模型對(duì)照組細(xì)胞活性 顯著下降(P〈〇.01)，說明造模成功。各給藥組與模型對(duì)照組比較，均能不同程度的提高細(xì)胞 活性，松茸蟲草發(fā)酵物的高、中劑量組有顯著的統(tǒng)計(jì)差異(P〈〇.01)，說明松茸蟲草發(fā)酵物較 松茸、蟲草和乳酸菌發(fā)酵物而言，對(duì)UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光損傷能夠提高細(xì)胞活性。
[0054]表5各樣品對(duì)HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性的影響
[0056] 注:與正常對(duì)照組比較廣P〈0.01;與模型對(duì)照組比較，#P〈0.05，##P〈0.01
[0057] 試驗(yàn)結(jié)果如表5所示，從試驗(yàn)結(jié)果可知，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng) 液中LDH活性顯著降低(P〈0.01)，說明造模成功。各給藥組與模型對(duì)照組比較，均能不同程 度地降低細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活性，松茸蟲草發(fā)酵物的高、中劑量組有顯著的統(tǒng)計(jì)差異(P〈 〇. 〇 1 )，說明松茸蟲草發(fā)酵物較松茸、蟲草和乳酸菌發(fā)酵物而言，對(duì)UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光 損傷有修復(fù)作用。
[0058] 2、DNCB誘導(dǎo)的小鼠DTH試驗(yàn)
[0059]昆明種小鼠80只，雌性各半，18~22g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，松茸蟲 草液體發(fā)酵物高、中、低劑量組（l〇ml/kg，5ml/kg，2·5ml/kg)，松茸組（10%濃度，5ml/kg)， 蟲草組(10%濃度，5ml/kg)，乳酸菌液體發(fā)酵物組(5ml/kg)，每組10只。用8%硫化鈉酒精溶 液背部、腹部脫毛(2cm X 3cm)，24小時(shí)后，用5%DNCB(0.05ml/只）涂布于小鼠脫毛后的腹部 皮膚致敏，次日強(qiáng)化1次，正常對(duì)照組涂布相同劑量生理鹽水。致敏前1天開始皮膚涂布樣 品，每天1次，連續(xù)7天，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組涂布生理鹽水(5ml/kg)。末次給藥40分鐘 后，用1%DNCB丙酮液(0.02ml/只）涂右耳激發(fā)過敏反應(yīng)，正常對(duì)照組涂布相同劑量生理鹽 水，24小時(shí)后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下雙耳，用8mm打孔器分別在左右耳相同部位打下耳 片，分析天平稱重，以兩耳片重量差為腫脹度，作為遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)強(qiáng)度指標(biāo)。
[0060] 表6各樣品對(duì)DNCB誘導(dǎo)的小鼠DTH的影響
[0062] 注:與正常對(duì)照組比較廣P〈0.01;與模型對(duì)照組比較，#P〈0.05，##P〈0.01。
[0063] 試驗(yàn)結(jié)果如表6所示，從試驗(yàn)結(jié)果可知，造模后模型對(duì)照組耳腫脹度增大，與正常 對(duì)照組比較，差異有顯著性意義(P〈〇.01)，說明造模成功。各給藥組小鼠耳腫脹度與模型對(duì) 照組比較，松茸蟲草發(fā)酵物的高、中劑量組有明顯的統(tǒng)計(jì)差異(P〈〇. 05，Ρ〈0.01 )，說明松茸 蟲草發(fā)酵物較松茸、蟲草和乳酸菌發(fā)酵物而言，對(duì)DNCB所致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)所引 起的耳廓腫脹有顯著的對(duì)抗作用。
[0064] 3、抗氧化能力測(cè)試試驗(yàn)
[0065] 1)抗氧化功效檢測(cè)樣品制備
[0066] 松茸蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)物烘干制干粉，粉碎;松茸粉碎；蟲草粉碎;乳酸菌液體發(fā)酵 物烘干制干粉，粉碎；上述細(xì)粉均過60目篩，取粉末5g溶于100ml水，60°C超聲提取lh后， 3000g離心lOmin，過濾后收集濾液定容為5ml，即濃度為lg/ml，然后稀釋成40-400mg/ml。
[0067] 2)清除·OH自由基能力的測(cè)定
