序。測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒即為PMD18-AhRESS. 利用限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI將pMD18-AhRESS載體進行酶切，酶切體系如下：2.化g 質(zhì)粒DNA，5.0化10XKbuffer，2.0化SacI，2.0μLBamHI，d地20補至50化，混勻，于37°C消 化酶切l(wèi)lh，反應結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，回收目的條帶，獲得帶有SacI和 BamHI位點的AhRESS基因。
[0037] 用限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI對地I121-NtR2-GUSA載體進行酶切，酶切體系如下： 2.0μg質(zhì)粒DNA，5.0化10XKbuffer，2.0μLSacI，2.0化BamHI，d地20補至50化，混勻，于 37°C消化酶切1化，反應結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果。
[003引將AhRESS基因連接至pBI121-NtR2-GUSA載體中，連接反應體系如下：1.0化10X T4ligasebuffer，4.0化基因 DNA片段，4.0化載體DNA片段，1.0化T4DNAligase，混勻，于 16°C過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，菌液涂布于含抗生素 Kan的LB平 板上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14h。
[0039] 挑取單克隆進行菌液PCR檢測，PCR反應體系如下：1.0化模板，2.0化10XPCR buffer，1.5yL 2.5mM dNTP，0.1 化普通Taq酶，0.5化 AhRESS- BamHI-primer-F( 5' TCGTGGATCCGCCACCATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC 3'）， 0.化L AhRESS- -SacI-primer-R(5' TCCTGAGCTCTTATATGGCCACACTGCGGAGAACG 3 '），14.4化(1 地20JCR反應條件為：94°C 5min一 (94°C 30s一69°C 30s一72°C 1.5min)35巧cles一72°C lOmin一4°C保存。對菌液PCR呈陽 性的部分菌液進行擴繁，用堿裂解法提取質(zhì)粒，然后進行酶切單、雙檢測，37°C酶切消化4 h，反應結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果。檢測結(jié)果正確的，送往華大基因進行測序。 測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒即為地I121-NtR2-AhRESS載體。
[0040] 【實施例2】地I121-NtR2-AhRESS載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌 取化g左右(體積小于20μ1)的質(zhì)粒DNA加入到20化L發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，用移液 槍輕輕吹打混勻;冰浴30min，而后于液氮中放置5min，再在42°C恒溫水浴鍋中水浴Imin，重 復3次;接著于冰上放置5min，加入80化L YEB液體培養(yǎng)基，于28°C恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)， 175巧m，化后，300化pm離屯、3min，棄80化1上清，將剩余菌液混勻，涂布于含50mg^ Kan的 YEB平板上，于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到形成單菌落，約48-7化;挑取單克隆于40化1 YEB+ 50mg^的培養(yǎng)基中，220巧m 28°C振蕩培養(yǎng)16 h;，菌液PCR驗證，經(jīng)驗證為陽性克隆的，取 600μ1菌液與60化1 50%甘油（已滅菌)于無菌化pendorf管中混勻，液氮中速凍后保存于-70 °C冰箱。菌液PCR驗證體系如下： PCR反應體系：
PBI121-化R12-AhRESS所用引物為：AhRESS-F(5' ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC3)和 AhRESS-lK5'TTATATGGCCACACTGCGGAGAAC 3'）；PCR反應條件為：94°C 5 min一（94°C 30 S 一57°C 30 s一72°C 1.5 min)35巧cles一72°C 10 min一4°C保存。
[0041] 結(jié)果表明，表達載體質(zhì)粒DM的PCR產(chǎn)物為特異目的條帶，質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)化至發(fā)根 農(nóng)桿菌中，該方法可W實現(xiàn)攜帶外源基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌。
