上清，2 為純化后的目的蛋白LC3;
[0030] 圖2是本發(fā)明的醇脫氨酶LC3的最適反應(yīng)溫度示意圖；
[0031 ]圖3是本發(fā)明的醇脫氨酶LC3的最適反應(yīng)pH示意圖；
[0032] 圖4是共表達(dá)菌株質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；
[0033] 圖5是本發(fā)明的醇脫氨酶LC3上清、葡萄糖脫氨酶GDH上清、共表達(dá)醇脫氨酶LC3-葡 萄糖脫氨酶GDH上清的SDS-PAGE圖，其中，Μ為蛋白Marker，1為空載誘導(dǎo)后上清，2為L(zhǎng)C3誘導(dǎo) 后上清，3為GDH誘導(dǎo)后上清，4為L(zhǎng)C3-GDH共表達(dá)菌株誘導(dǎo)后上清；
[0034] 圖6是本發(fā)明的醇脫氨酶LC3的熱穩(wěn)定性示意圖；
[0035] 圖7是本發(fā)明的醇脫氨酶LC3與葡萄糖脫氨酶G畑雙菌禪合催化生成(R)-4-氯-3徑 基下酸乙醋的示意圖；
[0036] 圖8是本發(fā)明的醇脫氨酶LC3與葡萄糖脫氨酶GDH共表達(dá)菌株催化生成(R)-4-氯- 3-徑基下酸乙醋的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037] W下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，W下實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0038] 1.來源于雷氏乳酸桿菌的醇脫氨酶基因 lc3的擴(kuò)增
[0039] 本發(fā)明的醇脫氨酶基因 lc3來源于CCTCC Μ 20 1 1 38 1雷氏乳酸桿菌 (Lactobacillus curieae sp . Nov .)，基于NCBI (http ://www .ncbi .nlm. nih . gov/ Blast, cgi)的同源比對(duì)，本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一個(gè)與其相似性最高為81%的來源于 Lactobacillus p曰r曰f曰rr曰ginis的雙乙酉先還原酉每。
[0040] 本發(fā)明的醇脫氨酶LC3屬于短鏈脫氨酶家族，編碼該醇脫氨酶LC3的醇脫氨酶基因 lc3的核巧酸序列如SEQ ID N0:1所示，大小為77化P。
[0041] 采用上海生工生物革蘭氏陽性細(xì)菌基因組DNA小提試劑盒，并嚴(yán)格按照說明書上 的操作對(duì)雷氏乳酸桿菌進(jìn)行DNA樣品純化，得到雷氏乳酸桿菌化actobacillus curieae sp.Nov.)的全基因組。
[0042] 根據(jù)序列分析結(jié)果設(shè)計(jì)擴(kuò)增醇脫氨酶基因 lc3的引物：
[0043] 1c3F:5'CGCGGATCCATGGCAAAAGTTGCGATGA 3'
[0044] 1c3R:5'CCCAAGCTTAAAGCAATCCGCCGCCATC 3'
[0045] W上述獲得的雷氏乳酸桿菌的全基因組為模板，采用上面設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到醇脫氨酶基因 lc3。
[0046] 2.含有醇脫氨酶基因 lc3的重組質(zhì)粒（lc3-pET-28a)的構(gòu)建
[0047] 本發(fā)明的含有醇脫氨酶基因 lc3的重組質(zhì)粒是通過將醇脫氨酶基因 lc3與可選的 質(zhì)粒祀T-28a (作為表達(dá)載體)連接構(gòu)建而成。該醇脫氨酶基因 lc3與質(zhì)粒pET-28a的結(jié)合位 點(diǎn)是BamHI和化ndllKW雷氏乳酸桿菌的全基因組基因?yàn)槟０?，W設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物 lc3F/lc3R通過PCR擴(kuò)增，得到醇脫氨酶基因 lc3。
[004引 PCR擴(kuò)增體系如下（50yL):2XTaq Plus Master PCR Mix 2化L，引物化L，模板化 L，加 d地20補(bǔ)足至 25化。？0?擴(kuò)增條件：94°C5min; 94°C30sec，55°C30sec，72°C3min，30 個(gè)循 環(huán)；72°C5minJCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證大小W及膠回收純化。具體步驟按照 FAV0RGEN DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒，回收的基因片段和祀T-28a質(zhì)粒37°C下進(jìn)行雙酶切。 回收酶切片段并于16°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布在 卡那霉素抗性平板上，37°C倒置培養(yǎng)16h，挑取單菌落驗(yàn)證為陽性克隆后經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后 提取質(zhì)粒，獲得醇脫氨酶基因 lc3與質(zhì)粒祀T-2&1的重組質(zhì)粒lc3-pET-28a。
[0049] 3.含有醇脫氨酶基因 lc3的重組基因工程菌株的構(gòu)建
[0050] 將大腸桿菌化21 (DE3)接種于LB培養(yǎng)基，按照本領(lǐng)域常規(guī)方法制備化21感受態(tài)細(xì) 胞。
[0051 ] 將上述實(shí)施例2獲得的重組質(zhì)粒lc3-祀T-2&1轉(zhuǎn)入大腸桿菌化21感受態(tài)細(xì)胞，均勻 涂布在卡那霉素抗性平板上，37°C倒置培養(yǎng)16h，挑取單菌落驗(yàn)證為陽性克隆后經(jīng)LB培養(yǎng)基 培養(yǎng)獲得重組基因工程菌株。
