分泌抗柑橘黃化脈明病毒單抗的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種分泌抗相橘黃化脈明病毒單克隆抗體的 雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 相橘黃化脈明病由相橘黃化脈明病毒（Citrus yellow vein clearing virus, CYVCV)引起，該病毒屬于A1地aflexiviridae科相橘病毒屬的成員。該病最早于1988年在己 基斯坦被發(fā)現(xiàn)，目前在己基斯坦、印度、±耳其等國(guó)的相橘產(chǎn)區(qū)快速擴(kuò)散，對(duì)相橘產(chǎn)業(yè)造成 了嚴(yán)重的損失。該病造成巧樣、酸澄等相橘屬植物葉片的葉脈黃化及明脈，并伴有葉片反卷 和皺縮等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可至葉脈壞死、嫩葉脫落，造成樹(shù)勢(shì)衰弱、產(chǎn)量下降。最近，在我國(guó)西 南地區(qū)的云南、重慶相繼發(fā)現(xiàn)感染CYVCV的相橘樹(shù)。研究發(fā)現(xiàn)該病毒可W通過(guò)摩擦接種和曬 蟲(chóng)介體傳播到襲科和豆科植物上。相橘黃麥明病毒基因組全長(zhǎng)為7529個(gè)核巧酸，含有6個(gè)開(kāi) 放讀碼框(0RF)，其中0RF5編碼大小為32KDa的外殼蛋白。通過(guò)電鏡觀察純化的病毒粒子發(fā) 現(xiàn)該病毒為直徑為13-14nm，長(zhǎng)約685nm的卷曲線狀病毒。
[0003] 為了調(diào)查我國(guó)該相橘病毒病發(fā)病情況、強(qiáng)化我國(guó)相橘黃化脈明病毒病檢測(cè)和診斷 手段、科學(xué)指導(dǎo)防控，急需建立檢測(cè)相橘中CYVCV的高通量的檢測(cè)方法。目前，對(duì)CYVCV的檢 測(cè)和診斷僅用低效率的電鏡觀察、RT-PCR方法、核酸電泳等方法進(jìn)行小樣本檢測(cè)。本發(fā)明W 原核表達(dá)的CYVCV衣殼蛋白（CP)為抗原通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備了 1株分泌抗CYVCV的特異性單 抗的雜交瘤細(xì)胞株，W制備的單抗為核屯、建立檢測(cè)CYVCV的高通量的血清學(xué)方法及其試劑 盒，從而為我國(guó)相橘黃化脈明病毒的檢測(cè)和診斷、流行病學(xué)調(diào)查、無(wú)毒樹(shù)苗生產(chǎn)、病毒基因 組功能分析及其科學(xué)防控體系的建立提供物質(zhì)和技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗相橘黃化脈明病毒單克隆 抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用。
[000引分泌抗相橘黃化脈明病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株18H5,保藏號(hào)為CGMCC No. 12003,它能分泌抗相橘黃化脈明病毒單克隆抗體。
[0006] -種所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗相橘黃化脈明病毒單克隆抗體，抗相橘黃化脈 明病毒單克隆抗體腹水間接化ISA效價(jià)達(dá)1〇-7，抗體類型及亞類為IgGl、ka卵a(bǔ)輕鏈，該單克 隆抗體與相橘黃化脈明病毒32kD的外殼蛋白有特異性免疫反應(yīng)，利用TAS-化ISA方法分析 發(fā)現(xiàn)單抗檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:20480倍稀釋。
[0007] 抗相橘黃化脈明病毒單克隆抗體能與相橘黃化脈明病毒有特異性反應(yīng)，而不與相 橘衰退病毒、相橘碎葉病毒、蘋(píng)果莖痘病毒和蘋(píng)果莖溝病毒和健康的相橘葉片粗提液反應(yīng)。 [000引抗相橘黃化脈明病毒單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是W單克隆抗體為核屯、 建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
[0009]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果：1)提供的雜交瘤細(xì)胞株分泌抗相橘黃化 脈明病毒特異性單克隆抗體，W該單抗為核屯、建立的dot-ELISA、Tissue blot-ELISA、DAS- ELISA和TAS-化ISA等免疫學(xué)方法及用運(yùn)些方法建立的試劑盒能高度特異、準(zhǔn)確、靈敏地檢 測(cè)相橘黃化脈明病毒;2)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體檢測(cè)相橘黃化脈明病毒，不需要 昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設(shè)備;3)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體，可有效地用于田間 相橘黃化脈明病毒的檢測(cè)和診斷，也可用于該病毒病的流行病學(xué)調(diào)查、病毒基因組功能分 析、脫毒樹(shù)苗生產(chǎn)、抗性育種、科學(xué)防控等方面。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1是dot-ELISA方法檢測(cè)相橘黃化脈明病毒(CYVCV)的靈敏度分析；
[0011] 圖2是dot-ELISA方法檢測(cè)相橘黃化脈明病毒特異性分析。
[001^ 圖4.腳斗0?對(duì)田間疑似發(fā)病相橘樣品檢測(cè)結(jié)果
[0013] 圖5 Tissue blot-ELISA田間檢測(cè)CYVCV代表性結(jié)果
[0014] 生物保藏
[0015] 分泌抗相橘黃化脈明病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1細(xì)5,于2016年1月7日，保 藏于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，地址:北 京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編：100101，保藏號(hào)為CGMCC No. 12003,它能分泌抗相橘 黃化脈明病毒的單克隆抗體。