[0068] 在試管中分別加入11111?!1值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液(0.05111〇1/1)，0.411116111111〇1/ L的鄰二氮菲溶液(無水乙醇配制），充分混勾后，加入0.4ml6mmol/LFeS04溶液，加入后立 即混勾。然后向其中加入0.5ml-定濃度的樣品溶液，混勾，再加入0.5ml0.1 %的H2O2，最后 補(bǔ)充體積至4ml，同時(shí)做空白試驗(yàn)。另再做損傷和未損傷管。其中損傷管中加入0.5ml0.1 % 的H2O2，未損傷管不加H2O2，最后補(bǔ)充各體積至4ml。于37°C下保溫lh，測(cè)量536nm下的吸光 度，重復(fù)兩次，計(jì)算平均值。羥自由基清除率zdAVUo-AWlOO%。
[0069] A為不加樣品時(shí)溶液的吸光值，Ao為不加樣和H202時(shí)溶液的吸光值。注意濃度控制， 先試驗(yàn)3-4倍濃度，再逐步稀釋至最適濃度，控制溫度。
[0070] 3)提取物清除DPPH自由基能力的測(cè)定
[0071 ] 取待測(cè)樣品lml和事先用95 %乙醇配好的0.4mg/ml的DPPH自由基試劑lml于10ml 的玻璃試管中。樣品加入后振動(dòng)30s，37°C保溫lOmin后517nm波長下測(cè)定其吸光值(Ai)。同 時(shí)測(cè)定不加DPPH自由基試劑的樣品空白吸光值(Aj)和加DPPH自由基試劑但不加樣品的吸 光值(A〇)，如下表7所示。
[0072] 表7DPPH試驗(yàn)加樣表
[0074] 樣品對(duì)DPPH的清除百分比I= 1 -[ (Ai-Aj)/AO]X100 %。
[0075]試驗(yàn)結(jié)果:通過清除率推算出樣品的EC5Q，結(jié)果如表8所示。
[0076]表8樣品清除·0H、DPPH自由基的EC5Q試驗(yàn)結(jié)果
[0078]試驗(yàn)結(jié)果如表8所示，在清除·0H、DPPH自由基方面，松茸蟲草發(fā)酵物的EC5Q均低于 松茸、蟲草和乳酸菌發(fā)酵物，說明其抗氧化效果好，具有更好的自由基清除能力。
[0079] 4、松茸蟲草發(fā)酵物安全性試驗(yàn)
[0080]采用通行的化妝品原料檢測(cè)中的"急性經(jīng)口和急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)"以及"皮膚和急 性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)"，試驗(yàn)結(jié)果均顯示松茸蟲草發(fā)酵物屬于無毒、無刺激性、無腐蝕性 的化妝品原料，可用于化妝品中。
[0081] 從上述試驗(yàn)結(jié)果可知，松茸蟲草液體發(fā)酵物較未發(fā)酵的松茸、蟲草和單一發(fā)酵的 乳酸菌發(fā)酵物而言，對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的光損傷，能夠提高細(xì)胞活性，具有良好的修復(fù)作 用；能夠降低DNCB誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)，具有更好的抗過敏作用；能夠有效清 除DPPH自由基和羥基自由基，具有良好的抗氧化作用；說明松茸蟲草液體發(fā)酵物具有很強(qiáng) 的曬后修護(hù)、抗過敏、抗衰功效。由松茸蟲草液體發(fā)酵物為原料，可以采用其發(fā)酵物原液或 發(fā)酵物粉，按常規(guī)方法制備的爽膚水、乳液、精華液、面霜、面膜、眼膜等形式的化妝品也應(yīng) 具有明確的曬后修護(hù)、抗過敏、抗衰功效。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 松茸蟲草乳酸菌發(fā)酵物，其特征在于：以松茸、蟲草和水組成培養(yǎng)基，然后接種乳酸 菌發(fā)酵所得的液體發(fā)酵混合物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的松茸蟲草乳酸菌發(fā)酵物，其特征在于：至少滿足以下任意一 項(xiàng)： 培養(yǎng)基中以生藥計(jì)，松茸、蟲草的重量配比為1:9~9:1; 優(yōu)選，培養(yǎng)基中以生藥計(jì)，松茸、蟲草的重量配比為9:1; 松茸、蟲草合計(jì)占液體發(fā)酵混合物的重量百分比為5~20% ; 優(yōu)選，松茸、蟲草合計(jì)占液體發(fā)酵混合物的重量百分比為10 % ; 所述松茸為松茸子實(shí)體； 所述蟲草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體 的干燥復(fù)合體； 乳酸菌的接種量為1 · 0X1〇4~1 · 0X108cfu/ml; 優(yōu)選，乳酸菌的接種量為1.0X106cfu/ml。3. 