一種熒光標(biāo)記載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化柳枝稷原生質(zhì)體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種熒光標(biāo)記載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化柳枝稷原生質(zhì)體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]原生質(zhì)體是去除了植物細(xì)胞壁的有活力的細(xì)胞，不僅是植物生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、體細(xì)胞遺傳學(xué)等理論研究的理想材料，而且在生理生化研究、基因表達(dá)調(diào)控研究、基因定位研究、細(xì)胞器制備、細(xì)胞融合、新品種培育等方面也有重要用途。
[0003]利用葉肉原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)可以研究基因的功能和調(diào)控。分離的葉肉原生質(zhì)體通常是活性較高的均一的細(xì)胞群體，適用于藥理學(xué)和生化方面的研究、早期和瞬時(shí)應(yīng)答研究及DNA轉(zhuǎn)化。因此，建立原生質(zhì)體的分離、轉(zhuǎn)化及蛋白質(zhì)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，對目的基因的功能和調(diào)控研究具有重要意義。
[0004]柳枝稷(英文名Switchgrass J_iTSPanicum virgatum)為禾本科多年生草本C4類植物，原生于北美地區(qū)，具有栽培簡單、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣、生物量大等特點(diǎn)，最初主要被用來作為飼料作物以及園林作物，20世紀(jì)80年代，美國能源部門(US Department OfEnergy,DOE)將其選為模式能源植物。此后，各國均加大了對柳枝稷的研究。目前國內(nèi)外對柳枝稷的研究主要集中在農(nóng)業(yè)科學(xué)、環(huán)境科學(xué)以及生物能源轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域，對柳枝稷功能基因組的研究處于初級(jí)階段。柳枝稷具有很多的優(yōu)良性狀，如耐旱、耐貧瘠、抗病蟲害、植株高大、分蘗多等，具有大量優(yōu)良基因資源，因此在柳枝稷中開展功能基因研究具有重要意義。作為常規(guī)的功能研究手段的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化研究在柳枝稷中較少進(jìn)行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明解決的問題在于提供一種熒光標(biāo)記載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化柳枝稷原生質(zhì)體方法，為在柳枝稷本身細(xì)胞中研究目的基因功能。為柳枝稷功能基因研究提供技術(shù)支持。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0007]—種熒光載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化柳枝稷原生質(zhì)體的方法，包括以下操作:
[0008]I)將柳枝稷種植在營養(yǎng)缽中，于30°C下、16h/8h光照/黑暗的光周期生長，生長至5?8cm;
[0009]2)取培養(yǎng)的柳枝稷幼苗地上部分8?1g，切成細(xì)絲后放入甘露醇中預(yù)培養(yǎng)8?15min，過濾取出后將柳枝稷組織放入酶解液中裂解，28°C暗培養(yǎng)箱中輕搖4?5小時(shí)；
[0010]3)裂解后用細(xì)胞篩過濾，得到含有原生質(zhì)體的溶液，離心沉淀后用W5溶液洗滌，調(diào)節(jié)原生質(zhì)體細(xì)胞濃度達(dá)到106個(gè)/ml;冰上放置20?30min;
[0011]4)取10ul原生質(zhì)體加入1ug純化去內(nèi)毒素的帶有熒光標(biāo)記的質(zhì)粒，輕柔混勻;再加入等體積轉(zhuǎn)化緩沖液，輕柔混勻;置入28°C暗培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)20分鐘；
[0012]所述的轉(zhuǎn)化緩沖液包括:0.6M甘露醇、10mM Cacl2和40%體積的PEG4000 ；
[0013]5)轉(zhuǎn)化過的原生質(zhì)體用W5溶液洗滌，去除轉(zhuǎn)化緩沖液，加入W5溶液置入細(xì)胞板中，避光靜置培養(yǎng)16-18小時(shí)；
[0014]6)將轉(zhuǎn)化體后原生質(zhì)體吸入離心管中離心去除多余上清，熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。
[0015]所述W5溶液為:154mMNaCl、125mM CaC12、5mM KCl、5mM glucose、質(zhì)量百分比
0.03%的MES用KOH調(diào)pH值至5.8，高溫高壓滅菌20分鐘。
[0016]所述的酶解液的配制為:0.6M甘露醇、1mM pH5.7的MES，質(zhì)量百分比1.5%的纖維素酶RS、質(zhì)量百分比0.75%的離析酶RlO混合后，55°C水浴15分鐘冷卻至室溫，再加入質(zhì)量百分比0.1 % 的BSA，3.4mMCacl2，5πιΜβ-巰基乙醇和 100yg/ml氨芐。