【具體實(shí)施方式】
[0016] -種所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗相橘黃化脈明病毒單克隆抗體，抗相橘黃化脈 明病毒單克隆抗體腹水間接化ISA效價(jià)達(dá)10-7，抗體類型及亞類為IgGl、ka卵a(bǔ)輕鏈，該單克 隆抗體能與相橘黃化脈明病毒32kDa的外殼蛋白有特異性免疫反應(yīng)，利用TAS-ELISA方法分 析發(fā)現(xiàn)單抗檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:20480倍稀釋。
[0017] 抗相橘黃化脈明病毒單克隆抗體能與相橘黃化脈明病毒有特異性反應(yīng)，而不與相 橘衰退病毒、相橘碎葉病毒、蘋(píng)果莖痘病毒和蘋(píng)果莖溝病毒和健康的相橘葉片粗提液反應(yīng)。
[0018] 抗相橘黃化脈明病毒單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是W單克隆抗體為核屯、 建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
[0019] 本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株能大量分泌抗相橘黃化脈明病毒單抗，且該分泌單抗 特異性強(qiáng)、效價(jià)高、穩(wěn)定性好、靈敏度高。W該單抗為核屯、建立檢巧UCYVCV的高通量的血清學(xué) 方法及其試劑盒，可成功應(yīng)用于田間CYVCV的檢測(cè)，從而為我國(guó)相橘黃化脈明病毒病檢測(cè)和 診斷、脫毒樹(shù)苗的生產(chǎn)、科學(xué)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0021] -、雜交瘤細(xì)胞獲得及其單克隆抗體的制備
[0022] 1.免疫原及檢測(cè)抗原的制備
[0023] 根據(jù)GenBank中報(bào)道的CYVCV的衣殼蛋白基因（CP)序列(accession no.JX040635) 設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物：CP-F(5 ' -ACGGATCCATGAGCTTCGACTAC ACTCA-3 '，劃線部分為BamH I酶 切位點(diǎn)）和CP-R(5 ' -CGGAGCTCTTAGA TGTTGAAAGGGGTCGG-3 '，劃線部分為Sac I酶切位點(diǎn)）， 并由上海英驗(yàn)生物技術(shù)有限公司合成。利用常規(guī)TRizol法提取相橘病葉總RNA(具體操作參 照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行），WRNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA:總RNA變性65°C5min后冰浴5min，然后在 一滅菌離屯、管中加入下列試劑：
[0024]
[00巧]反轉(zhuǎn)錄參數(shù)設(shè)置:37。02〇111111，98。05111111，4。(31〇111111。反轉(zhuǎn)錄后用高保真1(00斗0?擴(kuò) 增CYVCV CP，PCR反應(yīng)體系巧0μ1):去離子此0 34.扣l、MgS〇4：3yl、KOD plus Neo Buffer 扣 1、dNTP扣1、CP-F和CP-R引物各1μ1、反轉(zhuǎn)錄cDNA模板0 .扣1 ePCR反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性94°C 2min，變性98°C 10s，退火52°C35s，延伸68°C45s，35個(gè)循環(huán)，最后68°C延伸lOmin JCR擴(kuò)增產(chǎn) 物于0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，并用DM凝膠回收試劑盒(AxyGEN)回收CYVCV CP基因 片段，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將純化的CYVCV CP基因和祀T-32a載體分別用BamH I和Sac I進(jìn)行雙酶切，CYVCV CP基因和祀Τ-3^ι載體的酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠 電泳，并用DNA凝膠回收試劑盒(AxyGEN)分別回收酶切片段，酶切回收的PCR產(chǎn)物和祀T-32a 載體在T4DNA連接酶的作用下構(gòu)建成重組載體pET-32a-CP，并42°C熱擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH 5α的感受態(tài)細(xì)胞中，用質(zhì)粒提取試劑盒(AxyGEN)提取重組質(zhì)粒，對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR 和雙酶切鑒定后通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證重組克隆載體祀T-32a-CP中所攜帶的CP基因序列及讀碼框 的正確性，序列分析軟件為DNAstar、NCBI-化AST、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。把原核表達(dá)質(zhì)粒pET- 32a-CP 42°C熱擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株化21 (DE3)中，挑取單菌落接種到含氨節(jié)青霉素 抗性的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，第二天早上按1:100的比例將培養(yǎng)物接種于含氨節(jié)青 霉素抗性的新鮮LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至0D600 - 0.5，加入終濃度為ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)化， 離屯、收集菌體。部分菌體加入2XSDS-PAGE上樣緩沖液懸浮，沸水中處理5-10min，12 OOOr