權(quán)利要求1或2所述松茸蟲草乳酸菌發(fā)酵物的制備方法，其特征在于:包括如下步驟： A、 以松茸、蟲草和水組成培養(yǎng)基， B、 接種乳酸菌； C、 于30°C~40°C和0~200rpm的條件下培養(yǎng)1~5天，即得松茸蟲草液體發(fā)酵物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的松茸蟲草乳酸菌發(fā)酵物的制備方法，其特征在于:至少滿足以 下任意一項(xiàng)： 步驟A培養(yǎng)基中以生藥計(jì)，松茸、蟲草的重量配比為1:9~9:1; 優(yōu)選，步驟A培養(yǎng)基中以生藥計(jì)，松茸、蟲草的重量配比為9:1; 步驟A松茸、蟲草合計(jì)占液體發(fā)酵混合物的重量百分比為5~20% ; 優(yōu)選，步驟A松茸、蟲草合計(jì)占液體發(fā)酵混合物的重量百分比為10 % ; 所述松茸為松茸子實(shí)體； 所述蟲草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體 的干燥復(fù)合體； 步驟B乳酸菌的接種量為1.0X104~1.0X108cfu/ml; 優(yōu)選，步驟B乳酸菌的接種量為1.0X106cfu/ml; 步驟C所述溫度為37°C; 步驟〇所述轉(zhuǎn)速為50rpm; 步驟C培養(yǎng)時(shí)間為5天。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的松茸蟲草乳酸菌發(fā)酵物的制備方法，其特征在于:至少滿足以 下任意一項(xiàng)： 步驟B所述接種采用的乳酸菌為常規(guī)方法培養(yǎng)所得； 進(jìn)一步優(yōu)選，步驟B所述接種采用的乳酸菌是采用如下培養(yǎng)方法制備，將復(fù)蘇后的乳酸 菌接種到乳酸菌液體培養(yǎng)基中，在30°C~40°C和0~200rpm的條件下培養(yǎng)1~5天得到乳酸 菌； 進(jìn)一步優(yōu)選，所述培養(yǎng)條件為:在30°C~40°C和0~200rpm的條件下培養(yǎng)1~3天； 進(jìn)一步優(yōu)選，所述培養(yǎng)條件為:在37°C和50rpm的條件下培養(yǎng)1天； 進(jìn)一步優(yōu)選，所述乳酸菌液體培養(yǎng)基含有乳酸菌常規(guī)發(fā)酵的碳源、氮源、微量元素和/ 或無機(jī)鹽成分； 進(jìn)一步優(yōu)選，所述乳酸菌液體培養(yǎng)基中：碳源成分為液體培養(yǎng)基總重量的0.5%~ 10%，氮源成分為0.5%~3%，微量元素和/或無機(jī)鹽成分為0.01%~1%，其余為水； 進(jìn)一步優(yōu)選，所述乳酸菌液體培養(yǎng)基采用葡萄糖、蔗糖、淀粉、牛肉膏、酵母膏為培養(yǎng)基 組成成分； 進(jìn)一步優(yōu)選，所述乳酸菌液體培養(yǎng)基混合各組分后，滅菌即得； 進(jìn)一步優(yōu)選，所述滅菌的條件為:經(jīng)115~121°C滅菌15~30min。6. 權(quán)利要求1或2松茸蟲草乳酸菌發(fā)酵物或其提取物在制備曬后修護(hù)、抗過敏、抗衰作 用的藥物中或食品中或保健品中或化妝品中的應(yīng)用。7. 化妝品，其特征在于:采用權(quán)利要求1或2松茸蟲草乳酸菌發(fā)酵物或其提取物為活性 成分，加入化妝品上可接受的輔料制備而成的化妝品。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的化妝品，其特征在于:所述化妝品為爽膚水、乳液、精華液、面 霜、面膜、眼膜。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及松茸蟲草乳酸菌發(fā)酵物及其衍生化妝品、制法和用途。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是以“生物轉(zhuǎn)化理論”為指導(dǎo)，采用松茸、蟲草與乳酸菌的液體發(fā)酵體系提供一種具有曬后修護(hù)、抗過敏、抗衰功效的產(chǎn)品。具體的，是以松茸、蟲草和水組成培養(yǎng)基，然后接種乳酸菌發(fā)酵所得的液體發(fā)酵混合物。
【IPC分類】A61Q19/08, A61K8/99, A61Q19/00, C12P39/00
【公開號(hào)】CN105420337
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510939996
【發(fā)明人】羅霞, 江南, 魏巍, 許曉燕, 賀黎明, 余夢(mèng)瑤
【申請(qǐng)人】四川省中醫(yī)藥科學(xué)院
【公開日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2015年12月16日