[0017]所述的高度純化去內(nèi)毒素的帶有熒光標(biāo)記的質(zhì)粒為Puc35SGFP，其主要元件排列順序?yàn)長ACZ藍(lán)白斑篩選報(bào)告基因(397-185)、N0S終止子(663-397)、EGFP(1383-664)、多克隆位點(diǎn)(1453-1389)、35S啟動(dòng)子(1997-1453)、氨芐抗性基因啟動(dòng)子及氨芐抗性基因(4223-3169)和細(xì)菌復(fù)制子起始位點(diǎn)(3042-2365)。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0019]以往柳枝稷基因功能研究包括亞細(xì)胞定位和蛋白質(zhì)相互作用等，需要借助洋蔥細(xì)胞或者煙草葉片的異源細(xì)胞，研究有可能不能反映柳枝稷體內(nèi)真實(shí)情況。本發(fā)明提供的方法使得相關(guān)研究可以在柳枝稷本身的細(xì)胞中進(jìn)行，使得研究柳枝稷目的基因的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠。
[0020]柳枝稷熒光標(biāo)記載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化柳枝稷原生質(zhì)體細(xì)胞的方法，未涉及到復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，方便易行。本發(fā)明所用材料為溫室或培養(yǎng)箱中生長的柳枝稷幼苗，不受生長季節(jié)的限制，實(shí)驗(yàn)隨時(shí)可以進(jìn)行。柳枝稷葉片和葉鞘纖維素含量相對于雙子葉植物組織較高，本發(fā)明中使用1.5 %纖維素酶RS和0.75 %離析酶RlO共同酶解柳枝稷細(xì)胞，獲得較為理想的原生質(zhì)體，能夠取得較好的轉(zhuǎn)染效果。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為質(zhì)粒圖譜。
[0022]圖2為裂解柳枝稷原生質(zhì)體所用材料。
[0023]圖3為裂解出來的原生質(zhì)體。
[0024]圖4為熒光顯微鏡下熒光蛋白表達(dá)的原生質(zhì)體細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0026]本發(fā)明提供一種高效的熒光標(biāo)簽載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化柳枝稷原生質(zhì)體的技術(shù)，目的是為在柳枝稷本身細(xì)胞中研究目的基因功能。具有簡單、易行、高效的特點(diǎn)。下面結(jié)合具體實(shí)施方案對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0027]材料準(zhǔn)備:將柳枝稷(Alamno)種植在營養(yǎng)缽中，于30°C下、16/8光照/黑暗的光周期生長20天，生長至5_8cm0
[0028]配制各緩沖液:
[0029]酶解液:0.6M甘露醇，10mMMES(pH5.7),質(zhì)量百分比1.5%的纖維素酶RS，質(zhì)量百分比0.75%的離析酶R1。55°C水浴15分鐘冷卻至室溫，再加入質(zhì)量百分比0.1 % BSA，
3.4mMCacl2，5πιΜβ-巰基乙醇和 50ug/ml 氨芐。
[0030]W5溶液:154mM NaCl，125mMCaCl2，5mMKCl，5mMglucose，質(zhì)量百分比0.03 % 的MES用KOH調(diào)pH值至5.8，高溫高壓滅菌20分鐘，4°C保存。
[0031 ] 轉(zhuǎn)化緩沖液:0.6M甘露醇，10mM Cacl2,40%體積的PEG4000，徹底溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0032]參見圖1，本發(fā)明所采用的質(zhì)粒為Puc35SGFP，其主要元件排列順序?yàn)長ACZ藍(lán)白斑篩選報(bào)告基因(397-185 )、N0S終止子(663-397 )、EGFP( 1383-664)、多克隆位點(diǎn)(1453-1389)、35S啟動(dòng)子(1997-1453)、氨芐抗性基因啟動(dòng)子及氨芐抗性基因(4223-3169)和細(xì)菌復(fù)制子起始位點(diǎn)(3042-2365)。
[0033]酶解:取柳枝稷地上部分1g，用鋒利刀片切割成細(xì)絲，放入濃度為1ml0.6M的甘露醇溶液中預(yù)培養(yǎng)1min。過濾后放入酶解液中，28°C暗培養(yǎng)箱中輕搖5小時(shí)。裂解出原生質(zhì)體鏡檢待用。
[0034]洗滌:裂解好的組織用200目細(xì)胞篩過濾，得到含有原生質(zhì)體的溶液，300g離心5分鐘后，沉淀即為原生質(zhì)體細(xì)胞。用W5重懸后離心(300g，5分鐘)去除上清，重復(fù)一次。加入適量W5溶液使原生質(zhì)體細(xì)胞濃度達(dá)到16個(gè)/ml。冰上放置30分鐘。
[0035]原生質(zhì)體細(xì)胞轉(zhuǎn)化:取ΙΟΟμΙ原生質(zhì)體加入1yg去內(nèi)毒素質(zhì)粒，輕柔混勻。再加入等體積轉(zhuǎn)化緩沖液，輕柔混勻。置入28°C暗培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)20分鐘。
[0036]原生質(zhì)體細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng):轉(zhuǎn)化過的原生質(zhì)體用W5溶液洗滌，去除轉(zhuǎn)化緩沖液，加入Iml W5溶液置入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，避光靜置培養(yǎng)16-18小時(shí)。
