步的雜交試驗，可以提高試驗效率，節(jié)約檢測時間。探針制備過程 不需要堿裂解等步驟，可得到的探針長度均一性好，從而增強了探針特異性，降低了背景信 號干擾，并節(jié)約大量實驗時間。
[0020] 本發(fā)明所述的方法有利于篩選和制備高特異性CA19-9探針，并可消除非編碼RNA 等非特異性信號的影響。
[0021] 本發(fā)明所述的方法制備的CA19-9探針，其用途是生產(chǎn)在受試者樣本中區(qū)分胰腺癌 樣本和正常樣本的試劑盒。
[0022] 本發(fā)明還提供了用于在受試者樣本中區(qū)分胰腺癌樣本和正常樣本的試劑盒。
[0023] 本發(fā)明所述的用于在受試者樣本中區(qū)分胰腺癌樣本和正常樣本的試劑盒，包括： (a)適合于檢測胰腺癌的檢測試劑；以及(b)適合于測定由所述檢測試劑檢測的胰腺癌的定 量的設(shè)備。
[0024]本發(fā)明首次用多重DNA片段作為模板，針對CA19_9cDNA序列設(shè)計多對引物，并在反 向引物5'端加上啟動子或RNA聚合酶結(jié)合序列，以使最終得到的RNA探針能夠全部覆蓋所有 靶序列。本發(fā)明探針制備方法簡化了探針制備步驟，大幅度縮短整個實驗時間，更重要的 是，探針特異性和穩(wěn)定性更強，降低背景信號，靈敏度更高。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了多種 腫瘤初診快速檢測方面的新用途和相關(guān)的普遍適用的試劑盒。
[0025]傳統(tǒng)的探針標記方法直接以cDNA作為標記模板。制備檢測mRNA的探針時，一般是 應(yīng)用全長cDNA克隆質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物作為模板，利用RNA聚合酶或DNA聚合酶制備RNA或DNA探 針。但是，大部分基因 cDNA在lOOObp以上，如直接進行雜交反應(yīng)會因探針長度太長而不利于 進入細胞和雜交，且會產(chǎn)生非特異性背景信號。制備的RNA或DNA探針一般需堿裂解或DNA酶 處理，使探針裂解成lOOObp以下的片段。然而，RNA堿裂解或DNA酶處理過程和程度不易控 制，因此探針質(zhì)量難以保證。
[0026] 本發(fā)明所述的方法的優(yōu)勢在于:采用包含所述目的序列的多條DNA片段通過一步 反應(yīng)即可制備100-500nt理想長度的RNA探針，并且可直接用于下一步的雜交試驗。探針制 備過程不需要堿裂解等步驟，就可得到長度均一性好的探針，為雜交試驗理想長度的片段， 因此增強探針特異性，降低背景信號干擾，并節(jié)約大量實驗時間，提高了試驗效率。
[0027] 現(xiàn)有的RNA探針標記的方法都很難有效地將標記好的探針長度控制在這范圍內(nèi)。 因此，現(xiàn)有技術(shù)必須借助堿裂解(RNA探針)去降解標記好的探針以達到上述理想長度。
[0028] PCR反應(yīng)可以精確地控制產(chǎn)物的長度，但用PCR直接標記探針的效率不高，而且很 多用于PCR反應(yīng)的酶都不能有效地將標記的dUTP摻入到產(chǎn)物中去。PCR反應(yīng)也不能用于標記 RNA探針。
[0029] 本發(fā)明是利用PCR反應(yīng)可以精確控制產(chǎn)物長度的特點，用其制備多個的理想長度 的DNA片段作為模板去標記探針，這樣在DNA模板水平就有效地控制了標記的探針長度，制 備的RNA探針不用RNA堿裂解或DNA酶處理過程而直接用于雜交反應(yīng)。此外，用多個的理想長 度的DNA片段作為模板，還能根據(jù)檢測目的的需要而有效地覆蓋特定的目標基因序