絲瓜絡(luò)接枝環(huán)糊精在醋酸可的松催化反應(yīng)中的循環(huán)利用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種經(jīng)半纖維素酶處理的絲瓜絡(luò)接枝環(huán) 糊精后在醋酸可的松生物催化中的循環(huán)利用技術(shù)。
【背景技術(shù)】：
[0002] 留體底物的低水溶性使得留體底物與酶的有效接觸非常困難，嚴(yán)重制約著留體轉(zhuǎn) 化反應(yīng)的速度和產(chǎn)率，環(huán)糊精外環(huán)親水，內(nèi)環(huán)親脂的特殊結(jié)構(gòu)使其能作為超分子主體化合 物包結(jié)疏水性底物，從而提高底物的溶解度。環(huán)糊精與客體形成的包結(jié)物能對(duì)微生物具有 較好的生物相容性，這種性質(zhì)推動(dòng)其在醋酸可的松的微生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域得到廣泛的研究。隨 著環(huán)糊精及其衍生物在生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的應(yīng)用，環(huán)糊精在生物轉(zhuǎn)化方面的作用已相當(dāng)明顯， 應(yīng)用也逐漸成熟，逐步走向工業(yè)生產(chǎn)階段。但是，環(huán)糊精的價(jià)格相對(duì)較高限制其在生物催化 技術(shù)中的應(yīng)用。在環(huán)糊精體系中，如何實(shí)現(xiàn)環(huán)糊精介質(zhì)的循環(huán)利用，是環(huán)糊精類介質(zhì)在工業(yè) 應(yīng)用中亟待解決的重要科學(xué)和技術(shù)問(wèn)題。
[0003] 雙金玲等在《纖維素固載β-環(huán)糊精的研究進(jìn)展》（《纖維素科學(xué)與技術(shù)》2007年12 月，15(4))中指出，將環(huán)糊精與高分子機(jī)制連接起來(lái)，形成固化環(huán)糊精材料，既保留了環(huán)糊 精的獨(dú)特性質(zhì)，又具有高分子材料的特征如良好的機(jī)械性能、穩(wěn)定性和化學(xué)可調(diào)性，這給環(huán) 糊精的應(yīng)用提供了更廣闊的空間。而纖維素作為自然界中儲(chǔ)量最豐富的天然高分子具有很 多優(yōu)勢(shì)，將纖維素和環(huán)糊精這兩種環(huán)境友好材料通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ńY(jié)合起來(lái)，制備出特殊性 能的材料，將在環(huán)境保護(hù)、食品、包裝、醫(yī)療、日化等領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。而目前，纖維素固 載環(huán)糊精已經(jīng)在纖維紡織工業(yè)、污水處理、醫(yī)療保健、空氣凈化等方面。
[0004] 中國(guó)專利CN102352557Α公布了一種環(huán)糊精固載醋酸纖維素的方法及應(yīng)用。所述 方法包括以下步驟:a、醋酸纖維素改性整理液的配制;b、浸乳工藝;c、烘培工藝;d、水洗除 雜;e、干燥。利用本方法制備出的環(huán)糊精接枝固載醋酸纖維素可應(yīng)用于卷煙濾嘴材料上，可 降低卷煙主流煙氣中苯及苯系物、揮發(fā)性酚類化合物、多環(huán)芳烴以及重金屬等有害成分，或 提高卷煙醋酸纖維絲束的染色穩(wěn)定性和可染性，或延長(zhǎng)卷煙濾嘴留香以及香氣的緩釋。本 發(fā)明采用檸檬酸作為交聯(lián)劑，首次將環(huán)糊精接枝于醋酸纖維素上，采用的檸檬酸為常用的 食品添加劑，具有更好的安全性;對(duì)于卷煙生產(chǎn)廠家而言，采用具有選擇性減害效果的改性 醋酸纖維濾嘴，不需要另購(gòu)置昂貴的復(fù)合成型機(jī)，可降低成本，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