[0037]吸入離心管中300g離心2分鐘去除多余上清，留少量底部供觀察。
[0038]觀察轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體細(xì)胞:用熒光顯微鏡觀察488nm激發(fā)觀察綠色熒光以觀察GFP表達(dá)情況。
[0039]觀察結(jié)果如圖4所示，可以看到綠色熒光，而且熒光非常明顯，表明轉(zhuǎn)染效果良好。
[0040]以上給出的實(shí)施例是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明較優(yōu)的例子，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案的技術(shù)特征所做出的任何非本質(zhì)的添加、替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種熒光載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化柳枝稷原生質(zhì)體的方法，其特征在于，包括以下操作: 1)將柳枝稷種植在營養(yǎng)缽中，于30°C下、16h/8h光照/黑暗的光周期生長，生長至5?8cm； 2)取培養(yǎng)的柳枝稷幼苗地上部分8?10g，切成細(xì)絲后放入甘露醇中預(yù)培養(yǎng)8?15min，過濾取出后將柳枝稷組織放入酶解液中裂解，28°C暗培養(yǎng)箱中輕搖4?5小時(shí)； 3)裂解后用細(xì)胞篩過濾，得到含有原生質(zhì)體的溶液，離心沉淀后用W5溶液洗滌，調(diào)節(jié)原生質(zhì)體細(xì)胞濃度達(dá)到16個(gè)/ml;冰上放置20?30min; 4)取10ul原生質(zhì)體加入1ug純化去內(nèi)毒素的帶有熒光標(biāo)記的質(zhì)粒，輕柔混勻;再加入等體積轉(zhuǎn)化緩沖液，輕柔混勻;置入28°C暗培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)20分鐘； 所述的轉(zhuǎn)化緩沖液包括:0.6M甘露醇、10mM Cacl2和40%體積的PEG4000 ； 5)轉(zhuǎn)化過的原生質(zhì)體用W5溶液洗滌，去除轉(zhuǎn)化緩沖液，加入W5溶液置入細(xì)胞板中，避光靜置培養(yǎng)16-18小時(shí)； 6)將轉(zhuǎn)化體后原生質(zhì)體吸入離心管中離心去除多余上清，熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。2.如權(quán)利要求1所述的熒光載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化柳枝稷原生質(zhì)體的方法，其特征在于，所述W5溶液為:154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、5mM glucose、質(zhì)量百分比0.03% 的MES用KOH調(diào)pH值至5.8，高溫高壓滅菌20分鐘。3.如權(quán)利要求1所述的熒光載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化柳枝稷原生質(zhì)體的方法，其特征在于，所述的酶解液的配制為:0.6M甘露醇、1mM pH5.7的MES，質(zhì)量百分比1.5 %的纖維素酶RS、質(zhì)量百分比0.75%的離析酶RlO混合后，55°C水浴15分鐘冷卻至室溫，再加入質(zhì)量百分比0.1 %的BSA, 3.4mMCacl2,5πιΜβ-疏基乙醇和 100yg/ml 氛節(jié)。4.如權(quán)利要求1所述的熒光載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化柳枝稷原生質(zhì)體的方法，其特征在于，所述的高度純化去內(nèi)毒素的帶有熒光標(biāo)記的質(zhì)粒為Puc35SGFP，其主要元件排列順序?yàn)長ACZ藍(lán)白斑篩選報(bào)告基因(397-185)、N0S終止子(663-397)、EGFP(1383-664)、多克隆位點(diǎn)(1453-1389)、35S啟動(dòng)子(1997-1453)、氨芐抗性基因啟動(dòng)子及氨芐抗性基因(4223-3169)和細(xì)菌復(fù)制子起始位點(diǎn)(3042-2365)。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種含GFP熒光標(biāo)記質(zhì)粒轉(zhuǎn)化柳枝稷原生質(zhì)體的方法，柳枝稷種子播種后生長20天取植株地上部分，切成細(xì)絲放入到酶解液中，28℃消化細(xì)胞壁5小時(shí)；用細(xì)胞篩過濾得到含有原生質(zhì)體細(xì)胞的溶液；經(jīng)過W5溶液洗滌獲得健康原生質(zhì)體細(xì)胞。加入熒光標(biāo)記質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化緩沖液，28℃轉(zhuǎn)化20分鐘；除去轉(zhuǎn)化緩沖液，在W5溶液中28℃暗培養(yǎng)16-18小時(shí)后，熒光顯微鏡下進(jìn)行檢測。本發(fā)明所述方法具有簡單高效的特點(diǎn)，可為柳枝稷基因功能研究提供技術(shù)支持。
【IPC分類】C12N15/82
【公開號(hào)】CN105505980
【申請?zhí)枴緾N201510960660
【發(fā)明人】孫風(fēng)麗, 奚亞軍, 張舒夢, 劉曙東, 張超
【申請人】西北農(nóng)林科技大學(xué)
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月19日