-pr imer-F: 5 ' ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC3 ' 和 AhRESS-primer-R:5'TTATATGGCCACACTGCGGAGAAC 3'。PCR反應(yīng)條件為：94°C 5 min一（94°C 30 s一57°C 30 s一72°C 1.5 min)35巧cles一72°C 10 min一4°C保存。結(jié)果表明，AhRESS 基因已經(jīng)整合到本生煙草發(fā)狀根基因組中。
[0050] 【實(shí)施例6】轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根AhRESS基因 RT-PCR鑒定 1.轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根總RNA的提取 取1 g發(fā)狀根置于研鉢中加液氮研磨，取o.lg倒入預(yù)冷的0.5ml異硫氯酸脈變性勻漿 液中，充分混勻Imin。加入0.1ml 2mol/L NaAc (抑4.0)混勻Imin;加入0.5ml水飽和酪，振 蕩30秒，冰浴5min。加入0.2ml氯仿:異戊醇(24:1)，劇烈振蕩2次3min，冰上放置lOmin。4°(3， 12000g離屯、15min。小屯、移取上層水相，棄去中間和下層有機(jī)相。加入等體積酪:氯仿：異戊 醇(25:24:1)，振蕩2次3min，冰上放置5min。4°C，12000g離屯、10-15min，移取上層水相，棄去 中間和下層有機(jī)相。加入等體積異丙醇，放置-20°C 30分種W沉淀RNA"4°C，12000g離屯、 15min收集RNA沉淀，用75%乙醇洗涂沉淀；將RNA沉淀在空氣中干燥。用30ul R化se-free d地20或去離子甲酯胺溶解RNA沉淀。
[0051 ] 2.轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根RT-PCR 取轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根總RNA lyg，按按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的反應(yīng)體系，進(jìn)行逆轉(zhuǎn) 錄。W化1稀釋3倍的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，依次加入滅菌蒸饋水14.化1 aOXPCR Bufferll (Mg2+ plus)化1，Taq O.lyl'dNTP Mixture(2.5m)1.50yl，AhRESS-p;rime;r-F( 5' ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC3'）和AhRESS-primer-R(5'TTATATGGCCACACTGCGGAGAAC 3'）各 O-SylnPCR反應(yīng)條件為：94°C 5 min一（94°C 30 s一57°C 30 s一72°C 1.5 min)35巧cles 一72°C 10 min一4°C保存。RT-PCR電泳結(jié)果如圖2,表明AhRESS基因已在轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā) 狀根中表達(dá)。
[0052] 【實(shí)施例7】轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根白襲蘆醇的提取 取-80°C保藏的發(fā)狀根，準(zhǔn)確稱重0.5 g，于液氮中研磨充分，分別置于離屯、管中，加入5 mL甲醇，于60°C水浴中提取1 h，6000 rpm離屯、10 min,收集上清，重復(fù)Ξ次，合并上清液， 過濾后于45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用甲醇定容至2 mL，用0.22 WI1濾膜過濾，得到預(yù)處理的樣 品洛液，備用。
[0053] 【實(shí)施例8】轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根白襲蘆醇含量的HPLC測定 1.白襲蘆醇HPLC檢測色譜條件:色譜柱0DS (250 mmX4.6 mmX5皿），流動(dòng)相乙臘： 水(25:75)，流速1.〇11117111111，檢測波長306 11111，柱溫25°(3，進(jìn)樣量10化。
[0054] 2.白襲蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的制備:精確稱取白襲蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用甲醇(色 譜純)溶解并定容至50 mL，得到100 mg/L的白襲蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，置于4°C冰箱中避光保 存，備用。
[005引3.白襲蘆醇標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備：分別準(zhǔn)確移取白襲蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL用甲醇(色譜純)稀釋并定容至1000 mL，得到一系列的白襲蘆醇標(biāo)準(zhǔn) 品工作液，其質(zhì)量濃度分別為0.20 mg/L、0.40 mg/L、0.60 mg/L、0.80 mg/L、1.00 mg/L。 [0056] 4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：W質(zhì)量濃度分別為0.20 mg/L、0.40 mg/L、0.60 mg/L、0.80 mg/L、1.00 mg/L的白襲蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10化分別進(jìn)樣，測得峰面積與白襲蘆醇含量之間 的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 5.