[0005]絲瓜絡(luò)作為植物載體，不僅可以增加細(xì)胞的穩(wěn)定性，還能保持菌體的活性。其結(jié)構(gòu) 中含有半纖維素、木質(zhì)素和大量的纖維素，不僅價(jià)廉易得，還有增加細(xì)胞穩(wěn)定性、保持菌體 活性的作用。采用生物酶代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)方法，利用半纖維素酶對(duì)絲瓜絡(luò)纖維中的半纖維 素進(jìn)行充分溶解，同時(shí)使纏繞在半纖維素上的木質(zhì)素隨之降解，最終去除木質(zhì)素，使纖維素 纖維呈單纖維分離狀態(tài)暴露于天然絲瓜絡(luò)表面，能充分利用纖維素與環(huán)糊精進(jìn)行接枝，形 成固載環(huán)糊精的高分子材料，這樣既可以保留環(huán)糊精的獨(dú)特性質(zhì)，又具有高分子材料的特 性，如良好的機(jī)械性能、化學(xué)可調(diào)性和穩(wěn)定性。這給環(huán)糊精的應(yīng)用提供了更廣闊的空間。
[0006]但是目前關(guān)于以絲瓜絡(luò)作為載體，以纖維素固載環(huán)糊精的形式作為促溶劑運(yùn)用于 難溶化合物的生物轉(zhuǎn)化，并對(duì)環(huán)糊精進(jìn)行循環(huán)利用的技術(shù)尚未可見(jiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 本發(fā)明提供一種醋酸可的松生物催化中環(huán)糊精介質(zhì)的循環(huán)利用方法，具體如下： 在醋酸可的松的生物催化體系中，以接枝絲瓜絡(luò)的環(huán)糊精為促溶劑，所述絲瓜絡(luò)預(yù)先經(jīng)半 纖維素酶酶解，反應(yīng)結(jié)束后，將接枝環(huán)糊精的絲瓜絡(luò)取出，使用緩沖液洗滌絲瓜絡(luò)2-5次，50 °C_80°C烘干后重新用于醋酸可的松的生物催化，從而實(shí)現(xiàn)環(huán)糊精介質(zhì)的循環(huán)利用，；
[0008] 所述半纖維素酶酶解的方法具體如下：
[0009] 取市售絲瓜絡(luò)，每克絲瓜絡(luò)加水50mL，半纖維素酶的用量為0.01-0.20g/mL，調(diào)節(jié) pH為5-7,30-90°C條件下水浴震蕩反應(yīng)l_5h后，抽濾烘干，稱重備用;所述接枝環(huán)糊精的絲 瓜絡(luò)可在不補(bǔ)加環(huán)糊精的條件下循環(huán)使用6次以上；
[0010]所述緩沖液為磷酸鹽緩沖溶液，PH7.2;
[0011] 所述緩沖液的用量為每次每克絲瓜絡(luò)60-100ml;
[0012] 所述接枝絲瓜絡(luò)的環(huán)糊精的制備方法如下：
[0013] (1)環(huán)氧化:將半纖維素酶酶解后的絲瓜絡(luò)置于蒸餾水中，并按絲瓜絡(luò)干重與環(huán)氧 氯丙烷按重量比為1:6-1: 20加入環(huán)氧氯丙烷、以及絲瓜絡(luò)干重2倍的10m〇l/LNaOH溶液進(jìn) 行環(huán)氧化，在45-60°C下反應(yīng)3-6h;
[0014] (2)接枝:將環(huán)氧化絲瓜絡(luò)先后用蒸餾水和丙酮清洗、烘干后投入到其重量40-70 倍的濃度為l〇mol/L的氫氧化鈉溶液中，再加入環(huán)氧化絲瓜絡(luò)干重0.9-2.0倍的環(huán)糊精，在 40-60°C下進(jìn)行接枝反應(yīng)3-6h;
[0015] (3)洗滌:反應(yīng)完畢后用蒸餾水洗滌絲瓜絡(luò)至洗出液為中性，烘干即得接枝絲瓜絡(luò) 的環(huán)糊精；
[0016] 所述的環(huán)糊精為α-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、甲基-β-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊 精、羥丙基-β_環(huán)糊精、羥乙基-β_環(huán)糊精、磺丁基-β_環(huán)糊精、磺酸基-β_環(huán)糊精等水溶性的 環(huán)糊精。
[0017] 有益效果：
[0018] (1)本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)環(huán)糊精介質(zhì)循環(huán)利用，在循環(huán)8次后底物醋酸可的松轉(zhuǎn)化率仍 可以達(dá)到90%以上，達(dá)到提高留體等醋酸可的松催化反應(yīng)效率的同時(shí)降低生產(chǎn)成本的目 的，具有很好的應(yīng)用價(jià)值和推廣前景；