[0042] 【實施例3】本生煙草發(fā)狀根的誘導 (1)本生煙草無菌苗的制備:取本生煙草種子100粒于離屯、管中，用適量的純水在20-25 °C浸泡24 h;10%雙氧水消毒種子10 min,無菌水清洗3次，然后用75%的酒精浸泡45 S，再用 無菌水清洗5次;將消毒后的種子平鋪于MS培養(yǎng)基上，28°C，14 h的日光周期下培養(yǎng)至種子 萌發(fā)約3 cm左右，而后將其移栽至純的固體MS培養(yǎng)基中，28°C，16 h的光周期條件下培養(yǎng)至 長出小苗。
[0043] (2)工程菌的制備:從-80°C超低溫冰箱中取出先前保存的相應重組質(zhì)粒的菌液， 進行劃板(含50 mg/L kan的Y邸平板），挑取單克隆，搖菌，菌液PCR驗證，經(jīng)驗證為陽性克隆 的菌液，取部分菌液進行大量搖菌，一般搖50 mL菌液，250 rpm，28°C過夜培養(yǎng)至0〇6日日=0.5 (注意不能有結(jié)塊產(chǎn)生，或者用時滿旋使呈單細胞狀態(tài)）；取45 mL菌液于50 mL離屯、管中離 屯、，4100 rpm離屯、10 min;倒掉上清液，沉淀重懸于50 mL 1/2 MS基本培養(yǎng)基中，加100 mM 的乙酷下香酬(AS)50 μレ將制備好的工程菌液于4°C膽藏2 h，W供共培養(yǎng)（外植體的侵 染)。
[0044] (3)發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化本生煙草:無菌本生煙草葉盤(0.5 cmXO.5 cm)于MS培 養(yǎng)基預培養(yǎng)2 d后，用工程菌侵染5-10 min,不要超過10 min,吸干菌液，于MS培養(yǎng)基共培養(yǎng) 3 d;然后用500 mg/L的頭抱霉素 (Cef)洗菌，將洗過菌的本生煙草葉片分別轉(zhuǎn)入發(fā)狀根誘 導培養(yǎng)基(MS+500 mg/L Cef+Kan)中進行發(fā)狀根誘導，每一工程菌30片外植體，每瓶5片;每 隔14 d繼代一次，先繼代對照組(未侵染葉片），再繼代處理組，每次繼代用的發(fā)狀根誘導培 養(yǎng)基與繼代前的培養(yǎng)基應一致，同時觀察各組外植體的變化情況。一般在誘導培養(yǎng)7-10天 可長出發(fā)狀根，Ξ周后發(fā)狀根長至2-5 cm,且外植體基本稱綠，周圍還產(chǎn)生大量愈傷組織 (圖 1)。
[004引【實施例4】轉(zhuǎn)地I121-NtR2-AhRESS本生煙草發(fā)狀根液體懸浮培養(yǎng) 本生煙草外植體誘導產(chǎn)生的發(fā)狀根經(jīng)除菌后，可用于液體懸浮培養(yǎng)W及發(fā)狀根樣品的 制備。
[0046] 除菌步驟:本生煙草外植體誘導3周后，取不同部位的長約3-5 cm發(fā)狀根于液體培 養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+500 mg/L Cef)中，每瓶一條根，120巧m，28°C，暗培養(yǎng)1周后，取生長良好的 發(fā)狀根于液體培養(yǎng)基繼代，繼代培養(yǎng)基為MS+300 mg/L Cef，培養(yǎng)1周后，繼代于MS+100 mg/ L Cef，再培養(yǎng)1周后，繼代于MS培養(yǎng)基。Ξ次繼代后頭抱霉素濃度降至0。
[0047] 液體懸浮培養(yǎng):分別取經(jīng)過除菌后遺傳鑒定發(fā)狀根系的3-5條根，接種于液體MS培 養(yǎng)基，28°C，120 rpm，暗培養(yǎng)（圖）；每周繼代一次，接種剩余的發(fā)狀根用濾紙盡量吸干，液氮 速凍后，凍存于-80°C冰箱。
[0048] 【實施例5】轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根基因組PCR鑒定 1.轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根DNA的提取 取轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根lOOmg，在液氮中研磨植物組織成粉末，并轉(zhuǎn)移到在65°C預熱 的盛有抽提液的離屯、管中。在65°C溫育45min，其間不時混勻。用等體積的24:1的氯仿/異戊 醇抽提勻漿，顛倒混勻（溫和）d4°C，lOOOOrpm離屯、5min，回收上清液。在上清液中加入1/10 體積的65°C的CTAB/化cl的溶液，顛倒混勻(溫和）。用等體積的24:1的氯仿/異戊醇抽提勻 漿，顛倒混勻（溫和）。4°0，1000化pm離屯、5min，回收上清液。加入1倍體積的CTAB沉淀液，翻 轉(zhuǎn)混勻，見到沉淀后進行下一步;否則于65°C溫育30min。于4°C，lOOOOrpm離屯、5min。移出上 清，但不要丟棄，用0.5ml高鹽的TE緩沖液重懸沉淀，如果沉淀難于重懸，于65°C溫育30min， 重復至所有的或大部分沉淀溶解。加入0.6倍體積的異丙醇沉淀核酸，充分混勻(溫和），4 °C，10000巧m離屯、15min。用80%乙醇洗沉淀，驚干，并用0.1ml的緩沖液溶解沉淀。最后加入 1/20體積的RNA酶在37°C放化。最后放在-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0049] 2.基因組DNA的PCR檢測 將本生煙草發(fā)狀根提取的DNA稀釋至lOOng/yl，取山1作為模板，依次加入滅菌蒸饋水 14.化1 aOXPCR Bufferll (Mg2+ plus)化1，Taq O.lyl'dNTP Mixture(2.5m)1.50yl， 上下游引物各0.5y 1，引物序列為：AhRESS