發(fā)狀根中白襲蘆醇含量的測定:取預(yù)處理樣品溶液各10化進(jìn)樣，每樣品各做Ξ個(gè) 重復(fù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出各株系發(fā)狀根中白襲蘆醇的含量，取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果表 明，利用有機(jī)溶劑浸提法提取轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根中白襲蘆醇，經(jīng)高效液相色譜(HPLC) 測定，其白襲蘆醇含量最高為1.59yg/g(FW)，是未轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根中白襲蘆醇含量的3倍（圖 4)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 啟動(dòng)子NtR2驅(qū)動(dòng)AhRESS在本生煙草發(fā)狀根產(chǎn)白藜蘆醇方法，其特征在于:包括以下 步驟： (1) 克隆煙草根特異啟動(dòng)子NtR2和花生AhRESS基因； (2) 煙草根特異啟動(dòng)子NtR2驅(qū)動(dòng)花生AhRESS基因表達(dá)載體pBI121-NtR2-AhRESS的構(gòu) 建； (3 )pBI 12 l-NtR2-AhRESS經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化本生煙草； (4) 轉(zhuǎn)pBI 121-NtR2-AhRESS本生煙草發(fā)狀根液體懸浮培養(yǎng)； (5) 轉(zhuǎn)pBI121-NtR2-AhRESS本生煙草發(fā)狀根白藜蘆醇含量的檢測。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子NtR2驅(qū)動(dòng)AhRESS在本生煙草發(fā)狀根產(chǎn)白藜蘆醇方法， 其特征在于:所述步驟（1)中煙草根特異啟動(dòng)子NtR2的序列為SEQ ID No: 1，花生AhRESS基 因的序列為SEQ ID No:2。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子NtR2驅(qū)動(dòng)AhRESS在本生煙草發(fā)狀根產(chǎn)白藜蘆醇方法， 其特征在于:步驟(2)具體方法為： 1) 將煙草根特異啟動(dòng)子NtR2連接至pMD18-T載體中，得到pMD18-NtR2載體； 2. pBI 12l-NtR2-GUSA載體構(gòu)建:將pBI 121載體進(jìn)行酶切，切除該載體上的⑶SA基因，從 pCAMBIA-1301載體中克隆GUSA基因連接至pBI121載體上，構(gòu)建pBI121-GUSA;將pBI121-GUSA載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，切除35S啟動(dòng)子，將pMD18-NtR2載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，將NtR2啟動(dòng)子 連接至pB1121-GUSA載體中，得到pB1121 -NtR2-GUSA載體； 3. pBI121-NtR2-AhRESS 載體的構(gòu)建：花生 AhRESS 基因連接到 pBI121-NtR2-GUSA 載體 中，得到pBI121-NtR2-AhRESS載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子NtR2驅(qū)動(dòng)AhRESS在本生煙草發(fā)狀根產(chǎn)白藜蘆醇方法， 其特征在于:所述步驟(3)中發(fā)根農(nóng)桿菌其介導(dǎo)的本生煙草遺傳轉(zhuǎn)化采用葉盤法。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子NtR2驅(qū)動(dòng)AhRESS在本生煙草發(fā)狀根產(chǎn)白藜蘆醇方法， 其特征在于:所述步驟(4)中轉(zhuǎn)pBI121-NtR2-AhRESS本生煙草發(fā)狀根液體懸浮培養(yǎng)所用培 養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+500 mg/L Cef，第一次繼代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+300 mg/L Cef，第二次繼 代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+100 mg/L Cef，第三次繼代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，三次繼代后頭孢霉素 濃度降至0。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子NtR2驅(qū)動(dòng)AhRESS在本生煙草發(fā)狀根產(chǎn)白藜蘆醇方法， 其特征在于:所述步驟(5)中轉(zhuǎn)pBI121-NtR2-AhRESS本生煙草發(fā)狀根白藜蘆醇含量的檢測 方法為HPLC，色譜條件為:色譜柱0DS，流動(dòng)相乙腈:水=25:75，流速1.0 mL/min，檢測波長 306 nm，柱溫25°C，進(jìn)樣量 10 yL〇
【專利摘要】本發(fā)明涉及啟動(dòng)子NtR2驅(qū)動(dòng)AhRESS在本生煙草發(fā)狀根產(chǎn)白藜蘆醇方法，屬于植物基因工程領(lǐng)域。利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)將煙草根特異啟動(dòng)子NtR2驅(qū)動(dòng)花生白藜蘆醇合酶基因AhRESS載體pBI121-NtR2-AhRESS遺傳轉(zhuǎn)化本生煙草，獲得特異表達(dá)AhRESS的轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根。通過轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根的液體懸浮培養(yǎng)技術(shù)，建立了轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根的快速繁殖體系。利用有機(jī)溶劑浸提法提取轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根中白藜蘆醇，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）測定，其白藜蘆醇含量最高為1.59μg/g（FW），是未轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根中白藜蘆醇含量的3倍。
【IPC分類】A01H5/06, C12N15/82
【公開號(hào)】CN105505983
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610025959
【發(fā)明人】鄧燁, 莊偉建, 馬世偉, 陳華, 蔡鐵城, 張沖
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2016年1月15日