下，培養(yǎng)21d，直徑S-Acnumfr^l菌株的最適生長(zhǎng)溫度28°C，最佳PH值10，最佳培養(yǎng)時(shí)間8d，最適培養(yǎng)基為海水PDA培養(yǎng)基。
[0024]3、次生代謝活性物質(zhì)的分離純化
[0025]將篩選出的活性菌株mfn21接種到PDA培養(yǎng)基上純化，挑取單菌落保存于試管中的培養(yǎng)基斜面上。挑取培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)良好的單一菌落接種到液體PDA培養(yǎng)基中，于28°C，120rpm，培養(yǎng)8d。用多層滅菌紗布過(guò)濾，棄去渣滓。用等量于發(fā)酵液體積的乙酸乙酯反復(fù)萃取三次，收集有機(jī)相，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮至浸膏，有機(jī)相濃縮溫度控制在50°C。
[0026]取適量的D101大孔吸附樹脂先用去離子水洗凈，再用無(wú)水乙醇洗至液體不渾濁。濕法上柱，用2%鹽酸洗至中性，再用2%氫氧化鈉洗至流出液呈堿性，去離子水洗至中性，待用。將樣品液上柱，靜態(tài)吸附24小時(shí)。用無(wú)水乙醇梯度洗脫，比例(無(wú)水乙醇/水)分別為1/
9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1、10/0。將上述洗脫液混合置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸餾，得到的物質(zhì)用少量丙酮洗脫收集，室溫蒸發(fā)，作為生物測(cè)定待測(cè)液。用毛細(xì)管滴定法對(duì)煙蚜進(jìn)行生物測(cè)定，對(duì)生測(cè)結(jié)果較好的洗脫液蒸餾所得物用丙酮洗脫液收集，用GC/MS測(cè)定成分。
[0027]GC/MS測(cè)定條件:
[0028]色譜柱:DB-5MS型彈性石英毛細(xì)管柱(30m X 0.25mm X 0.25ym)。初始柱溫50°C，保持2分鐘，以5°C/min升溫至280°C，保持2min ；氣化室溫度250°C ；載氣為高純He (99.999%)；柱前壓為7.62psi，載氣流量為1.0mL/min；進(jìn)樣量lyL；分流比40: 1。
[0029]質(zhì)譜條件:EI源為離子源；離子源溫度230°C;倍增器電壓2047V;接口溫度280°C;溶劑延遲3min;全掃描方式，掃描范圍lOamu?550amu。
[0030]按照上述條件對(duì)濃縮提取物進(jìn)行分離鑒定，通過(guò)HPMSD化學(xué)工作站，結(jié)合NIST98標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)人工檢索，進(jìn)行物質(zhì)鑒定，共檢出41種物質(zhì)，通過(guò)HPMSD化學(xué)工作站，經(jīng)與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)和標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照進(jìn)行物質(zhì)鑒定，共得到7種主要化合物，其中生物堿類化合物2種，酯類化合物2種、糖苷類化合物，肽類化合物、醇類化合物各1種。
[0031 ] 三、擬青霉屬(Paecl1myces.sp)mfn21菌株在煙蚊生物防治中的應(yīng)用
[0032]實(shí)施例1菌株mfn21發(fā)酵上清液對(duì)煙蚜的田間防效實(shí)驗(yàn)
[0033]對(duì)菌株mfn21進(jìn)行大量發(fā)酵培養(yǎng)，8d后收集發(fā)酵液，經(jīng)8層紗布濾去菌體，取發(fā)酵上清液進(jìn)行田間防效實(shí)驗(yàn)。在煙田煙蚜發(fā)生高峰期，用1L噴霧器將發(fā)酵上清液均勻噴霧于煙株上部有蚜葉片正反面。噴霧前調(diào)查蟲口基數(shù)，噴霧后第l，3，7d各調(diào)查一次剩余的活蟲數(shù)量，根據(jù)調(diào)查結(jié)果計(jì)算發(fā)酵上清液第1，3，7d對(duì)煙蚜的校正防效，分別為83.2%,89.6%,8793%。結(jié)果表明菌株mfn21發(fā)酵上清液對(duì)煙蚜有田間防治效果。
[0034]實(shí)施例2菌株mfn21次生代謝活性物質(zhì)對(duì)煙蚜的生物測(cè)定