[0052] 4.醇脫氨酶LC3蛋白的表達(dá)和純化
[0化3] 4.1將上述構(gòu)建的重組基因工程菌株接種于含LB(+l(K)yg/mL)培養(yǎng)基的試管中，37 °0搖床培養(yǎng)12h。
[0054] 4.2 W1 %的接種量接種到新鮮的液體LB ( +10化g/mL)培養(yǎng)基中，200轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速 下 37°C 搖至 00600 = 0.6，加1?了6至10化1/1^，20°(3誘導(dǎo)20}1。
[005日]4.3將培養(yǎng)基在4。C、8000rpm/min離屯、5min，收集菌體。將菌體用Tris-H化（pH 8.0)重懸，于低溫水浴中超聲破碎，將破碎后的粗酶液8000巧m離屯、lOmin后，吸取上清用 Ni-NTA Superflow Ca;rt;ridge脫鹽，濃縮，獲得目的蛋白，即醇脫氨酶LC3。
[0056] 4.4對(duì)獲得的目的蛋白進(jìn)行505斗466，結(jié)果如圖1所示，重組醇脫氨酶1〔3在大腸桿 菌中表達(dá)，在TPI-200洗脫條件下純化后為單一條帶。
[0057] 該醇脫氨酶LC3的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，共258個(gè)氨基酸，其理論分子量 為26.純0日。
[005引5.醇脫氨酶LC3的最適反應(yīng)溫度分析
[0059] 本發(fā)明的重組醇脫氨酶LC3的最適反應(yīng)溫度在25-65°C范圍內(nèi)測(cè)定。檢測(cè)的反應(yīng)體 系(200μ1)為：lOOmM憐酸鹽緩沖溶液(pH 6.0)，5mM 4-氯乙酷乙酸乙醋和9.25yg純蛋白（即 重組醇脫氨酶LC3)，0.2mM NADH，分別在25、30、35、40、45、50、55、60、65°C下反應(yīng)2min，測(cè)定 結(jié)果如圖2所示，對(duì)LC3最適反應(yīng)溫度分析發(fā)現(xiàn)醇脫氨酶LC3的最適反應(yīng)溫度為35°C，且在大 于35°C的反應(yīng)體系中酶活開始下降，65°C時(shí)酶幾乎失去活性。綜上所述，重組醇脫氨酶LC3 的最適反應(yīng)溫度為35°C。
[0060] 6.重組醇脫氨酶LC3的最適反應(yīng)pH值分析
[0061 ] 重組醇脫氨酶LC3的最適反應(yīng)抑在4.0-10.0范圍內(nèi)測(cè)定，檢測(cè)方法為:在不同抑緩 沖溶液中加入5mM 4-氯乙酷乙酸乙醋和9.25yg純蛋白（即重組醇脫氨酶LC3)，在30°C條件 下反應(yīng)2min，在WOnm波長(zhǎng)下測(cè)定吸收值，測(cè)定結(jié)果如圖6所示。測(cè)定所使用的緩沖液為： lOOmM巧樣酸鋼緩沖液(pH4.0-6.0)，lOOmM憐酸鋼緩沖液(pH 6.0-8.0)，lOOmM Tris-HCl緩 沖液(pH 8.0-9.0)，1 OOmM甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 9.0-10.0)。測(cè)定結(jié)果如圖3所示，表明： 重組醇脫氨酶LC3的最適pH為抑6.0的憐酸鹽緩沖溶液，在抑5.0-8.0范圍內(nèi)均具有較高 活性。
[0062] 7.重組醇脫氨酶LC3的酶學(xué)穩(wěn)定性分析
[0063] 重組醇脫氨酶LC3的熱穩(wěn)定性在30-60°C范圍內(nèi)測(cè)定，檢測(cè)方法為:將純化的醇脫 氨酶LC3酶液分別保溫在30°C、40°C、50°C和60°C條件下，然后間隔同樣時(shí)間取樣測(cè)定殘余 酶活，檢測(cè)的反應(yīng)體系（200μ1)為：lOOmM憐酸鹽緩沖溶液(pH 6.0)，5mM 4-氯乙酷乙酸乙醋 和9.25yg純蛋白（即重組醇脫氨酶LC3)，0.2mM NADH，在340nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸收值，分別在30 °C下反應(yīng)2min，測(cè)定結(jié)果如圖4所示，表明：重組醇脫氨酶LC3的熱穩(wěn)定性在溫度小于50°C時(shí) 很好;40°C時(shí)2地后還有70%的活力；50°C時(shí)，化酶活下降到30%，1化幾乎完全失活;60°C時(shí) 化就完全失活。
[0064] 綜上所述，該醇脫氨酶LC3具有優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)，催化還原范圍為25-50°C，催化還 原pH值為5.0-8.0，在40°C條件下24h后還有70 %的殘余酶活。
[0065] 8.醇脫氨酶基因 lc3與葡萄糖脫氨酶基因 g化的重組質(zhì)粒（lc3-g化-pET-28a)的構(gòu) 建
[0066] 本實(shí)施例中，本發(fā)明的含有醇脫氨酶基因 lc3與葡萄糖脫氨酶基因 g化的重組質(zhì)粒 是通過將醇脫氨酶基因 lc3W及來自枯草芽抱桿菌的葡萄糖脫氨酶基因 g化與質(zhì)粒祀T-28a (作為表達(dá)載體)連接構(gòu)建而成。該醇脫氨酶基因 lc3與質(zhì)粒pET-28a的結(jié)合位點(diǎn)是Ndel和 BamHI，葡萄糖脫氨酶g化與質(zhì)粒結(jié)合的位點(diǎn)是化ndin和趾〇1。W重組質(zhì)粒g化-祀T-2&1為 模板，W設(shè)計(jì)的含酶切位點(diǎn)化indIII、XhoI)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD似及間隔序列(AS)的引 物g化F/g化R通過PCR擴(kuò)增得到葡萄糖脫氨酶基因 g化。引物如下：
[0067] gdhF:5'CCCAAGCTTAAGGAGATATACATATGTATCCGGAT 3'