[0019] (2)本發(fā)明所提供的技術(shù)能夠提高環(huán)糊精的接枝率由0.0629g/g絲瓜絡(luò)增至 0.356g/g絲瓜絡(luò)；
[0020] (3)本發(fā)明所述的環(huán)糊精循環(huán)利用工藝方法簡(jiǎn)單便捷，便于實(shí)現(xiàn)，成本節(jié)約。
【具體實(shí)施方式】：
[0021] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0022] 實(shí)施例1:化合物醋酸可的松的C1>2位脫氫反應(yīng)
[0023] 微生物菌種采用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌ArthrobactersimplexTCCC11037,它能實(shí)現(xiàn)甾體 化合物的Cu位脫氫轉(zhuǎn)化，將醋酸可的松(CA)轉(zhuǎn)化為醋酸潑尼松；
[0024]斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,酵母膏10,瓊脂20，pH7.2
[0025] 種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,玉米漿10,蛋白胨5,磷酸氫二鉀2.5，pH7.2
[0026] 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,玉米漿15,蛋白胨5,磷酸氫二鉀2.5，pH7.2
[0027] 簡(jiǎn)單節(jié)桿菌菌體制備：
[0028] 微生物在32°C，160r/min，30/250mL裝量條件下活化培養(yǎng)18h，取活化種子以1: 20 比例在裝量為30/250mL條件下培養(yǎng)20h，將發(fā)酵培養(yǎng)獲得的細(xì)胞5000r/min離心后用pH7.2 的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三遍，重懸于pH7.2的roS緩沖液中的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌靜息細(xì)胞菌懸 液；
[0029] 半纖維素酶處理絲瓜絡(luò)：
[0030] 稱取lg市售絲瓜絡(luò)，加入50mL水，半纖維素酶用量為0.20g/mL，pH為5.0，在40°C恒 溫水浴震蕩器震蕩反應(yīng)5h后，用循環(huán)水式多用真空栗進(jìn)行抽濾，最后在80°C的烘箱內(nèi)烘干， 稱重。
[0031] 環(huán)糊精與絲瓜絡(luò)的接枝：
[0032] 稱取lg用酶處理后的絲瓜絡(luò)，放入250ml錐形瓶中，加入40ml蒸餾水，加入與絲瓜 絡(luò)重量比1:20的環(huán)氧氯丙烷，再加入與絲瓜絡(luò)重量比1: 2的10mol/LNaOH溶液，45°C恒溫反 應(yīng)3h，反應(yīng)完畢后取出，水洗至不含環(huán)氧氯丙烷為止，再用丙酮清洗兩遍，50°C烘干備用;將 制備的環(huán)氧化絲瓜絡(luò)，放入1 〇mo1/L的NaOH與β-環(huán)糊精的混合溶液中，環(huán)氧化絲瓜絡(luò)與NaOH 的質(zhì)量比為1:40，環(huán)氧化絲瓜絡(luò)與β-環(huán)糊精的質(zhì)量比為1:1.3，放入恒溫水浴鍋中，40°C振 蕩反應(yīng)3h。停止震蕩，并向燒杯中加入適量蒸餾水洗滌，抽濾至洗出液為中性，50°C烘干備 用;結(jié)果表明酶處理每克絲瓜絡(luò)接枝β-環(huán)糊精的量由0.0629克增至0.356克；
[0033] 生物轉(zhuǎn)化：
[0034] 取3mL靜息細(xì)胞菌懸液，加入17mL的PBS(pH7.2)和0.06g的CA于100mL三角瓶中， 再加入0.3g上述接枝環(huán)糊精的絲瓜絡(luò)(接枝的β-環(huán)糊精量為0.076g)，對(duì)照組加入沒(méi)有接枝 絲瓜絡(luò)的環(huán)糊精0. 〇76g，34°C、180r/min轉(zhuǎn)化8h，HPLC法測(cè)定底物