[0035]對(duì)菌株mfn21進(jìn)行大量發(fā)酵培養(yǎng)，8d后收集發(fā)酵液，經(jīng)8層紗布濾去菌體，等量乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相蒸餾，得到的物質(zhì)用5mL丙酮洗脫轉(zhuǎn)移至5mL離心管中，室溫蒸發(fā)至液面不再下降時(shí)作為生測(cè)液備用。選取帶有10?15頭蚜蟲的煙葉置于培養(yǎng)皿中。用丙酮將待測(cè)液稀釋為 5 個(gè)濃度梯度，分別為 500yL/mL、250yL/mL、125yL/mL、62.5yL/mL、31.25yL/mL，選用0.0776yL的毛細(xì)管微量點(diǎn)滴器，采用點(diǎn)滴法進(jìn)行點(diǎn)滴測(cè)定，設(shè)置丙酮作為對(duì)照，每處理重復(fù)4次，24h后調(diào)查統(tǒng)計(jì)蚜蟲死亡數(shù)量，計(jì)算LC50。
[0036]生物測(cè)定結(jié)果表明菌株mfn21發(fā)酵液提取物對(duì)煙蚜有較高毒性，濃度越高校正死亡率也越高，濃度為500yL/mL時(shí)校正死亡率高達(dá)90.79%。菌株111^121發(fā)酵液提取物對(duì)煙蚜的致死中濃度LC5q為89.70yL/mL，毒力回歸方程為:Y= 1.6655Χ+1.7075 ,R=0.9906，95 %置信限為65.44?116.01。
[0037]上述結(jié)果表明本發(fā)明篩選的mfn21菌株對(duì)于煙蚜具有很好的防治效果，具有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種擬青霉菌株，其特征在于，所述的擬青霉菌株的保藏編號(hào)為CGMCC N0.11659。2.如權(quán)利要求1所述的擬青霉菌株，其特征在于，所述的擬青霉菌株的生長(zhǎng)溫度范圍為25?30°〇。3.如權(quán)利要求2所述的擬青霉菌株，其特征在于，所述的擬青霉菌株的生長(zhǎng)溫度為28?C。4.如權(quán)利要求1所述的擬青霉菌株，其特征在于，所述的擬青霉菌株的最適pH值為10.0o5.如權(quán)利要求1所述的擬青霉菌株，其特征在于，所述的擬青霉菌株的培養(yǎng)用的培養(yǎng)基為PDA海水培養(yǎng)基。6.權(quán)利要求1所述的擬青霉菌株在防治煙蚜中的應(yīng)用。7.權(quán)利要求1所述的擬青霉菌株在制備防治煙蚜的制品中的應(yīng)用。8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的制備為權(quán)利要求1所述的擬青霉菌株的代謝產(chǎn)物。9.權(quán)利要求1所述的擬青霉菌株的代謝產(chǎn)物，其制備方法如下: 1)首先將權(quán)利要求1所述的擬青霉菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)液中培養(yǎng)基去掉，獲得菌體中加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取;將萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后制成浸膏； 2)取D101大孔吸附樹脂，先用去離子水洗凈，再用無(wú)水乙醇洗至液體不渾濁;將處理后的D101大孔吸附樹脂上柱后，用氫氧化鈉洗至中性，再用鹽酸洗至流出液呈酸性，去離子水洗至中性后，將步驟1)制備的浸膏用甲醇溶解后，再用等量去離子水混合，用大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附24h，然后用無(wú)水乙醇梯度洗脫，洗脫液減壓濃縮獲得mfn21菌株的代謝產(chǎn)物。10.權(quán)利要求9所述的代謝產(chǎn)物在防治煙蚜或制備防治煙蚜制品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一株用于防治煙蚜的菌株，其保藏號(hào)為CGMCCNO.11659。本發(fā)明獲得的對(duì)煙蚜有生物活性的mfn21菌株，可應(yīng)用于煙草上煙蚜的防治，采用微量點(diǎn)滴法對(duì)煙蚜的生物測(cè)定表明，其發(fā)酵液中次生代謝物對(duì)煙蚜的致死率最高可達(dá)97.78％。采用GC/MS進(jìn)行化學(xué)分析和結(jié)構(gòu)鑒定后，次生代謝物包括有7種主要化合物，其中生物堿類化合物2種，酯類化合物2種、糖苷類化合物，肽類化合物、醇類化合物各1種。CGMCC NO.1165920151127
【IPC分類】A01P7/04, C12N1/14, A01N63/04, C12R1/79
【公開(kāi)號(hào)】CN105483030
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610038461
【發(fā)明人】王秀芳, 任廣偉, 王鳳龍, 徐蓬軍, 王新偉, 陳丹
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所
【公開(kāi)日】2016年4月13日
【申請(qǐng)日】2016年1月21日